Combibe testi kasutamine HIV diagnoosimisel. HIV-nakkuse diagnoosimise kaasaegsed meetodid Video: Moskva Riikliku Ülikooli õppefilm

Patendi RU 2283497 omanikud:

Leiutis käsitleb biotehnoloogia ja meditsiini valdkonda. Ensüümiga seotud immunosorbenttestisüsteem inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) antikehade spektri tuvastamiseks esimest ja teist tüüpi, esimest tüüpi O rühma ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse esimest tüüpi p24 antigeeni tuvastamiseks sisaldab immunosorbent, mis põhineb inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel, mis esindavad gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), HIV antigeeni 1 antikehi p24 ja tuvastamisreagente, ülaltoodud HIV-antigeene ja HIV-antikehi, mis on sorbeeritud plaatide erinevatesse süvenditesse ensüümseotud immunosorbentanalüüsi jaoks, ning 96-süvendiga polüstüreenist kokkupandavaid või mitteeraldatavaid plaate kasutatakse sorptsiooniks. Leiutis pakub tulemuste hindamisel suuremat tundlikkust, lihtsustamist ja subjektiivsuse kõrvaldamist. 1 palk toimikud, 10 tabelit, 1 ill.

Leiutis käsitleb biotehnoloogia ja meditsiini valdkonda. Kasutamine: inimese immuunpuudulikkuse viiruse valkude 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeeni kõikide klasside spetsiifiliste antikehade diferentseeritud tuvastamine.

Põhiolemus: ensüümiga seotud immunosorbenttestisüsteemi saamine kõigi klasside antikehade spektri tuvastamiseks üksikute valkude ja HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide suhtes vereseerumis (plasmas), immunoglobuliinides ja inimese veretoodetes. HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O antikehade spektri tuvastamiseks, HIV 1 p24 antigeeni tuvastamiseks ning HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide antikehade positiivsete või küsitavate sõeluuringute tulemuste kinnitamiseks.

LEIUTISE KIRJELDUS

HIV-nakkuse laboratoorne diagnostika põhineb kolmel valdkonnal: a) HIV ja selle komponentide indikatsioon; b) HIV-vastaste antikehade tuvastamine; c) immuunsüsteemi muutuste määramine. Olemasolevate laboratoorsete diagnostikameetodite hulgas on kõige levinumad seroloogilised - viiruse antigeenide antikehade tuvastamine.

HIV-nakkuse antikehade tuvastamiseks kasutatakse peamiselt ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) ja immunoblotanalüüsi (IB). ELISA põhineb viiruse antigeenide immobiliseerimisel plaatidel, millega patsiendi antikehad seonduvad, ning antigeeni-antikeha kompleksi tuvastamiseks kasutatakse mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud hiire monoklonaalseid antikehi inimese immunoglobuliinide G ja M vastu. Meetod on üsna spetsiifiline ja tundlik ning võimaldab tuvastada viirusspetsiifilisi antikehi 95% patsientidest. Ülejäänud 5% juhtudest esinevad infektsiooni varases staadiumis, kui vereseerumis on veel vähe antikehi, või haiguse lõppfaasis, kui organism ei suuda enam antikehi sünteesida järsu vereseerumis ammendumise tõttu. immuunsüsteem. Võimalikud on ka valepositiivsed ELISA tulemused, peamiselt autoimmuun- ja onkoloogiliste haigustega patsientidel, samuti Eshptain-Barri viiruse põhjustatud infektsiooni korral. Sel juhul on antikehade ristreaktsioon reumatoidfaktori, Epstein-Barri viiruse või antigeensete determinantide suhtes, mis on sarnased peamise histo-sobivuskompleksi klassi 1 ja 2 (HLA-4 ja DQW3) kuuluvate valkudega ja millel on võime seonduda HIV-antigeenidega. esineb. Valepositiivseid tulemusi esineb sageli rasedatel ja eakatel. Hemolüüs, lipeemia ja seerumi bakteriaalne saastumine võivad samuti põhjustada ebausaldusväärseid tulemusi.

Sellega seoses on antikehade tuvastamise tulemuste spetsiifilisuse testimiseks välja pakutud ja kasutatud mitmeid meetodeid. Nendest meetoditest on kõige sagedamini kasutatav reaktsioon "immuunbloteerimine" modifikatsioonis "Western Blot". Meetodi olemus on järgmine: esimeses etapis eraldatakse HIV-valgud molekulmassi järgi polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil. Seejärel viiakse polüakrüülamiidgeelilt läbi elektroforeetiline ülekanne nitrotselluloosmembraani pinnale. Sel viisil ülekantud antigeenid tuvastatakse membraanil kaudse analüüsi abil: membraani inkubeeritakse uuritava materjaliga; sisalduvad antikehad seonduvad nitrotselluloosmembraanile üle kantud HIV antigeenidega, seejärel inkubeeritakse membraaniribasid konjugaadiga; Kui moodustub antigeen-antikeha kompleks, kinnitub konjugaat sellele pärast konjugaadist pesemist ja substraadiga inkubeerimist, toimub värvumine nendes nitrotselluloosi piirkondades, kus antigeen-antikeha-konjugaadi kompleks tekkis. Joonisel on näiteid positiivsete, nõrgalt positiivsete ja negatiivsete immunobloti tulemuste kohta.

HIV-1 ja HIV-2-ga nakatunud inimeste seerumis tuvastatakse antikehad järgmiste valkude (p) ja glükoproteiinide (gp) vastu: tabel A.

Tabelis B on toodud WHO ja Venemaa AIDSi ennetamise ja tõrje keskuse soovitatud immunoblotanalüüsi tulemuste hindamise kriteeriumid.

WHO kriteeriumide alusel loetakse positiivseks seerumid, milles IB-meetodil tuvastatakse antikehad mis tahes kahe HIV-1 ümbrise valgu vastu. Kui toimub reaktsioon ainult ühe ümbrisvalguga (gp160, gp120, gp41) kombinatsioonis teiste valkudega või ilma reaktsioonita, peetakse tulemust kaheldavaks. Venemaa Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi AIDSi ennetamise ja tõrje föderaalse teadus- ja metoodikakeskuse andmetel on seerumit võimalik positiivseks tõlgendada isegi ainult ühe membraanivalgu vastaste antikehade olemasolul.

Antigeeni p24 vastaste antikehade tuvastamine võib näidata serokonversiooni alguse perioodi, kuna selle valgu vastased antikehad ilmuvad esimesena. Positiivsed reaktsioonid gag- ja pol-valkudega ilma reaktsioonita env-valkudega võivad kajastada varase serokonversiooni staadiumit ja samuti näidata HIV-2 infektsiooni või mittespetsiifilise reaktsiooni olemasolu.

Immunoblot-reaktsiooni kasutamisel HIV diagnoosimise ekspertmeetodina on mitmeid olulisi puudusi:

1. HIV p24 antigeeni 1 tuvastamise kinnitamise võimatus juhul, kui kasutatakse teste, mis tuvastavad samaaegselt nii antigeeni kui ka HIV-vastaseid antikehi, mistõttu on sobimatu (mõttetu) sõeltestide kasutamine HIV-antigeeni ja antikehade samaaegseks tuvastamiseks ( Vene Föderatsiooni Tervishoiuministeeriumi 30. juuli 2001. a korraldus nr 292: "vereülekandejaamades doonorite uurimiseks on vaja kasutada testimissüsteeme, mis tuvastavad samaaegselt nii antigeeni kui ka HIV-vastaseid antikehi").

