Immuuniblottaus HIV:n diagnosoinnissa. Immunoblottaus (vasta-aineiden havaitseminen potilaiden seerumeista tiettyjä patogeeniantigeenejä vastaan) Nukleiinihappojen hybridisaatio

Entsyymi-immunomääritys (ELISA)

Entsyymi-immunomääritys (ELISA) suoritetaan kahdessa vaiheessa: ensimmäinen on vasta-aineiden vuorovaikutus antigeenin kanssa, toinen on antigeeni-vasta-ainekompleksin entsymaattinen indikaatio, joka johtuu reaktioseoksen värjäytymisestä ja värjäytymisen rekisteröinnistä visuaalisesti tai spektrofotometrisellä menetelmällä.

ELISA:sta on kaksi muunnelmaa: kiinteäfaasi ja nestefaasi, jotka eroavat tavasta, jolla immunokemiallisen reaktion komponentit erotetaan toisistaan. Verrattuna aiemmin kuvattuihin antigeenien ja vasta-aineiden havaitsemismenetelmiin, ELISA:lla on merkittäviä etuja:

korkea herkkyys, jonka avulla voidaan määrittää jopa 0,05 ng / ml ainetta;

mahdollisuus käyttää mahdollisimman pieniä määriä testimateriaalia (1--2 µl);

reaktion instrumentaalisen tai visuaalisen kirjanpidon mahdollisuus;

nopeus ja mahdollisuus automatisoida reaktion kaikki vaiheet.

ELISAa käytetään nykyään laajalti käytännössä monien bakteeri-, sienitautien, alkueläininfektioiden ja helmintiaasien, mutta erityisesti virusinfektioiden, erityisesti hepatiitti A, B, C, D, E, G, HIV-infektion, herpesviruksen, rotavirus, adenovirus, astrovirus, parvovirus ja muut infektiot.

immuuniblottaus

Immuuniblottausmenetelmän periaate on havaita vasta-aineet patogeenin yksittäisille antigeeneille. Tällä menetelmällä määritetään vasta-aineet HIV-antigeeneille (viruksen vaipan glykoproteiinit, ydinproteiinit ja virusentsyymit). Immuuniblottauksen tulokset arvioidaan positiivisiksi, kyseenalaisiksi ja negatiivisiksi havaittujen vasta-aineiden määrästä ja laadusta riippuen.

On huomattava, että immuuniblottaus on ELISA-herkkyys huonompi; joissakin tapauksissa negatiivinen tulos voidaan kirjata, jos potilaalla on HIV-infektio. Mahdollisuus rekisteröidä vääriä positiivisia tuloksia ELISA-testissä HIV-infektiossa edellyttää kuitenkin integroitua lähestymistapaa HIV-infektion diagnoosiin, jossa otetaan huomioon immunologisten reaktioiden (ELISA, immuuniblottaus) tulosten lisäksi epidemiologiset ja kliiniset tiedot.

Polymeraasiketjureaktio (PCR)

Amerikkalainen biokemisti Kary Mullis kehitti PCR-menetelmän vuonna 1983 hänen löytämänsä lämpöstabiilin DNA-polymeraasin (Tag-polymeraasin) käytön perusteella. Menetelmän periaate on lisätä 10 6 - 10 8 kertaa kopioiden lukumäärää patogeenin spesifistä DNA-aluetta, jota DNA-polymeraasi katalysoi in vitro automaattitilassa.

Keinotekoisissa olosuhteissa tietylle lajille tai patogeenisuvulle spesifisen genomialueen replikaatioprosessin lisääntyminen on mahdollista edellyttäen, että sen nukleotidisekvenssi tunnetaan. Menetelmien käyttö tällaisten alueiden (amplikonien) replikaatiotuotteiden havaitsemiseksi mahdollistaa patogeenin läsnäolon varmistamisen testinäytteessä.

Yllä kuvattu täydentävä ketjun loppuun saattaminen alkaa vain tietyistä aloituslohkoista, jotka ovat lyhyitä kaksisäikeisiä osia. Kun tällaisia ​​lohkoja kiinnitetään tiettyihin DNA-alueisiin, uuden juosteen synteesiprosessi suuntautuu vain valitulle alueelle, ei DNA-juosteen koko pituudelle. Kahta oligonukleotidialuketta, joita kutsutaan alukkeiksi, käytetään luomaan aloituslohkoja tietyille DNA-alueille. Alukkeet ovat komplementaarisia DNA-sekvensseille tietyn fragmentin vasemmalla ja oikealla puolella ja ne on suunnattu siten, että uuden DNA-juosteen valmistuminen tapahtuu vain niiden välillä.

Vastaanottaja PCR-menetelmän edut pitäisi sisältää:

korkea herkkyys, joka mahdollistaa 10-1000 solun määrittämisen näytteestä;

korkea spesifisyys, koska tälle patogeenille ainutlaatuinen DNA-fragmentti havaitaan testimateriaalissa;

menettelyn yleisyys erilaisten patogeenien havaitsemiseksi yhdestä biologisesta määrityksestä;

Suuri analyysinopeus (4--4,5 h);

Mahdollisuus diagnosoida paitsi akuutteja, myös piileviä infektioita.

PCR:n käyttö on tehokasta useiden bakteeri- ja virusinfektioiden diagnosoinnissa.

Viime aikoina on otettu melko menestyksekkäästi käyttöön kvantitatiivisia PCR-analyysimenetelmiä, jotka mahdollistavat patogeenin pitoisuuden määrittämisen materiaalissa (mikrobi- tai viruskuorma), esimerkiksi hepatiitti B -viruksen, HIV C:n, replikatiivisuuden arvioimiseksi. .

On kuitenkin pidettävä mielessä, että PCR-menetelmällä on myös rajoituksensa, erityisesti opportunistisen autoflooran aiheuttamien infektioiden diagnosoinnissa.

Nukleiinihappojen hybridisaatio

nukleiinihappojen hybridisaatio PCR:n tavoin mahdollistaa patogeenin tunnistamisen näytteestä ilman edeltävää eristämistä. Analyysiä varten syntetisoidaan yksijuosteinen DNA- tai RNA-koetin, joka on komplementaarinen patogeenin spesifisille nukleotidisekvensseille. Koetin on leimattu radionuklidilla, entsyymillä tai muulla helposti tunnistettavalla leimalla. Testimateriaali käsitellään biologisessa määrityksessä läsnä olevien mikro-organismien hajottamiseksi, DNA:n eristämiseksi ja denaturoimiseksi. Seuraavaksi koetinta inkuboidaan testinäytteen kanssa ja mitataan leimatun DNA:n määrä, joka on hybridisoitunut testinäytteen DNA:n kanssa. Reaktio voi tapahtua sekä kiinteän faasin sorbenteilla että liuoksessa, mutta pakollinen ehto on leimatun koettimen sitoutumattomien määrien peseminen pois. Nukleiinihappohybridisaatiomenetelmän herkkyys on huonompi kuin PCR:n ja on 103 mikrobisolua näytettä kohti.

Kun minut testattiin sukupuolitautien varalta, päätin käydä HIV-testissä. Seuraavana päivänä sain valmiit testit ifa:lle, paitsi hiv:lle, jonka seurauksena minulla todettiin klamydia. Herpes ja mikroplasmoosi. Mutta vich ei koskaan tullut. He soittivat minulle 3 päivän kuluttua ja sanovat, että sinun täytyy tulla AIDS-keskukseen ottamaan uudelleen verta. Voiko Imunablot olla väärä positiivinen klamydiasairauksissa Mycraplasmosis HPV Herpes

Woman.ru asiantuntijat

Hanki asiantuntijalausunto aiheestasi

Anastasia Shesterikova

Rusina Irina Vladimirovna

Psykologi, stressin lievittäjä. B17.ru:n asiantuntija

Olga Jurievna Diganaeva

Psykologi. B17.ru:n asiantuntija

Olga Borisenko

Psykologi, Gestalt-terapeutti. B17.ru:n asiantuntija

Dmitri Valerievich Tishakov

Psykologi, ohjaaja, systeeminen perheterapeutti. Asiantuntija sivustolta b17.ru

Shiyan Olga Vasilievna

Psykologi, psykologi-konsultti. Asiantuntija sivustolta b17.ru

Oksana Lushankina

Psykologi, Suhteet perheessä. Asiantuntija sivustolta b17.ru

Anna Daševskaja

Psykologi, Skype konsultaatiot. Asiantuntija sivustolta b17.ru

Irina Bukina

Psykologi. B17.ru:n asiantuntija

Aksjonova Anna Mikhailovna

Psykologi, ryhmäanalytiikan kandidaatti. B17.ru:n asiantuntija

En halua pelotella sinua, mutta kun sinut kutsutaan AIDS-keskukseen, se on melkein aina positiivista, älä ota sitä uudelleen, onnea sinulle, tärkeintä on saada terapiaa ja elää pitkään

Yksi ystävä on elänyt HIV:n kanssa kymmenen vuotta ja pitää huolta itsestään.
He sanovat, että kolmen vuoden kuluttua he todennäköisesti löytävät paran.
Joka tapauksessa älä vaivu epätoivoon äläkä levitä sitä, vaan hakeudu hoitoon

Ei, IB ei voi olla väärä positiivinen eikä sukupuolitaudit vaikuta tähän analyysiin, jos se on positiivinen, niin valitettavasti sinulla on HIV, sinun on seurattava immuunisolujasi ja aloitettava hoito ajoissa.

valitettavasti ei ((jos he soittivat keskustaan, se on ehdottomasti HIV

Sikäli kuin tiedän, ensimmäiset ja jopa myöhemmät immunoblot-tulokset voivat olla kyseenalaisia. ei vääriä positiivisia, mutta kyseenalaisia. ja sitten tilataan uudelleenanalyysi. Tässä tekstiä nettisivuilta:
”Immuuniblottausta käytetään useimmiten HIV-infektion diagnoosin vahvistamiseen. WHO pitää seerumia positiivisena, jos immunoblottauksella havaitaan vasta-aineita jollekin kahdelle HIV-vaippaproteiinille. Näiden suositusten mukaan, jos tapahtuu reaktio vain yhden vaippaproteiinin (gp160, gp120, gp41) kanssa yhdessä muiden proteiinien kanssa tai ilman reaktiota muiden proteiinien kanssa, tulosta pidetään kyseenalaisena ja suositellaan toista tutkimusta, jossa käytetään eri sarjaa. sarjasta tai toiselta yritykseltä. Jos sen jälkeen tulos jää epäselväksi, tutkimuksia jatketaan 3 kuukauden välein.
voit googlettaa. jos näin on, toivon, että et ole HIV-positiivinen. mutta jos se vahvistetaan, tiedä, että tänä päivänä he elävät ja elävät niin kauan kuin terveet ihmiset ja synnyttävät lapsia. pääehto on kurinalaisuus hoidossa. terveyttä sinulle!

Antiretroviraalinen hoito verkossa

Laskimet

Sivusto on tarkoitettu yli 18-vuotiaille lääketieteen ja lääkealan työntekijöille

Analyysin purkaminen - immunoblot

Auta minua tulkitsemaan analyysi
ENV(GP160)+
ENV(GP110/120)+
ENV(GP41)+
GAG(P55)+
GAG(P40)+
GAG(P25)+
POL(P68)+
POL(P52)+
POL(P34)+

Hei! 2,5 vuotta sitten tein HIV-testin, siellä oli tällainen immunoblotti:
Gp-160+, Gp-110/120+, Gp-41+, p17+, p25+, p31+, p34+, p52+, p55+, p68+. Ja tässä on immunoblotti 30.5.2018: Gp-160+, Gp-41+, GAG 1 -, poll+, env2-. Ei ole selvää, mitä roll + tarkoittaa? Onko hän ainoa siellä vai ei ole paljastettu? Ja minne loput proteiinit katosivat?