2. Ainult IgG klassi antikehade tuvastamine. 3. ja 4. põlvkonna testidega (IgG ja IgM antikehade tuvastamine) saadud positiivseid tulemusi on võimatu täielikult kinnitada.

3. Subjektiivsus testi hinnangu tõlgendamisel, eriti "kahtlaste" ja "ebakindlate" tulemuste korral ning serokonversiooni algfaasis (sel juhul on nitrotselluloosmembraanidel tuvastatud ribad ebaselged, palja silmaga vaevu nähtavad, ja erinevate isikute hinnangul esineb sageli lahkarvamusi).

4. Analüüsitulemuste automatiseeritud kvantitatiivse hindamise võimatus.

5. Madalam tundlikkus võrreldes ELISA-ga.

6. Lühike säilivusaeg (säilitamise ajal tuhmuvad nitrotselluloosmembraani ribad ja see ei saa olla objektiivne kinnitus HIV-i tuvastamisele või mitteavastamisele vastuolulistel juhtudel).

7. Raskused reaktsiooni seadistamisel ja säilitamisel (nitrotselluloosmembraani ribad on väga haprad ja purunevad sageli).

8. Infoturbekomplektide kõrge hind.

Tuntud reaktiiv on komplekt sama patogeeni, sealhulgas HIV, antigeenide ja antikehade samaaegseks määramiseks (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Testsüsteemi, mis võimaldab diagnoosida HIV-nakkust erinevates etappides, aga ei avalikustata.

Käesoleva leiutise eesmärgiks on saada testimissüsteem, mille abil on võimalik kinnitada HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide antikehade skriiningtestide positiivseid või küsitavaid tulemusi, kui kasutatakse samaaegseks tuvastamiseks vajalikke teste. antigeenidest ja antikehadest.

Kavandatav tehniline lahendus on saavutatud ensüümiga seotud immunosorbenttestisüsteemiga inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) esimest ja teist tüüpi, esimest tüüpi O rühma antikehade spektri tuvastamiseks ja inimese immuunpuudulikkuse antigeeni p24 tuvastamiseks. esimest tüüpi p24 viirus, mida iseloomustab see, et see sisaldab inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel põhinevat immunosorbenti, mis esindab gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), HIV 1 antigeeni p24 vastased antikehad ja tuvastamisreagendid, samas kui ülalmainitud HIV antigeenid ja HIV antikehad adsorbeeritakse ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi plaatide erinevatesse süvenditesse.

Lisaks kasutatakse sorptsiooniks 96 süvendiga polüstüreenist kokkupandavaid või mittelahutatavaid plaate ensüümi immuunanalüüsi jaoks.

Käesoleva leiutisega saavutatud tehniline tulemus on HIV 1 ja 2, HIV 1 rühma O ja HIV 1 p24 antigeenide antikehade positiivsete tulemuste kinnitamise võimalus, kõrge tundlikkus, tulemuste automaatse tõlgendamise võimalus, mis välistab uuringu subjektiivsuse. hindamine, testi sooritamise lihtsus, vähem kui olemasolevate kuluinfoturbekomplektidega.

See tehniline lahendus erineb teadaolevatest:

1. Plaadi kasutamine immunoloogiliste reaktsioonide jaoks tahke faasi kandjana.

2. HIV p 24 vastaste antikehade ja HIV antigeenide komplekti samaaegne kasutamine sorbendina.

Leiutist illustreerib järgmine näide.

Väljatöötatud testimissüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" aktiivsed põhimõtted on:

Immunosorbent – ​​HIV-1 struktuurvalkudele sarnased rekombinantsed antigeenid: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) ja hiire monoklonaalsed antikehad HIV 1(p24) antigeeni vastu, adsorbeeritud eraldi polüstüreenist kokkupandava plaadi ribadele.

Immunosorbendi kasutamise ettevalmistamiseks:

1. HIV-1 gp41 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 109.

3. HIV-1 p24 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 105.

4. HIV-1 p31 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 108.

5. HIV-2 p36 on valk, mida toodab E. Coli tüvi nr AHIV 106.

Konjugaat 1, lüofiliseeritud või vedel, on hiire monoklonaalne antikeha HIV1 p24 antigeeni vastu, mis on konjugeeritud biotiiniga.

1. Konjugaat 2, lüofiliseeritud või vedel, on segu rekombinantsetest antigeenidest, mis on sarnased HIV-1 struktuurvalkudele: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), konjugeeritud biotiiniga;

2. Konjugaadid 3, 4 - lüofiliseeritud või vedel - mädarõika peroksüdaasiga märgistatud streptavidiin;

Eeluuringute käigus valiti välja testsüsteemi disain, töötati välja selle komponentide valmistamise tehnoloogia ning optimeeriti ensüümi immuunanalüüsi reaktsiooni läbiviimise tingimused.

ELISA läbiviimisel testsüsteemis "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1" lisatakse plaadi süvenditesse p24 sorbeeritud antikehadega 25 μl konjugaati-1 ja 25 μl. konjugaat-1 lisatakse süvenditesse koos sorbeeritud antigeenidega 25 µl konjugaati-2. Reaktsiooniskeem on näidatud allpool. Järgmisena lisatakse igasse süvendisse 25 μl uuritavat proovi. Samal ajal muutub antigeenidega süvendite värvus oranžist roosaks ja antikehadega süvendis rohelisest halliks. Segu inkubeeritakse 45 minutit temperatuuril 37 °C loksutil (või 1 tund temperatuuril 37 °C termostaadis). Seejärel lisage ilma pesemata plaadi süvenditesse p24 antigeeni määramiseks 50 μl konjugaati-3 ja antikehade määramiseks 50 μl konjugaati-4. Pärast 20-minutilist inkubeerimist 37 °C juures loksutil (või 30 minutit 37 °C juures termostaadis) plaati pestakse ja arendatakse substraadiseguga. Reaktsiooni koguaeg 1 tund 25 minutit (või 1 tund 50 minutit). Uuritavas proovis sisalduv p24 antigeen seondub p24 vastaste monoklonaalsete antikehadega ja spetsiifilised antikehad moodustavad plaadil rekombinantsete antigeenidega kompleksi. Saadud anti-p24 immuunkompleks p24-ga tuvastatakse anti-p24-biotiini konjugaatidega, seejärel streptavidiin-peroksidaasiga ja Ag-HIV immuunkompleksid At-HIV-ga tuvastatakse Ag-biotiini konjugaadiga, seejärel streptavidiiniga. peroksidaas.

Reaktsiooni seadistamise skeem.

Tulemusi võetakse spektrofotomeetriliselt arvesse kahel lainepikkusel: 450/620-680 nm, kui seade on konfigureeritud õhu kaudu. Arvestagem tulemusi ühel lainepikkusel 450 nm.

Analüüsi tulemusi võetakse arvesse, kui optilise tiheduse (OD) keskmised väärtused K- süvendites ei ole suuremad kui 0,2, K+ süvendites - mitte vähem kui 1,0. OP kriitik. arvutatakse valemiga:

OP kriitik. gp41 = keskm. tähenduses OP K-(gp41)+0,15

OP kriitik. gp120 = keskm. tähenduses OP K-(gp120)+0,15

OP kriitik. p24 = keskm. tähenduses OP K-(р24)+0,15

OP kriitik. p31 = keskm. tähenduses OP K-(31)+0,15

OP kriitik. gp36 = keskm. tähenduses OP K-(gp36)+0,15

OP kriitik. Ag p24 = keskm. tähenduses OP k- (Ag p24)+0,04

kus 0,15 ja 0,04 on tootja juures statistilise töötlemisega kehtestatud koefitsiendid. Testisüsteemi väljatöötamisel kasutati järgmist:

1. Tervete doonorite vereseerumi proovid (n=610).

2. Erinevate HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega (ägedad hingamisteede infektsioonid, kopsupõletik, tonsilliit, herpeetiline ja tsütomegaloviirusnakkus, süüfilis, klamüüdia, viirushepatiit A, B ja C (n=224)) patsientide vereseerumiproovid.

3. Vereseerumi proovid erinevate mittenakkushaigustega patsientidelt - traumad, kardiovaskulaarsüsteemi haigused, onkoloogia (n=35).

4. Rasedate naiste vereseerumi proovid (n=40).

5. ELISA-s seropositiivsed ja immunoblotis kinnitatud vereseerumi proovid (n=428).

6. Seerumiproovid, mis on saadud positiivse tulemusega ensüümi immuunanalüüsi testsüsteemides HIV 1.2 antikehade ja p24 antigeeni samaaegseks määramiseks ning immunoblotiga määramatu tulemusega (n=123).

7. Seerumite sisemine paneel, mis sisaldab ja ei sisalda HIV 1,2 antikehi, testitud ensüümi immuunanalüüsi testisüsteemidega ja immunoblotiga, mille on registreerinud Vene Föderatsiooni tervishoiuministeerium (n=21).

8. Standard "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Prantsusmaa, kat. 72217, mis on viiruslüsaadist saadud antigeen.

9. Ettevõtte sisestandard. Proov, mis sisaldab p 24 antigeeni kontsentratsioonis 200 pg/ml, mis on saadud viiruslüsaadist ja tiitritud vastavalt "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" firmale "BIO RAD", Prantsusmaa, kat. nr 72217.

10. Inimese immuunpuudulikkuse viiruse tüüp 1 (HIV 1) antikehi sisaldavate seerumite standardpaneel - OSO 42-28-212-93-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

11. Inimese immuunpuudulikkuse viiruse tüüp 2 (HIV 2) antikehi sisaldavate seerumite standardpaneel - OSO-42-28-216-02P, "Medical and Biological Union", Novosibirsk.

12. Standardne seerumite paneel, mis ei sisalda 1. ja 2. tüüpi inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV 1, 2) antikehi - OSO-42-28-214-94-02P, "Meditsiiniline ja bioloogiline liit", Novosibirsk.

Testsüsteemi tundlikkust p24 antigeeni tuvastamiseks hinnati "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD" ja ettevõtte sisestandardi abil. Sisestandardit kasutades valmistati 4 2-kordset seerialahjendust 40 pg/ml kuni 5 pg/ml lahjendina normaalse doonori plasmaga, mis ei sisaldanud HIV-antikehi 1, 2. Tundlikkuse kriteeriumiks võeti väikseim tuvastatava antigeeni kogus. Saadud andmed on toodud tabelis 1.

Testimissüsteemi tundlikkuse hindamiseks spetsiifiliste antikehade tuvastamisel kasutati standardseid proovipaneele, mis sisaldasid inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV 1, 2) antikehi (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-). 28-216- 02P (HIV 2) lk.003).

Saadud andmed on toodud tabelites 3, 4.

Testisüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" diagnostilist efektiivsust võrreldi testsüsteemidega "Jenskrin-HIV-Ag/At" (Bio-Rad), "DIA-HIV". 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard) ), "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Sel eesmärgil testiti sisepaneelilt võetud seerumiproove kõigis määratud testides. Tabelis 5 esitatud tulemused näitavad “DS-ELISA-HIV-VASTANE 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” kõrget diagnostilist efektiivsust.

Testsüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" tundlikkuse uuringud viidi läbi ka patsientide vereseerumitega, kelle immunoblotanalüüs oli HIV-positiivne. Kokku testiti 428 selliste seerumite proovi. HIV erinevate valkude ja p24 antigeeni vastaste antikehade tuvastamiseks on leitud mitu võimalust. Tulemused on toodud tabelis 6.

HIV 1 positiivsete proovide testimisel ilmnes 3% seerumitest positiivne reaktsioon gp36-ga (HIV 2 env). OP/OPcrit. nendes proovides ei ületanud 2,0. Meie andmed HIV 1 (gp41) ja HIV 2 (gp36) väliskesta valkude ristreaktiivsuse kohta langevad kokku kirjanduse andmetega.

Tulemuste tõlgendamine

"DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" HIV-positiivsete seerumite ning standard- ja sisepaneelide proovide testimise analüüs võimaldas meil välja töötada kriteeriumid selle testi tulemuste tõlgendamiseks. Soovitatavad kriteeriumid on toodud tabelis 7.

Nende kriteeriumide alusel leiti, et kõik HIV-positiivsete seerumite proovid (n=428) olid positiivsed testis “DS-ELISA-HIV-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1”. HIV 1 antikehi sisaldava standardpaneeli 16 proovist 14 olid positiivsed ja 2 määramata. Kõik 8 proovi standardpaneelist, mis sisaldasid HIV 2 antikehi, olid positiivsed. HIV-vastaseid antikehi sisaldava sisemise paneeli 10 proovist 1 osutus positiivseks ja 3 määramatuks.

Testsüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" tundlikkuse uuringud viidi läbi ka patsientide vereseerumitega, kellel oli positiivne tulemus ensüümiga seotud immunosorbenttestisüsteemides, mis samaaegselt tuvastavad antikehi ja p24 antigeen ja immunoblotis määramatu. Kokku testiti 123 sellist proovi. Andmed on esitatud tabelis 8.

Määramatu immunobloti tulemusega (n=123) seerumite testimisel uuringus “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” andis 72 proovi (58,5%) positiivset tulemust. Neist 26 seerumit (21,1%) olid positiivsed ainult p24 suhtes, 20 (16,3%) - ainult antikehade suhtes, 16 (13%) - p24 suhtes koos ühe valgu vastaste antikehadega, 10 (8,1%) - p24-ga koos. antikehad kahe või enama valgu vastu. Seega tuvastaks ainult antikehade testimine (ilma p24 tuvastamata) 30 proovi (24,4%) positiivsetena. P24 antigeeni tuvastamine testis võimaldas identifitseerida positiivseks veel 42 proovi (34,1%).

Katsesüsteemi spetsiifilisuse hindamiseks kasutati standardset seerumite paneeli, mis ei sisaldanud HIV 1, 2 antikehi (n=20); vereseerumi proovid tervetelt doonoritelt (n=610), vereseerumi proovid erinevatelt HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega patsientidelt (n=224); vereseerumi proovid erinevate mittenakkushaigustega patsientidelt - traumad, kardiovaskulaarsüsteemi haigused, onkoloogia (n=35); rasedate naiste vereseerumi proovid (n=40). Kokku testiti 929 proovi. Tervete doonorite vereseerumite üks proov näitas valepositiivset tulemust – tuvastati gp41 ja p24 vastased antikehad. 7 tervete doonorite vereseerumi proovi ja 2 HIV-ga mitteseotud nakkushaigustega patsientide vereseerumi proovi näitasid p24 valepositiivset tulemust.

Katsesüsteemi spetsiifilisuse hindamiseks kasutati standardset negatiivsete proovide paneeli (OSO 42-28-214-94-02p, lk 009). Spetsiifilisus oli 100%.