Pol ja Env ovat geenejä, jotka koodaavat proteiiniryhmiä. Pidä sitä vain eri ennätyksenä. Kysymys on erilainen. Ja mitä me odotamme? Miksi harkitsemme blottia? Kaikki on melko selvää. Jotain on tehtävä.

Olen jo tottunut siihen, että minulla on HIV. Ja valmis terapiaan.
Kiinnostaa vain kuulla mielipiteesi. Onko tämä uusi infektio vai puuttuuko minulta jotain? Tai joskus käy niin, että immunoblotti avautuu hitaasti paljon?

Tänään katsoin analyysejäni henkilökohtaisesta tiedostostani (tehty SC:ssä):
ELISA ensimmäisessä testijärjestelmässä - positiivinen
ELISA toisessa testijärjestelmässä on negatiivinen (miten se on?)

Lisää IB (tehty invitro ja SC kuukausi sitten):
immunoblot ensimmäisessä testijärjestelmässä: gp 160+, gp 41+
immunoblot toisessa testijärjestelmässä: gp41+, p24+, p17+
immunoblotti kolmannessa testijärjestelmässä: gp160+, gp120+, gp41+, p24+

Ennusteeni mukaan olisin voinut saada tartunnan vuosi sitten (akuutti vaihe oli huhtikuussa jossain), tai 9 kuukautta sitten, mutta yleensä - xs milloin) Käytin aina suojaa ja harrastan seksiä ilman kondomia vain kerran syksyllä 2017

Tänään välitin jälleen VN:n ja IP:n. Teru alkaa kuukauden päästä, kun tilaus saapuu.

Mainittujen kokeiden päivämäärät.

Ensimmäinen blotti ennen ELISAa? Ei lyö. Tässä ei ole hetkeä, joka antaisi meille mahdollisuuden sanoa, että uusi infektio on erittäin todennäköinen, tai päinvastoin.
Se jää mysteeriksi, jos et vahingossa löydä lähdettä ja vertaile.

Selvennykseksi siis

Luovutettu Invitrona.
Ensimmäinen IFA on 11. toukokuuta.
Sitten sama seerumi meni blottiin ja positiivinen analyysi saatiin, jossa tunnistettiin kaksi proteiinia.
gp 160+, gp 41+

Sitten luovutin jo uudelleen SC:lle.
Luovutettu verta 29.5.
Ja siellä hänet ajettiin useiden testijärjestelmien läpi, joista ensimmäinen osoitti negatiivista, toinen positiivista. Negatiivinen ELISA on kuitenkin hauska.
Sitten sama seerumi menee blottiin, josta tiedot ovat peräisin:

Ensimmäinen testijärjestelmä: gp41+, p24+, p17+
Toinen testijärjestelmä: gp160+, gp120+, gp41+, p24+

Mutta ei pointti.
Uusi IP-analyysi on tullut - 754. Tämä ilahduttaa. VN ei ole vielä valmis. Heti kun se saapuu, aloitan todennäköisesti teru.

Olen 80% varma, että infektio oli vuosi sitten. Ja se, että blotti avautuu hitaasti ja ELISA on negatiivinen, on outoa. Vai onko se normaalin rajoissa?

Negatiivinen ELISA on kuitenkin hauska. Haluaisin myös tietää järjestelmän nimen voidakseni kirjoittaa sen mustaan ​​muistikirjaan. Vaikka tämä hetki, jos et ota teoriaa avioliiton kanssa, on vahvasti varhaiselle tartunnalle.
Olen 80% varma, että infektio oli vuosi sitten. Huono täplä sille ajalle. Ei mahdotonta, mutta epätodennäköistä.

Jossain vaiheessa aloin jopa epäillä HIV-testien tuloksia - joten odotan VN:ää.
Tässä kysymyksen viimeinen kohta on jo asetettu.

Katsotaanko myös normaalin rajoissa, että IP on kasvanut 200 kopiota ilman teraa kuukaudessa? Otan nyt Ursosania sappirakon polyyppiin - liite sanoo, että lääke parantaa vastustuskykyä.

On tarpeen arvioida molemmat suhteellisella sisällöllä ja ottaa huomioon yhden laboratorion tiedot yhdellä laskentamenetelmällä. Koska - Jumala tietää mitä CD4:lle tapahtuu.

Yleensä CD4-määrä on 780 solua/ul. VN - 250 kpl / ml.
Tämä on ilman terapiaa. Eli CD4 486:sta hyppäsi 780:een kuukaudessa.
BH laski 550 kopiosta 250 kopioon.

Tämä ei silti ole outoa, vai ovatko tällaiset hyppyt normaalin alueen sisällä? Onko aika aloittaa Tera?

Hei! Läpäsin ifan kolme kertaa, joka kerta +, immunoblotti p24+ p18+ tuli SC:stä. Mahdollinen riski oli yli kuusi kuukautta sitten. p24 osoittaa, että se on edelleen HIV?

Blot epävarma, toista 6-8 viikon kuluttua. Todennäköisesti väärä hälytys.

Hyvää päivää!
Testitulokset palasivat, mukaan lukien blotti:

Vaarallinen kontakti: 24.04.2018
ELISA-testi HIV:lle 23.5.2018 (4 viikkoa vaarallisesta kosketuksesta tai 29 päivää) tulos "+"
ELISA-testi HIV:lle 28.5.2018 (5 viikkoa vaarallisesta kosketuksesta tai 34 päivää) "uudelleenotto" -tulos
ELISA-testi HIV:lle 6.1.2018 (5 viikkoa vaarallisesta kosketuksesta tai 38 päivää) tulos "+"

Blotti tuli ensimmäisestä analyysistä (23.5.18):
GP160 sl.
P24 sl.

Uudet testit suoritettu 06.06.2018 ELISA ja PCR HIV RNA paikallisessa AIDS-keskuksessa. Odotellaan edelleen tuloksia.

Blot-kysymykset:
1. Jos P24 on läsnä, onko se välttämättä HIV-antigeeni vai voidaanko tällaista proteiinia havaita muissa sairauksissa?
2. Mitä lyhenne "sl" tarkoittaa proteiinin vieressä? Yleensä kuvatuissa bloteissa on + tai -
3. Mikä määrittää blotin käyttöönoton? Termistä vai kehon yksilöllisistä ominaisuuksista?
4. Jos tällainen tahra 4. viikolla vaarallisesta kontaktista, onko mahdollista, että tämä ei ole HIV?

Mukavaa päivää ja kiitos.

1. ei, se voi olla vain samanlainen proteiini, jolla on erilainen luonne. 2. heikko. nuo. epäilyttävää. 3. Määräajat ja yksittäisten ominaisuuksien toteutuminen, mutta keskimäärin kaikki on hyvin lähellä. 4. kysymys on väärä, aina on mahdollisuus, kunnes diagnoosi on vahvistettu.

Hei!
Auta minua navigoimaan analyysien tuloksissa ja ymmärtämään, kuinka toimia oikein, jotta toistetut analyysit ovat oikein.

Analyysit luovutettu 25.5.2018
HIV IB
UUSI LAV BLOT 1 - määrittelemätön 29.5.2018 alkaen
IB HIV-markkerit
gp 160+
gp 120 -
gp 41 -
p55+
p40-
s. 24+
p18-
s. 68 -
s. 52 —
s. 34 -
HIV ELISA
ADVIA Centaur HIV Ag-Ab Reaktiivisuus ELISA 12,00 positiivinen (28.05.2018)
On suositeltavaa toistaa analyysi 2 viikon kuluttua.

Marraskuussa 2017 minulla oli NPA, jonka jälkeen tein testejä HIV Ag\Ab Combo Abbott Architect -testijärjestelmällä, jolloin tulos oli negatiivinen.

Samalla otettiin täydellinen verenkuva. Lymfosyytit ovat hieman lisääntyneet, eosinofiilit ovat tasan 0 (mutta minulla oli sellaisia ​​indikaattoreita eosinofiileille aiemmin.

Pääkysymys on:
Mitä lääkkeitä saa ja ei saa ottaa näiden kahden viikon aikana? (en halua minkään "vilkkuvan")
Minulla on satunnaisia ​​allergiakohtauksia, yleensä juon tavegilia. Pitäisikö siitä luopua?
Voiko antibiootteja ottaa ennen testiä? (jos lääkäri on määrännyt muiden infektioiden ja sairauksien hoitoon)

Immunoblottaus HIV-diagnostiikassa

Immuuniblottaus (immunoblot, Western blot, Western blot)- yhdistää entsyymi-immunomäärityksen (ELISA) alustavaan elektroforeettiseen siirtoon virusantigeenien nitroselluloosaliuskaan (liuskalle).

Tässä kauniissa tieteellisessä nimessä "blot" käännetään todennäköisimmin nimellä "blot" ja "western" tarkoittaa "länsi" heijastaa tämän "blotin" leviämissuuntaa paperilla vasemmalta oikealle, toisin sanoen maantieteellisellä kartalla, tämä vastaa suuntaa lännestä itään. "Immuuniblot"-menetelmän ydin on, että entsyymikytketty immunosorbenttireaktio ei suoriteta antigeenien seoksella, vaan HIV-antigeeneillä, jotka on aiemmin jaettu immunoforeesilla fraktioihin, jotka sijaitsevat molekyylipainon mukaan nitroselluloosakalvon pinnalla. . Tämän seurauksena HIV:n pääproteiinit, antigeenideterminanttien kantajat, jakautuvat pinnalle erillisinä vyöhykkeinä, jotka ilmestyvät entsyymi-immunomäärityksen aikana.

Immunoblot sisältää useita vaiheita:

Nauhan valmistelu. Immuunikatovirukselle (HIV), joka on aiemmin puhdistettu ja tuhottu sen ainesosiksi, suoritetaan elektroforeesi, kun taas HIV:n muodostavat antigeenit erotetaan molekyylipainon mukaan. Sitten antigeenit siirretään blottauksella (vastaavasti ylimääräisen musteen puristamiseen "blotterilla") nitroselluloosanauhalle, joka sisältää nyt spektrin HIV:lle ominaisia ​​antigeenisiä vyöhykkeitä, jotka ovat näkymätöntä silmälle.

Esimerkkitutkimus. Testimateriaali (seerumi, potilaan veriplasma jne.) levitetään nitroselluloosaliuskaan, ja jos näytteessä on spesifisiä vasta-aineita, ne sitoutuvat tarkasti vastaaviin (komplementaarisiin) antigeenisiin vyöhykkeisiin. Myöhempien manipulaatioiden seurauksena tämän vuorovaikutuksen tulos visualisoidaan - tehdään näkyväksi.

Tuloksen tulkinta. Juovien esiintyminen tietyillä nitroselluloosalevyn alueilla vahvistaa vasta-aineiden läsnäolon tutkitussa seerumissa tiukasti määriteltyjä HIV-antigeenejä vastaan.

Tällä hetkellä immuuniblottaus (immunoblot) on tärkein menetelmä virusspesifisten vasta-aineiden läsnäolon varmistamiseksi testiseerumissa. Joissakin HIV-infektiotapauksissa, ennen serokonversiota, spesifiset vasta-aineet havaitaan tehokkaammin immunoblottauksella kuin ELISA:lla. Immuuniblottaustutkimus paljasti, että gp 41:n vasta-aineita havaitaan useimmiten AIDS-potilaiden seerumista, ja p24:n havaitseminen profylaktisesti tutkituilla henkilöillä vaatii lisätutkimuksia HIV-infektion toteamiseksi. Geenimanipuloituihin rekombinanttiproteiineihin perustuvat immuuniblot-testijärjestelmät osoittautuivat spesifisemmiksi kuin perinteiset puhdistettuun viruslysaattiin perustuvat järjestelmät. Rekombinanttiantigeeniä käytettäessä ei muodostu diffuusia, vaan selkeästi rajattua kapeaa antigeenikaistaa, joka on helposti saavutettavissa laskentaa ja arviointia varten.