Seega on uuringud näidanud, et normaalsete doonorite ning erinevate nakkus- ja somaatiliste haigustega patsientide vereseerumiproovide uurimisel on testisüsteemi “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” spetsiifilisus 99%. .

Saadud andmed näitavad väljatöötatud testisüsteemi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" kõrget diagnostilist efektiivsust. Testisüsteemi saab kasutada antikehade tuvastamiseks HIV 1. ja 2. tüüpi üksikute valkude ja HIV1 p24 antigeeni vastu, et kinnitada positiivne sõeluuringu tulemus antikehi tuvastavate testisüsteemidega või testsüsteemidega, mis tuvastavad samaaegselt antikehi ja HIV1 p24 antigeeni. Testimissüsteemi saab kasutada alternatiivina immunoblot testile positiivsete tulemuste kinnitamiseks, samuti HIV antikehade ja p24 antigeeni dünaamika uurimiseks infektsiooni erinevates staadiumides.

TESTI EELISED

1. Kinnitav ensüümi immuunanalüüsi test tableti kujul

2. Kinnitav test, mis ühendab HIV 1, 2 antikehade spektri ja HIV 1 p24 antigeeni määramise

3. Kõigi Ig klasside antikehade tuvastamine

4. Tundlikkus p24 tuvastamiseks on vähemalt 5 pg/ml

5. Vähendab määramatuid tulemusi võrreldes immunoblotimisega

6. Analüüsi aeg - 1 tund 25 minutit (immunoblot - 3 kuni 20 tundi)

7. Kõikide komponentide ja näidiste lisamise visuaalne hindamine.

1. Ensüümiga seotud immunosorbenttestisüsteem inimese immuunpuudulikkuse viiruse (HIV) esimest ja teist tüüpi antikehade spektri tuvastamiseks, O rühma esimese tüübi ja inimese immuunpuudulikkuse viiruse esimese tüübi antigeeni p24 tuvastamiseks p24, mida iseloomustab see, et see sisaldab immunosorbenti, mis põhineb inimese immuunpuudulikkuse viiruse antigeenidel, mis esindavad gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 rühm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV). -2), HIV 1 antigeeni p24 vastased antikehad ja tuvastamisreaktiivid, samas kui ülalmainitud HIV antigeenid ja HIV antikehad sorbeeritakse plaatide erinevatesse süvenditesse ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi jaoks.

2. Ensüüm-immunoanalüüsi testsüsteem vastavalt nõudluspunktile 1, mida iseloomustab see, et sorptsiooniks kasutatakse 96-süvendiga polüstüreenist kokkupandavaid või mitteeraldatavaid plaate ensüümi immuunanalüüsi jaoks.

HIV-nakkuse õigeaegne diagnoosimine muutub äärmiselt oluliseks meetmeks, kuna õigeaegne ravi alustamine võib suuresti määrata haiguse edasise arengu ja pikendada patsiendi eluiga. Viimastel aastatel on selle kohutava haiguse tuvastamisel tehtud märkimisväärseid edusamme: vanemad testimissüsteemid asendatakse arenenumatega, uurimismeetodid muutuvad kättesaadavamaks ja nende täpsus suureneb oluliselt.

Selles artiklis räägime kaasaegsetest HIV-nakkuse diagnoosimise meetoditest, mille tundmine on kasulik selle probleemi õigeaegseks raviks ja patsiendi normaalse elukvaliteedi säilitamiseks.

HIV diagnostika meetodid

Venemaal viiakse HIV-nakkuse diagnoosimiseks läbi standardprotseduur, mis hõlmab kahte taset:

• ELISA testisüsteem (sõelanalüüs);
• immunoblotanalüüs (IB).

Diagnoosimiseks võib kasutada ka muid meetodeid:

• kiirtestid.

ELISA testisüsteemid

Diagnoosimise esimeses etapis kasutatakse HIV-nakkuse tuvastamiseks skriiningtesti (ELISA), mis põhineb laborites loodud HIV-valkudel, mis püüavad kinni infektsioonile vastuseks organismis toodetud spetsiifilised antikehad. Pärast nende interaktsiooni katsesüsteemi reagentidega (ensüümidega) muutub indikaatori värvus. Järgmisena töödeldakse neid värvimuutusi spetsiaalse varustuse abil, mis määrab tehtud analüüsi tulemuse.

Sellised ELISA testid võivad anda tulemusi mõne nädala jooksul pärast HIV-nakkuse sissetoomist. See test ei määra viiruse olemasolu, vaid tuvastab selle vastaste antikehade tekke. Mõnikord algab HIV-vastaste antikehade tootmine inimkehas 2 nädalat pärast nakatumist, kuid enamikul inimestel tekivad need hiljem, 3-6 nädala pärast.

Erineva tundlikkusega ELISA teste on neli põlvkonda. Viimastel aastatel on üha enam kasutatud kolmanda ja neljanda põlvkonna testsüsteeme, mis põhinevad sünteetilistel peptiididel või rekombinantsetel valkudel ning on suurema spetsiifilisuse ja täpsusega. Neid saab kasutada HIV-nakkuse diagnoosimiseks, HIV levimuse jälgimiseks ja ohutuse tagamiseks annetatud vere testimisel. III ja IV põlvkonna ELISA testisüsteemide täpsus on 93-99% (Lääne-Euroopas toodetud testid on tundlikumad - 99%).

ELISA testi tegemiseks võetakse patsiendi veenist 5 ml verd. Viimase söögikorra ja analüüsi vahele peab jääma vähemalt 8 tundi (tavaliselt tehakse seda hommikul tühja kõhuga). Selline test on soovitatav teha mitte varem kui 3 nädalat pärast kahtlustatavat nakatumist (näiteks pärast kaitsmata seksuaalvahekorda uue seksuaalpartneriga).

ELISA testi tulemused saadakse 2-10 päevaga:

• negatiivne tulemus: näitab HIV-nakkuse puudumist ja ei nõua spetsialisti poole pöördumist;
• valenegatiivne tulemus: võib täheldada infektsiooni varases staadiumis (kuni 3 nädalat), AIDSi hilisemates staadiumides koos immuunsüsteemi tugeva pärssimisega ja vere vale ettevalmistamisega;
• valepositiivne tulemus: võib täheldada mõne haiguse ja vale vere ettevalmistamise korral;
• positiivne tulemus: viitab HIV-nakkusele, nõuab IB läbiviimist ja patsiendi pöördumist AIDS-i keskuse spetsialisti poole.

Miks võib ELISA test anda valepositiivseid tulemusi?

Valepositiivsed HIV ELISA testi tulemused võivad ilmneda vale veretöötluse tõttu või patsientidel, kellel on järgmised seisundid ja haigused:

• hulgimüeloom;
• Epstein-Barri viiruse põhjustatud nakkushaigused;
• olek pärast ;
• autoimmuunhaigused;
• raseduse taustal;
• seisund pärast vaktsineerimist.

Ülalkirjeldatud põhjustel võib veres esineda mittespetsiifilisi ristreageerivaid antikehi, mille tootmist ei kutsunud esile HIV-nakkus.

Viimastel aastatel on valepositiivsete tulemuste sagedus oluliselt vähenenud tänu III ja IV põlvkonna testisüsteemide kasutamisele, mis sisaldavad tundlikumaid peptiid- ja rekombinantseid valke (need sünteesitakse in vitro geenitehnoloogia abil). Pärast selliste ELISA testide kasutuselevõttu vähenes valepositiivsete tulemuste sagedus oluliselt ja on umbes 0,02-0,5%.