HIV-1-tartunnan saaneiden henkilöiden seerumi havaitsee vasta-aineita seuraaville tärkeimmille proteiineille ja glykoproteiineille - rakenteelliset vaippaproteiinit (env) - gp160, gp120, gp41; ytimet (gag) - p17, p24, p55 sekä virusentsyymit (pol) - p31, p51, p66. HIV-2:lle env:n vasta-aineet ovat tyypillisiä - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol-p68.

Reaktion spesifisyyden toteamiseen tarvittavista laboratoriomenetelmistä eniten tunnistetaan HIV-1-vaippaproteiinien - gp41, gp120, gp160 ja HIV-2 - gp36, gp105, gp140 vasta-aineiden havaitseminen.

WHO pitää seerumia positiivisena, jos immunoblottauksella havaitaan vasta-aineita jollekin kahdelle HIV-glykoproteiinille. Näiden suositusten mukaan, jos tapahtuu reaktio vain yhdellä vaippaproteiineista (rp 160, rp 120, rp 41) yhdessä muiden proteiinien kanssa tai ilman reaktiota muiden proteiinien kanssa, tulosta pidetään kyseenalaisena ja suositellaan toista testiä käyttämällä sarjaa. eri sarjasta tai toisesta yrityksestä. Jos tämän jälkeen tulos on epävarma, suositellaan 6 kuukauden tarkkailua (tutkimus 3 kuukauden kuluttua).

Positiivinen reaktio p24-antigeenin kanssa voi viitata serokonversion ajanjaksoon, koska vasta-aineet tälle proteiinille ilmestyvät joskus ensin. Tässä tapauksessa kliinisistä ja epidemiologisista tiedoista riippuen on suositeltavaa toistaa tutkimus seeruminäytteellä, joka on otettu vähintään 2 viikkoa myöhemmin, ja näin on juuri silloin, kun HIV-infektiossa tarvitaan pariseerumeita.

Positiiviset reaktiot gag- ja pol-proteiinien kanssa ilman reaktiota env-proteiinien kanssa voivat kuvastaa varhaisen serokonversion vaihetta ja voivat myös viitata HIV-2-infektioon tai epäspesifiseen reaktioon. Henkilöt, joilla on tällaiset tulokset HIV-2-testin jälkeen, tutkitaan uudelleen 3 kuukauden kuluttua (6 kuukauden sisällä).

Kysymys: Toistuva HIV-analyysi?

Minut testattiin sukupuolitautien varalta (ei oireita, halusin luottamusta suhteeseen naisen kanssa). HIV-testi oli positiivinen. Ultraäänen jälkeen munuaisessa havaittiin kasvain, poistettiin (se osoittautui pahanlaatuiseksi).
Luin Sazonova I.M.:n kirjan, jossa sanotaan, että pahanlaatuinen kasvain voi antaa positiivisen HIV-testituloksen.
Voiko näin olla, vai eikö ole mitään toivomisen varaa?

Sinun on tehtävä HIV-kontrollitesti. Jos ensimmäinen HIV-testi määritettiin ELISA:lla, tulos voi olla väärä positiivinen. Sen luotettavuus voidaan tarkistaa herkemmällä diagnostisella menetelmällä - PCR:llä (polymeraasiketjureaktio), joka määrittää viruksen DNA: n veressä.

Auta. 16.12.2010 ELISA (+) IB (+) sitten 23.3.2011 - 19.5.2011 yhdeksän negatiivinen ELISA (-) ja kvantitatiivinen PCR. ei ole määrätty. vuonna 2002 raskauden aikana ELISA sitten (+) sitten (-) mutta IB on aina (-). 2004-2008 tein ELISA (-) 2 kertaa vuodessa, mutta 30.04.08 ifa (+) ja IB-undefined. sitten taas 2 kuukauden välein luovutettu IFA aina (-). ja joulukuusta 2010 lähtien on kirjoitettu yllä.. Samaan aikaan en ole koskaan pisttänyt, miehelläni on aina ELISA (-). CD4 980 -solut. ja jopa veri kuppaan 29.04 antoi 3+++.ja sitten kolme kertaa. negatiivinen 10 päivän välein. hepatiitti kaikki (-). Onko kenelläkään ollut vastaavaa. Kiitos.

Kerro, onko sinulle tehty RIBT (treponema pallidum immobilisaatioreaktio), jos on, mitkä ovat tämän tutkimuksen tulokset.

ei, kukaan ei tarjonnut minulle tällaista analyysiä. Mitä se näyttää? Toivottavasti ymmärrät, että puhuin HIV-testeistä. Kiitos. Onko sinulla ollut vastaavia tapauksia työssäsi? Muuten, tietoturvan osalta vuonna 2008 oli epävarmuutta. oli p24/25-proteiinia. vuonna 2010 IB(+)-proteiinit gp160.41.120 p24.17.31. sitten kun ifa lähetettiin taas 3 kertaa (-) IB:lle 4.4. tulos tuli positiivinen, mutta proteiinit gp 120 ja 41. loput on yliviivattu punaisella tahnalla ja alareunassa punaisella IB REPEATilla. mutta PCR samasta numerosta evätään. huhtikuun 4. jälkeen luovutin IFA:n jo 4 kertaa kieltää. kaikki AIDS-keskuksessa, mukaan lukien antigeeni ja vasta-aine. Nyt odotan toista IB:tä ja laadukasta PCR:ää. se siitä. ERITTÄIN KANSSA ARVIOITTAMAAN JA ODOTTAMAAN. Toivoen parasta. KIITOS. Odotan vastausta.

Jos kysyt jotain, yritä seuraavalla kerralla muotoilla se tarkemmin ja selkeyttää diagnoosia. RIBT:tä käytetään kupan diagnoosin vahvistamiseen. HIV-infektion tarkan diagnoosin varmistamiseksi veressä olevat HIV-vasta-aineet määritetään ELISA:lla ja immunoblotilla. Diagnoosi vahvistetaan vain, jos molemmat tulokset ovat positiivisia.

anteeksi kysymyksen epäselvä muotoilu. Kirjoitin, että joulukuussa IFA ja HIV:n immunoblot olivat positiivisia. mutta maaliskuusta lähtien ifa HIV on negatiivinen 9 kertaa. jos olin rekisteröity AIDS-keskukseen, tapahtuuko tämä periaatteessa. HIV on joko aina positiivinen tai negatiivinen. ja kuinka HIV:stä voidaan laittaa immunoblot, jos ELISA-tulos on negatiivinen? niin kaikki kieltävät sen, että jos immunoblot-tarkistus on tarpeen, niin mitä tapahtuu? nopeuskeskuksessamme he eivät voi vastata minulle mitään. Tässä on mitä käännyin puoleesi. Kiitos.

Valitettavasti sekä ELISA että immunoblot voivat antaa vääriä positiivisia tuloksia. Siksi HIV-diagnoosi katsotaan lopulliseksi, vain kun HIV havaitaan samanaikaisesti ELISA- ja immunoblot-menetelmällä.

Hei Sain tänään PCR-testin tulokset HIV:lle, kvalitatiivista virusta ei löytynyt ja toistettu immunoblot HIV:lle, tulos on epävarma proteiinin 41 vuoksi. AIDS-KESKUS sanoi, että todennäköisimmin HIV:tä ei ole, mutta Minun kehossani on rakenteeltaan samanlaisia ​​elimiä kuin HIV. ja mitä mieltä olette, ottaen huomioon kysymykseni 15. ja 16. kesäkuuta (katso yllä), onko HIV vai ei. KIITOS.

Tässä tapauksessa HIV-infektion diagnoosi on kyseenalainen.

Kirjoitat, että vain kun HIV havaitaan samanaikaisesti IF:n ja immunoblotin avulla, HIV-diagnoosi katsotaan lopulliseksi. Mutta entä minun tapauksessani? loppujen lopuksi kaikki ptsr kieltää. ja blot ja ifa hyppää koko ajan. 9 vuoden ajan. Kerro minulle, jos virus oli veressäni, sen RNA ja DNA voitaisiin määrittää tarkasti niin monen vuoden ajan. ja voiko itämisaika tai "ikkuna" kestää näin monta vuotta? Onko HIV:lle vääriä negatiivisia PCR-tuloksia tällaisella ajanjaksolla? Kyllä, unohdin sanoa, että CPD:ssä tekemäni HIV-pikatestit ovat aina negatiivisia, vai eikö niihinkään voi luottaa? Kiitos.

Tässä tapauksessa PCR-diagnostiikka ei ole tärkein menetelmä prosessin dynamiikan tunnistamiseksi - serologiset menetelmät ovat informatiivisempia. Tässä tapauksessa väärien negatiivisten tulosten todennäköisyys on suuri. HIV-pikatesteillä on korkea herkkyyskynnys, joten ne voivat antaa myös väärän negatiivisen tuloksen.

anteeksi. Kirjoitin ehdottomasti väärään paikkaan. Vastaa aiheeseen HIV vai ei HIV. Kiitos.

Jos et ole saanut ilmoitusta vastauksen vastaanottamisesta sähköpostiisi, voit tarkastella vastausta kysymykseesi tässä osoitteessa http://tiensmed.ru/news/answers/vich-ili-ne-vich- .html

Hei! Kerro minulle, että rekisteröityäkseni LCD-näytölle (nyt 10 viikkoa raskaana) läpäisin HIV-testit, pari päivää sitten lääkäri soitti ja sanoi, että alustavat HIV-testit olivat positiivisia (ensimmäinen tehtiin Kirovogradissa, mutta Kiovasta ei vieläkään ole virallista tulosta ), samana päivänä kaupunkilaboratoriossamme tehtiin kaksi Pharmasco-yhtiön CITO TEST HIV 1/2 pikatestiä, molemmat tulokset ovat negatiivisia, laborantti sanoi, että nämä testit ovat luotettava ja minun ei tarvitse huolehtia, koska tämä tapahtuu raskauden aikana, Ja nuo analyysit voivat yksinkertaisesti hämmentää. Lääkäri käski luovuttaa verta uudelleen ja minä luovutin vereni vielä kahdesti analysoitavaksi eri sairaaloissa (minulla ei vieläkään ole mitään kolmesta tuloksesta). Olen erittäin huolissani, en ole huumeriippuvainen, ei ollut kyseenalaisia ​​seksisuhteita, jos sairastun hyvin harvoin, muut testit ovat kaikki normaalit. Voiko pikatesteihin luottaa? Tapahtuuko tämä todella raskauden aikana? Lääkäri on pelottanut minua tuskallisen voimakkaasti. Kiitos

Ensinnäkin sinun täytyy rauhoittua ja olla ajattelematta pahaa. Joskus raskauden aikana on vääriä positiivisia tuloksia. On tarpeen luovuttaa verta uudelleen HIV:n varalta ja odottaa tutkimuksen tuloksia.

Hei! Asia on siinä, että minulla oli 2 kuukautta sitten seksikontakti tytön kanssa (toistaiseksi tapaamme). 1,5 viikon kuluttua lämpötila nousi 37,4:ään. pian nukahti. varmuuden vuoksi läpäisimme IF-analyysin 2 viikon kuluttua ja uudelleen 1,5 kuukauden kuluttua. Molemmat vastaukset ovat kielteisiä. mutta minulla on edelleen kuumetta ja yskää, ja minulla on vaihteleva parannus. Voitko kertoa minulle, onko olemassa vaara? lisäksi olin pitkään töissä ilman vapaapäiviä ja viikko sitten olin sairaslomalla (orvi). verikokeet ja keuhkot ovat kunnossa. Kiitos.