Valepositiivne tulemus ei tähenda, et inimene on HIV-nakkusega. Sellistel juhtudel soovitab WHO teha veel ühe ELISA testi (tingimata IV põlvkonna).

Patsiendi veri saadetakse referent- või arbitraažilaborisse tähisega "korda" ja testitakse IV põlvkonna ELISA testisüsteemiga. Kui uue analüüsi tulemus on negatiivne, loetakse esimene tulemus ekslikuks (valepositiivseks) ja IS-i ei teostata. Kui teise testi käigus on tulemus positiivne või küsitav, peab patsient HIV-nakkuse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks läbima IB 4-6 nädala pärast.

Immuunbloteerimine

HIV-nakkuse lõplikku diagnoosi saab teha alles pärast positiivse immunoblotanalüüsi (IB) tulemuse saamist. Selle läbiviimiseks kasutatakse nitrotselluloosi riba, millele kantakse viirusvalgud.

IB vereproovid võetakse veenist. Järgmisena läbib see spetsiaalse töötluse ja selle seerumis sisalduvad valgud eraldatakse spetsiaalses geelis vastavalt nende laengule ja molekulmassile (manipuleerimine toimub spetsiaalse varustuse abil elektrivälja mõjul). Vereseerumi geelile kantakse nitrotselluloosriba ja spetsiaalses kambris tehakse blotimine (“bloteerimine”). Riba töödeldakse ja kui kasutatud materjalid sisaldavad HIV-vastaseid antikehi, seostuvad need IB-l olevate antigeensete ribadega ja ilmuvad joontena.

IB loetakse positiivseks, kui:

• Ameerika CDC kriteeriumide järgi - ribal on kaks või kolm rida gp41, p24, gp120/gp160;
• Ameerika FDA kriteeriumide kohaselt on ribal kaks rida p24, p31 ja rida gp41 või gp120/gp160.

99,9% juhtudest viitab positiivne IB tulemus HIV-nakkusele.

Kui ridu pole, on IB negatiivne.

Ridade tuvastamisel gr160, gr120 ja gr41 on IB kahtlane. See tulemus võib ilmneda, kui:

• onkoloogilised haigused;
• Rasedus;
• sagedased vereülekanded.

Sellistel juhtudel on soovitatav testi korrata, kasutades teise ettevõtte komplekti. Kui pärast täiendavat IB-d jääb tulemus kahtlane, on vaatlus vajalik kuue kuu jooksul (IB viiakse läbi iga 3 kuu järel).

Polümeraasi ahelreaktsioon

PCR-testiga saab tuvastada viiruse RNA. Selle tundlikkus on üsna kõrge ja see võimaldab tuvastada HIV-nakkuse 10 päeva jooksul pärast nakatumist. Mõnel juhul võib PCR anda valepositiivseid tulemusi, kuna selle kõrge tundlikkus võib reageerida ka teiste infektsioonide antikehadele.

See diagnostikameetod on kallis ja nõuab spetsiaalset varustust ja kõrgelt kvalifitseeritud spetsialiste. Need põhjused ei võimalda populatsiooni massilist testimist läbi viia.

PCR-i kasutatakse järgmistel juhtudel:

• HIV avastamiseks vastsündinutel, kes on sündinud HIV-nakkusega emadelt;
• HIV tuvastamiseks “aknaperioodil” või kahtlase IB korral;
• kontrollida HIV kontsentratsiooni veres;
• doonorivere uurimiseks.

PCR-test üksi ei pane HIV-i diagnoosi, vaid seda tehakse täiendava diagnostilise meetodina vastuoluliste olukordade lahendamiseks.

Ekspressmeetodid

HIV diagnostika üheks uuenduseks on kiirtestid, mille tulemusi saab hinnata 10-15 minuti jooksul. Kõige tõhusamad ja täpsemad tulemused saadakse kapillaaride voolu põhimõttel põhinevate immunokromatograafiliste testide abil. Need on spetsiaalsed ribad, millele kantakse verd või muid uuritavaid vedelikke (sülg, uriin). Kui HIV-vastased antikehad on olemas, ilmub 10-15 minuti pärast testile värviline kontrollriba - positiivne tulemus. Kui tulemus on negatiivne, kuvatakse ainult kontrollriba.

Nagu ELISA testide puhul, tuleb ka kiirtestide tulemusi kinnitada IB analüüsiga. Alles pärast seda saab määrata HIV-nakkuse diagnoosi.

Saadaval on koduseks kiirtestimiseks mõeldud komplektid. OraSure Technologies1 test (USA) on FDA heaks kiidetud, saadaval käsimüügis ja seda saab kasutada HIV tuvastamiseks. Pärast testi, kui tulemus on positiivne, soovitatakse patsiendil diagnoosi kinnitamiseks läbida uuring spetsialiseeritud keskuses.

Teisi koduseks kasutamiseks mõeldud teste pole FDA veel heaks kiitnud ja nende tulemused võivad olla väga küsitavad.

Hoolimata asjaolust, et kiirtestid on IV põlvkonna ELISA testidest madalama täpsusega, kasutatakse neid laialdaselt elanikkonna täiendavaks testimiseks.

HIV-nakkuse tuvastamiseks saate teste teha igas kliinikus, keskhaiglas või spetsialiseeritud AIDS-i keskuses. Venemaa territooriumil viiakse need läbi täiesti konfidentsiaalselt või anonüümselt. Iga patsient võib enne või pärast testi saada meditsiinilist või psühholoogilist konsultatsiooni. HIV-testide eest tuleb maksta ainult kaubanduslikes meditsiiniasutustes, riiklikes kliinikutes ja haiglates tehakse neid tasuta.

Lugege, kuidas saate HIV-iga nakatuda ja millised müüdid levivad nakatumisvõimaluste kohta.

Kirjeldus

Ettevalmistus

Näidustused

Tulemuste tõlgendamine

Kirjeldus

Määramise meetod Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA).

Uuritav materjal Vere seerum

Võimalik kodukülastus

HIV 1. ja 2. tüüpi antikehade ja HIV p24 antigeeni kombineeritud tuvastamine, kvalitatiivne test.

Tähelepanu. Positiivsete ja küsitavate reaktsioonide korral võib tulemuste väljastamise tähtaega pikendada 10 tööpäevani. HIV (inimese immuunpuudulikkuse viirus), mis põhjustab AIDS-i (omandatud immuunpuudulikkuse sündroom), kuulub retroviiruste perekonda. See kandub inimeselt inimesele läbi saastunud nõelte ja süstalde kasutamise intravenoosseks ravimite manustamiseks või raviprotseduurideks, seksuaalkontakti ajal, nii hetero- kui ka homoseksuaalselt. Viiruse edasikandumine võib toimuda nakatunud vere ja selle saaduste ülekande, elundite või seemnevedeliku annetamise ning meditsiinitöötajate seas saastunud nõelte või instrumentide vigastuste kaudu. HIV-nakkus on võimalik nakatunud emalt lapsele edastamise teel (vertikaalne tee), kuigi kaasaegsed retroviirusevastase ravi ennetusmeetodid võivad kõigi soovituste järgimise korral selle riski vähendada miinimumini.

Viiruse ja raku interaktsiooni protsess hõlmab mitmeid etappe: viiruse seondumine rakuga, selle ümbrisest vabastamine, tungimine tsütoplasmasse, DNA süntees viiruse RNA abil, viiruse DNA integreerimine raku genoomi. peremeesrakk. Pärast seda algab nakkuse varjatud staadium. Selles olekus võib proviiruse DNA eksisteerida mõnda aega ilma aktiivsust näitamata ja peremeesraku eluiga mõjutamata. Kuigi viirusvalkude ekspressioon puudub, puudub viirusele immuunvastus. HIV-vastased antikehad, mis iseloomustavad organismi immuunvastust, tekivad pärast viiruse DNA aktiveerumist ja viiruse aktiivse paljunemise algust. Varjatud perioodi kestus sõltub paljudest teguritest, sealhulgas organismi individuaalsetest geneetilistest omadustest.

HIV-vastased antikehad võivad ilmneda alates teisest nädalast pärast nakatumist; nende sisaldus suureneb 2-4 nädala jooksul ja püsib paljudeks aastateks. 90–95% nakatunud inimestest ilmnevad need esimese kolme kuu jooksul pärast nakatumist, 5–9% -l - kolme kuni kuue kuu jooksul, 0,5-1% -l - hiljem.

Nakatumise esimestel nädalatel, isegi enne viirusevastaste antikehade ilmnemist (st enne serokonversiooni), võib seerumi- või plasmaproovides tuvastada HIV-antigeenide, sealhulgas selle p24 kapsiidivalgu olemasolu. Hiljem, pärast serokonversiooni, muutub see tavaliselt tuvastamatuks.

4. põlvkonna kombineeritud testisüsteemid, mis sisaldavad HIV Ag/Ab Combo testi (Architect, Abbott), tuvastavad nii HIV 1. ja 2. tüüpi antikehi kui ka HIV p24 antigeeni, mis võimaldab infektsiooni varakult avastada. INVITRO laboris HIV-nakkuse tuvastamiseks kasutatava skriiningtesti eripärade hulka kuulub uuringu kõrge spetsiifilisus (> 99,5%); Analüüs on 100% tundlik serokonversiooni perioodile iseloomulike antikehade suhtes ja testi tundlikkus p24 antigeeni suhtes on umbes 18 pg/ml.

HIV-i laboratoorsete uuringute läbiviimise kord on rangelt reguleeritud Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi korraldustega ja see hõlmab HIV-vastaste antikehade olemasolu skriiningu (selektsiooni) uuringu etappi, kasutades ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA). kasutamiseks heakskiidetud meetodid ning kontrollimise (kinnituse) etapi täpsem uuring linna AIDSi keskuse laboris. Tuleb märkida, et isegi parimad ELISA-sõeluuringusüsteemid ei taga 100% spetsiifilisust, see tähendab, et on teatud tõenäosus saada mittespetsiifilisi valepositiivseid tulemusi, mis on seotud patsiendi vereseerumi omadustega. Seetõttu ei pruugi sõeluuringu ELISA-uuringu positiivne tulemus kinnitustestides kinnitust saada, misjärel antakse patsiendile negatiivne või ebamäärane tulemus. Kui kinnitava uuringu tulemus on ebakindel, tuleks testimist aja jooksul korrata 2-3 nädala pärast.

HIV-nakkuse laboratoorsel diagnoosimisel HIV-nakkusega emadel sündinud lastel on oma eripärad. Ema HIV-vastased antikehad (IgG klass) võivad nende veres ringelda kuni 18 kuud alates sünnihetkest. HIV-vastaste antikehade puudumine vastsündinutel ei tähenda, et viirus ei oleks läbinud platsentaarbarjääri. HIV-nakkusega emade lastele tehakse laboratoorsed diagnostilised uuringud 36 kuu jooksul pärast sündi.

Ettevalmistus

Erilist ettevalmistust pole vaja. Soovitatav on verd võtta mitte varem kui 4 tundi pärast viimast söögikorda. Üldised soovitused uuringuteks valmistumiseks leiate. HIV-vastaste antigeenide ja antikehade tuvastamise test on soovitatav läbi viia mitte varem kui kaks nädalat pärast võimalikku nakatumist, negatiivse tulemuse korral korrata testi kolme ja kuue nädala pärast. INVITRO LLC-s uurimistöö taotluste täitmisel kasutatakse passi või seda asendavat dokumenti (migratsioonikaart, ajutine registreerimine elukohas, sõjaväelase ID, passiameti tõend passi kaotamise korral, registreerimiskaart hotell). Esitatud dokument peab tingimata sisaldama teavet ajutise või alalise registreerimise kohta Vene Föderatsioonis ja fotot. Passi (seda asendava dokumendi) puudumisel on patsiendil õigus täita anonüümne avaldus biomaterjali annetamiseks. Anonüümse läbivaatuse, kliendilt saadud avalduse ja biomaterjali näidise käigus määratakse number, mis on teada ainult patsiendile ja tellimuse esitanud meditsiinipersonalile. ! Anonüümselt läbiviidud uuringute tulemusi ei saa esitada haiglaravile, kutseeksamile ja need ei kuulu ORUIB-s registreerimisele.

Näidustused kasutamiseks

• Suurenenud lümfisõlmed rohkem kui kahes piirkonnas.
• Leukopeenia koos lümfopeeniaga.
• Öine higistamine.
• Teadmata põhjusega järsk kaalulangus.
• Kõhulahtisus rohkem kui kolm nädalat teadmata põhjusega.
• Teadmata põhjusega palavik.
• Raseduse planeerimine.
• Operatsioonieelne ettevalmistus, haiglaravi.
• Järgmiste infektsioonide või nende kombinatsioonide tuvastamine: tuberkuloos, manifestne toksoplasmoos, sageli korduv herpesviirusnakkus, siseorganite kandidoos, korduv vöötohatis neuralgia, mükoplasmade, pneumotsüstiidi või legionella põhjustatud kopsupõletik.
• Kaposi sarkoom noores eas.
• Juhuslikud seksuaalkontaktid.

Tulemuste tõlgendamine

Uurimistulemuste tõlgendamine sisaldab teavet raviarsti jaoks ega ole diagnoos. Selles jaotises olevat teavet ei saa kasutada enesediagnostikaks ja -raviks. Täpse diagnoosi paneb arst, kasutades nii selle uuringu tulemusi kui ka muudest allikatest saadavat vajalikku infot: haiguslugu, teiste uuringute tulemusi jne.

Mõõtühikud sõltumatus laboris INVITRO: kvalitatiivne test. Tulemuste esitamise vorm: HIV 1 ja 2 ning p24 antigeenide vastaste antikehade puudumisel on vastus "negatiivne". Kui skriiningensüümiga seotud immunosorbenttestis tuvastatakse HIV-vastased antikehad või antigeen, saadetakse seerumiproov immunoblotanalüüsiga kinnitamiseks linna AIDS-i keskusesse, mis kontrollib positiivseid ja ebamääraseid tulemusi.

Positiivne tulemus:

1. HIV-nakkus;
2. valepositiivne tulemus, mis nõuab korduvaid või täiendavaid uuringuid *);
3. uuring ei ole informatiivne alla 18 kuu vanuste laste puhul, kes on sündinud HIV-nakkusega emadelt.