Tämä lämpötila voi liittyä virussairauteen, kehon ei ole vielä toipunut tai krooniseen ylityöhön. Jos orgaaninen patologia suljetaan pois, yleinen veri- ja virtsakoe on normaalialueella, samoin kuin fluorografisen tutkimuksen tiedot ovat myös normaalialueella, on suljettava pois sukupuolitaudit: klamydia, mykoplasmoosi, ureaplasmoosi, joka voi aiheuttaa pienen lantion ja virtsaputken elinten tulehduksen ja sen seurauksena kehon lämpötilan nousun. Lue lisää ruumiinlämmön nousun syistä klikkaamalla linkkiä: Korkea lämpötila.

Hei. On sellainen asia - Yli vuosi sitten oli suojaamaton seksuaalinen kontakti kävelevän tytön kanssa. Hän vakuutti minulle, ettei hän ollut sairastunut mihinkään, mutta en voi uskoa häntä 100-prosenttisesti. Hän myös vakuutti, että hän oli läpäissyt lääkärintarkastuksen ennen työn saamista (hän ​​työskenteli myyjänä) ja kaikki oli hyvin. 7 kuukautta kontaktin jälkeen läpäisin silti HIV-testin citylab-laboratoriossa - tulos oli negatiivinen. Mutta viime aikoina aloin usein sairastua - nyt 3 viikkoa minulla on punainen kurkkukipu, enkä voi parantaa sitä. Taas hän alkoi pelätä, mutta yhtäkkiä hän sitten sai sen kiinni? Kerro minulle, onko tämä mahdollista, ja kannattaako luottaa citylabin analyysiin? Pelkään taas luovuttaa, hermot eivät kestä sitä..

Jos tulos on negatiivinen, et todennäköisesti ole sairas etkä ole HIV / AIDS-tartunnan saanut. Diagnoosin selkeyttämiseksi on kuitenkin suositeltavaa analysoida uudelleen valtion laitosten erikoislaboratorioissa, tämä tutkimus suoritetaan nimettömänä. Jos itsehoito ei tuota toivottua tulosta, on suositeltavaa kääntyä otolaryngologin puoleen riittävän tutkimuksen suorittamiseksi ja asianmukaisen hoidon määräämiseksi. Lue lisää HIV-testauksesta artikkelisarjasta napsauttamalla linkkiä: HIV.

Kerro minulle, voitko antaa kuvauksen citylab-laboratoriosta? Aina ei kuitenkaan ole mahdollista suorittaa analyysiä valtion laitoksessa. Ja mikä on prosentuaalinen mahdollisuus, että mies saa tartunnan suojaamattoman kosketuksen kautta?

Valitettavasti emme anna vertailevaa arviota laboratorioista ja yksityisistä lääketieteellisistä laitoksista. Jos epäilet tulosten luotettavuutta, suorita tutkimus toisessa keskuksessa ja pyydä ensin lupa näiden lääketieteellisten palvelujen tarjoamiseen, onko tällä keskuksella oikeus suorittaa tämä tutkimus ja onko kaikki hyväksyttyjen standardien mukainen. Suojaamattoman yhdynnän kautta tartuntariski on molemmilla sukupuolilla sama. Lue lisää HIV-testauksesta artikkelisarjasta napsauttamalla linkkiä: HIV.

Hyvää iltapäivää! 8 kk ikäiselle lapselle tehtiin HIV-testi ELISA:lla, verestä löytyi gp160+ ja p25+, loput kaikki miinus, IB:n johtopäätös on kyseenalainen. Näiden analyysien perusteella käy ilmi, että lapsi on +? gp160 + gp110/120 - p68 - p55 - p52 - gp41 - p34 - p25 + p18 -

Valitettavasti saatujen tietojen perusteella on mahdotonta tehdä diagnoosia 100 prosentin todennäköisyydellä, koska väärää positiivista tulosta ei voida sulkea pois. Tarkan diagnoosin tekemiseksi sinun on suoritettava sarja tutkimuksia, mukaan lukien tämän analyysin toistaminen ELISA-menetelmällä sekä analyysi PCR-menetelmällä. Sen jälkeen sinun tulee ottaa yhteyttä erikoistuneeseen lääketieteelliseen laitokseen, jossa tartuntatautiasiantuntija voi arvioida tulokset kompleksissa. Voit oppia lisää HIV-infektion ilmenemismuodoista verkkosivustomme teemaosiossa napsauttamalla linkkiä: HIV

Voiko se näyttää väärän positiivisen tuloksen "ARI:ssa" tai akuuteissa tartuntataudeissa? Jostain luin, että 58 tai jopa suuremmalla taudilla se voi näyttää "+", mukaan lukien rokotus hepatiitti B:tä vastaan, jos munuaiset jne. kärsivät?

Väärän positiivisen tuloksen mahdollisuus on, joten suosittelen, että teet seuraavaa: analysoi uudelleen - ELISA- ja PCR-testillä ja käy sitten uudelleen tartuntatautilääkärillä. Voit oppia lisää HIV-infektion diagnosoinnista teemaosiossa: HIV

Hyvää iltapäivää! Immunoblotti epämääräinen johtuen p25-proteiinista. Mikä on HIV:n todennäköisyys?

Tässä tilanteessa on tarpeen tutkia huolellisesti tutkimusprotokollia yhdessä muiden indikaattoreiden kanssa, koska näiden tietojen perusteella ei ole mahdollista tehdä oletuksia. Oletettavasti tulosta voidaan pitää epäilyttävänä ja uusintatarkastus vaaditaan 3 kuukauden kuluttua. Lue lisää nettisivujemme osiosta: HIV

Hyvää iltapäivää.
Voitko kommentoida HIV:n ELISA-testiä
1 seerumi +3,559 k=13,3
+2,121 k = 4,9
p 24 neg
Seerumi 2 +3,696 k=13,9
+2,477 k=5,7

Tässä tapauksessa väärä positiivinen tulos ei ole poissuljettu, koska ELISA-menetelmä on epäsuora, joten suosittelen analyysin suorittamista toisella, herkemmällä menetelmällä - immuuniblottauksella. Saat lisätietoja tästä aiheesta verkkosivustomme asiaankuuluvasta osiosta napsauttamalla seuraavaa linkkiä: HIV