*Sõeluuringusüsteemi Antikehad HIV 1 ja 2 ning HIV antigeenide 1 ja 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott) spetsiifilisus on reaktiivi tootja hinnangul umbes 99,6% nii üldpopulatsioonis kui ka potentsiaalsete häiretega patsientide rühma (infektsioonid HBV, HCV, punetised, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, Chl. trach. jne, autoimmuunpatoloogiad (sh reumatoidartriit, tuumavastaste antikehade olemasolu) , rasedus, IgG, IgM kõrgenenud tase, monoklonaalsed gammopaatiad, hemodialüüs, mitmekordne vereülekanne).

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) astus praktilise meditsiini ellu kuskil eelmise sajandi 60ndatel. Selle lähteülesandeks oli teaduslikel eesmärkidel tehtud histoloogiline uurimine, mis taandus elusorganismi rakkude antigeense struktuuri otsimisele ja tuvastamisele.

ELISA meetod põhineb spetsiifiliste (AT) ja seotud antigeenide (AG) interaktsioonil "antigeen-antikeha" kompleksi moodustumisega, mis tuvastatakse ensüümi abil. See asjaolu ajendas teadlasi mõtlema, et meetodit saab kasutada diagnostilistel eesmärkidel, et tuvastada eri klassidesse kuuluvad spetsiifilised immunoglobuliinid, mis on seotud immuunvastusega konkreetsele infektsioonile. Ja see oli läbimurre kliinilises laboratoorses diagnostikas!

Meetodit hakati aktiivselt kasutama alles 80ndate alguses ja seejärel peamiselt spetsialiseeritud asutustes. Esimesed immunoensüümanalüsaatorid olid varustatud vereülekandekeskuste ja -jaamadega, nakkushaiguste ja venereoloogiahaiglatega, kuna Aafrika mandril sündinud hirmuäratav AIDS ilmus meie silmapiirile ja liitus kohe "vanade" nakkustega, nõudis viivitamatuid diagnostilisi meetmeid ja otsingut. teda mõjutavate terapeutiliste ravimite eest.

ELISA meetodi rakendusala

Ensüümi immuunanalüüsi võimalused on tõeliselt ulatuslikud. Nüüd on raske ette kujutada, kuidas saab hakkama ilma selliste uuringuteta, mida kasutatakse sõna otseses mõttes kõigis meditsiiniharudes. Näib, mida saab ELISA onkoloogias teha? Tuleb välja, et saab. Ja palju. Analüüsi võime leida teatud tüüpi pahaloomulistele kasvajatele iseloomulikke markereid on kasvaja varajase avastamise aluseks, kui seda oma väiksuse tõttu veel muul viisil ei tuvastata.

Kaasaegne kliiniline laboratoorne diagnostika (CDL) omab lisaks kasvajamarkeritele märkimisväärset ELISA paneelide arsenali ja kasutab neid erinevate patoloogiliste seisundite (nakkusprotsessid, hormonaalsed häired) diagnoosimiseks ja farmaatsiaravimite jälgimiseks, et tuvastada nende mõju patsiendi organismile. ja muide mitte ainult inimene. Praegu kasutatakse ensüümimmuunanalüüsi veterinaarteenistustes laialdaselt, sest ka “meie väikesed vennad” on vastuvõtlikud paljudele haigustele, mida nad mõnikord väga kannatavad.

Seega ELISA suudab oma tundlikkuse ja spetsiifilisuse tõttu veenist võetud vereproovist määrata:

• Hormonaalne seisund (kilpnäärme ja neerupealiste hormoonid, suguhormoonid);
• Viiruslike ja bakteriaalsete infektsioonide esinemine (HIV, B ja C, klamüüdia, süüfilis ja paljud muud patogeensete mikroorganismide põhjustatud haigused);
• Jäljed mikroorganismide elutegevusest, mis algatasid nakkusprotsessi, mis lõppes edukalt ja liikus selle patogeeni suhtes immuunvastuse moodustumise staadiumisse. Sellised jäljed ehk antikehad jäävad paljudel juhtudel verre ringlema kogu eluks, kaitstes seeläbi inimest uuesti nakatumise eest.

Mis on ELISA olemus?

Ensüümi immuunanalüüsi meetod võimaldab määrata mitte ainult patogeeni enda olemasolu (kvalitatiivne analüüs), vaid ka selle kvantitatiivset sisaldust patsiendi vereseerumis.

Viiruse või bakteri doos mõjutab oluliselt nakkusprotsessi kulgu ja selle tulemust, seetõttu on kvantitatiivsel analüüsil oluline roll erinevates vormides ja staadiumides esinevate haiguste diagnoosimisel ja ravil.

Teades aga ensüümi immuunanalüüsi uuringuid kui ELISA meetodit, ei mõtle me isegi sellele, kuidas see suudab katta nii suure hulga meie planeedil elavaid mikroorganisme, millest paljud kujutavad otsest ohtu inimeste ja loomade tervisele ja elule. Kuid fakt on see, et ELISA-l on palju võimalusi (mittekonkureerivad ja konkureerivad - otsesed ja kaudsed), millest igaüks lahendab oma probleemi ja võimaldab seega sihipärast otsingut.

Ühe või teise klassi immunoglobuliinide tuvastamiseks kasutatakse traditsioonilist 96 süvendiga polüstüreenpaneeli (plaati), mille süvendites on tahkes faasis kontsentreeritud sorbeeritud rekombinantsed valgud. Vereseerumiga süvendisse sattunud antikehad või antigeenid leiavad “tuttava” objekti ja moodustavad sellega kompleksi (AG - AT), mis ensüümi konjugaadiga fikseerituna avaldub süvendi värvuse muutumises, kui tulemuste lugemine.

Ensüüm-immunoanalüüs viiakse läbi teatud spetsiifilisusega testimissüsteemide abil, mis on toodetud spetsiaalsetes laborites ja varustatud kõigi vajalike reageerivate komponentidega. Uuringuid saab teha pesumasinate (“seibide”) ja lugemisspektrofotomeetrite abil, mis hõlmavad enamasti käsitsitööd. Täisautomaatsetel masinatel, mis vabastavad laborandi monotoonsest tilgutamisest, pesemisest ja muudest rutiinsetest ülesannetest, on loomulikult kiirem ja mugavam töötada, kuid mitte kõik laborid ei saa endale sellist luksust lubada ja jätkata tööd vanaviisi - edasi poolautomaatsed masinad.

ELISA tulemuste tõlgendamine on laboridiagnostika arsti pädevuses ning arvesse tuleb võtta ka peaaegu kõikidele immunokeemilistele reaktsioonidele omast omadust anda valepositiivseid või valenegatiivseid vastuseid.

Video: kaasaegne ensüümi immuunanalüüs

ELISA tulemused süüfilise näitel

Ensüüm-immunoanalüüs sobib kõikide vormide tuvastamiseks, ja lisaks kasutatakse seda sõeluuringutes. Analüüsi läbiviimiseks kasutatakse patsiendi veeniverd tühja kõhuga. Töös kasutatakse kindla spetsiifilisusega tablette (AB klassid A, M, G) või totaalseid antikehi.

Arvestades, et süüfilise antikehad toodetakse kindlas järjestuses, saab ELISA abil hõlpsalt vastata küsimusele, millal infektsioon toimus ja millises etapis protsess on, ning saadud tulemuste tõlgenduse saab esitada järgmisel kujul:

• IgM näitab nakkusprotsessi kestust (võib ilmneda krooniliste põletikuliste haiguste ägenemise ajal);
• IgA märgib, et nakatumine toimus rohkem kui kuu aega tagasi;
• IgG näitab, et infektsioon on täies hoos või on hiljuti läbi viidud ravi, mis on anamneesi põhjal kergesti kindlaks määratud.

Süüfilise testimisel jäävad negatiivsed süvendid (ja negatiivne kontroll) värvituks, samas kui positiivsed süvendid (ja positiivne kontroll) näitavad testi ajal lisatud kromogeeni värvimuutuse tõttu erekollast värvi. Kuid värvi intensiivsus ei lange alati kokku kontrolliga, see tähendab, et see võib olla veidi kahvatum või kergelt kollakas. Need on kahtlased tulemused, mida reeglina tuleb uuesti läbi vaadata, võttes kohustuslikult arvesse spektrofotomeetril saadud kvantitatiivseid näitajaid, kuid üldiselt on värvus otseselt võrdeline immuunkomplekside (seotud Ag-d ja AT-d) arvuga. .

Ensüümi immuunanalüüsidest põnevaim - HIV ELISA

Analüüs on paljudele elanikkonnarühmadele ehk teistest huvitavam, sest ei saa veel kindlalt väita, et paljud sotsiaalsed probleemid on kadunud (prostitutsioon, narkomaania jne). Kahjuks ei mõjuta HIV mitte ainult neid inimühiskonna osi, vaid võite nakatuda erinevatel asjaoludel, mis ei ole seotud seksuaalse ebamoraalsuse või uimastitarbimisega. Aga kui on vajadus HIV-testi järele, siis ei tasu karta, et kõik ümberkaudsed teavad sinu külastusest sellisesse laborisse. Nüüd on HIV-nakatunud isikud seadusega kaitstud ning kahtlused võivad pöörduda anonüümsetesse kontoritesse, kus saab probleemi lahendada, kartmata avalikustamist ja hukkamõistu.

HIV-nakkuse diagnoosimiseks kasutatav ensüümi immuunanalüüsi meetod on üks olulisemaid standarduuringuid, mis aga nõuab eritingimusi, kuna teema on väga delikaatne.

HIV ELISA on mõttekas teha pärast seksuaalset kontakti, vereülekannet, muid nakatumisele viitavaid meditsiinilisi protseduure ja inkubatsiooniperioodi lõpus (nn seronegatiivne aken), kuid tuleb meeles pidada, et see ajavahemik ei ole konstantne. See võib lõppeda 14–30 päeva pärast või võib kesta kuni kuus kuud, seega loetakse keskmiseks väärtuseks intervall 45–90 päeva. HIV-i puhul loovutatakse verd samamoodi nagu teiste infektsioonide puhul – veenist tühja kõhuga. Tulemused valmivad sõltuvalt materjali kogunemisest laborisse ja töökoormusest (2 kuni 10 päeva), kuigi enamasti annavad laborid vastuse samal või järgmisel päeval.

Mida võite oma HIV-i tulemustelt oodata?

HIV-nakkuse ELISA abil tuvastatakse kahe viiruse tüübi antikehad: HIV-1 (sagedamini Venemaal ning teistes Euroopa ja Aasia riikides) ja HIV-2 (sagedamini Lääne-Aafrikas).

HIV ELISA ülesandeks on otsida G-klassi antikehi, mis tuvastatakse kõigis testimissüsteemides, kuid hilisemal perioodil, ning klassi A ja M antikehi, mis tuvastatakse uue põlvkonna rekombinantsete testide komplektidel, mis võimaldavad leida antikehi. kõige varasemates staadiumides (inkubatsiooniperiood - "seronegatiivne aken"). ELISA-lt võite oodata järgmisi vastuseid:

1. Esmane positiivne tulemus: verd tuleb uuesti analüüsida sama tüüpi, kuid võimalusel erineva seeria testisüsteemiga ja teise isiku poolt (laborant);
2. Korduv (+) hõlmab patsiendilt uut verevõttu, mille uuring sarnaneb esmase analüüsiga;
3. Teine positiivne tulemus kuulub võrdlusanalüüsile, mis kasutab väga spetsiifilisi testikomplekte (2-3 tk.);
4. Mõlema (või kolme) süsteemi positiivne tulemus saadetakse immunoblotanalüüsile (sama ELISA, kuid tehakse individuaalselt, kasutades eriti kõrge spetsiifilisusega testikomplekte).

Järeldus HIV-nakkuse kohta tehakse ainult immunoblotanalüüsi põhjal. Vestlus nakatunud inimesega toimub täielikus konfidentsiaalsuses. Meditsiinisaladuste avaldamine Venemaal ja ka teistes riikides on kriminaalkorras karistatav.

Erilist populaarsust on saavutanud ka klamüüdia ja tsütomegaloviiruse testid ensüümimmuunanalüüsi meetodil, kuna need võimaldavad määrata nakatumise aega, haiguse staadiumi ja ravimeetmete tõhusust.

Rakendamise ajal võib jälgida ka erinevate klasside antikehade ilmumist. nakkustekitaja poolt põhjustatud patoloogilise seisundi erinevates faasides:

• IgM-i saab tuvastada juba seitse päeva pärast nakatumist;
• IgA näitab, et infektsioon on kehas elanud rohkem kui kuu aega;
• IgG kinnitab klamüüdia diagnoosi ja aitab jälgida ravi ning määrata selle tõhusust. Tuleb märkida, et G-klassi antikehad jäävad ja ringlevad kehas olenemata haiguse kestusest, seetõttu tuleb analüüsi õigeks tõlgendamiseks võtta arvesse kontrollväärtusi (norme), mis muide. , on iga CDL-i puhul erinevad: võttes arvesse testimissüsteemi kaubamärki ja komplekti kuuluvate reaktiivide spetsiifilisust. Normaalväärtused sisestatakse ELISA tulemuse kõrval olevasse vormi.

Mis puutub, siis siin on see veidi erinev: M-klassi antikehad ilmnevad umbes kuu kuni pooleteise kuu pärast, see tähendab, et positiivne tulemus (IgM+) muutub primaarse infektsiooni faasis või latentse infektsiooni taasaktiveerumisel ja jääb selliseks 4 kuud kuni kuus kuud.

G-klassi antikehade esinemine on iseloomulik esmase ägeda infektsiooni või taasinfektsiooni tekkele. Analüüs väidab, et viirus on olemas, kuid ei anna teavet selle kohta, millises staadiumis nakkusprotsess on. Samal ajal tekitab raskusi ka normaalse IgG tiitri määramine, kuna see sõltub täielikult konkreetse inimese immuunstaatusest, mis aga tehakse kindlaks G-klassi immunoglobuliinide tuvastamisega. Arvestades antikehade sellist käitumist, on CMV diagnoosimisel vajadus hinnata klassi G antikehade võimet interakteeruda CMV-ga, et seda hiljem “neutraliseerida” (AT aviidsus). Haiguse algstaadiumis seondub IgG väga halvasti viiruse antigeenidega (madal aviidsus) ja alles siis hakkab aktiivsust näitama, seetõttu võime rääkida antikehade aviidsuse suurenemisest.

Ensüüm-immunoanalüüsi eelistest võime palju rääkida, sest selle meetodiga on õnnestunud lahendada palju diagnostilisi probleeme, kasutades ainult venoosset verd. Pole vaja pikki ootamisi, muresid ja probleeme uurimistöö materjali kogumisega. Lisaks jätkatakse ELISA testisüsteemide täiustamist ja enam pole kaugel päev, mil test annab 100% usaldusväärse tulemuse.

Video: Moskva Riikliku Meditsiiniülikooli õppefilm. Sechenov ELISA põhitõdedest