Hyvää iltapäivää, kerro mitä virittäisin? Vuosi sitten, kun suunniteltiin lasta, mieheni ja minulle tehtiin kaikki testit, mukaan lukien HIV-testit (he ottivat asian erittäin vakavasti ja oikein), minut tutkittiin Kr. AIDSissa Kiovassa. Keskuksen analyysin läpäistyäni vastaus tuli myös minulle kielteinen. Nyt olen paikalla 14-viikkoisena, ts. Ilmoittaudun, käyn kaikki testit läpi ja vastaus tuli taas, HIV-testi oli epämääräinen, läpäsin sen uudelleen klinikalla ja suoritin pikatestin rauhoittuakseni Dovirissa, mutta he eivät rauhoittaneet minua , pikatesti osoitti positiivisen tuloksen (toinen nauha oli vähemmän selvä), heti kaiken tämän toimenpiteen jälkeen, tuhlaamatta aikaa, hain AIDS-keskukseen ja läpäisin myös analyysin, odotan tulosta. (En voi rauhoittua) Kerro minulle kuinka paljon voit luottaa pikatesteihin ja miksi ensimmäistä kertaa HIV-testiin ei saada vastausta? (mieheni ja minä elämme terveitä elämäntapoja ja rakastamme toisiamme). Kiitos.

Älä panikoi etukäteen - pikadiagnostiikka ei ole HIV-diagnoosin perusta, sen avulla voit tunnistaa potilasryhmät, jotka tarvitsevat perusteellisempaa tutkimusta. Tällaisissa tilanteissa on suositeltavaa suorittaa immuuniblottaus ja keskustella henkilökohtaisesti tartuntatautilääkärin kanssa. Saat lisätietoja tästä aiheesta verkkosivustomme temaattisesta osiosta napsauttamalla seuraavaa linkkiä: HIV. Saat lisätietoja myös seuraavasta verkkosivustomme osiosta: Laboratoriodiagnostiikka

Hei, olin tartuntataudissa, vasta tänään kotiutettiin lähtiessäni, lääkäri soitti ja selitti että minulla oli positiivinen ifa, ensin sairaalassa menessä se oli negatiivinen, sitten kun otin uudelleen, se oli positiivinen , he lähettivät immunoblot-tutkimuksen haukkametsästäjille vuorella, he sanoivat sen olevan valmis ensi viikolla, olin sairaalassa kurkkukipujen ja parainfluenssavirusten kanssa, saavun shokissa, en vieläkään ymmärrä, miten ottaa huomioon, klinikalleni laadittiin myös ote, josta käy ilmi, että jos löytyi ja alempi, että immunoblotti oli toiminnassa, jos minut kotiutettiin huomenna klinikalleni, niin kaikki ilmoitetaan tässä otteessa, kuinka todennäköistä on, että HIV on läsnä? Voisiko olla, että johtuen siitä, että minua hoidettiin parainfluenssaviruksen aiheuttaman kurkkukivun vuoksi, näyttää positiivisia tuloksia ifalle?

Väärän positiivisen tuloksen todennäköisyys on erittäin suuri. Yhden positiivisen tuloksen olemassaolo ei vielä oikeuta HIV-diagnoosin tekemiseen, joten suosittelemme odottamaan immunoblottauksen tulosta ja neuvottelemaan sitten henkilökohtaisesti infektiotautilääkärin kanssa lisätutkimuksia ja havainnointia varten. Angina pectoris, parainfluenssa ja muut vilustumistaudit eivät vaikuta merkittävästi analyysin tuloksiin.

Haluan uskoa sen, mutta elokuun lopussa minulla oli huono olo, lämpötila nousi, 37,5-38 minulla oli löysät ulosteet noin 4 päivää, se oli lomalla missä oli paljon diskoja, join vesijohtovettä kuten monet muut, koska se oli erittäin kallis vesilasi maksoi 300 ruplaa, liitin löysät ulosteet sellaiseen lämpötilaan jonkinlaiseen veteen tarttuneeseen suolistotulehdukseen, en muista tarkasti, mutta siellä oli myös pieni ihottuma ylävartalossa, kun tulin kotiin kuumeella soitin lääkärille, hän kirjoitti rotavirusinfektion, 5 päivän sairauden jälkeen vapaaehtoisesti jättäisin hänet ja menin töihin, missä sairastuin muutama päivä myöhemmin sinuiittiin (aikana tuon ajan piti olla kadulla) Yhdistin siihen, että suuri lämpötilan lasku lomasta ja myrkytyksestä alensi vastustuskykyäni ja siksi flunssain jälleen kerran poskiontelotulehduksella, kaiken kaikkiaan se on taas sairausloma, suuntaan Laurasta join klacid cf 500 10 päivää, se meni ohi, palasin töihin 3 viikon kuluttua olin työmatkalla kaarimaa 3 päivän ajan. kuljetuksen ja hotellin ilmastointilaitteet olivat armottomia ja kotiin palattuani lentokoneessa lämpötila oli jo 39,5.tässä olin kotona 40 lämmöllä, soitin lääkärin kotiin, kirjoitin orvi ja sanoin kurkku oli erittäin punainen, minulla oli krooninen nielurisatulehdus ja sanoin tämän Lauralle, hän itse kirjoitti juodakseen antibioottia Levolet r. soitti ambulanssin koska hänellä oli kuumetta ja vauhti oli 40 eikä laskenut, sairaalahoitoa ei tarjottu, seuraava päivä sama tarina - ambulanssi antoi kuumetta alentavan ruiskeen ja lähti. Kolmannella kerralla vaadin sairaalahoitoa, he tuskin vietivät minut tartuntatautien sairaalaan, jossa todettiin parainfluenssan ja adenovirusinfektion sekatulehdus, mutta kotiutuksen jälkeen lääkäri - osastopäällikkö sanoi, että minulla oli HIV-positiivinen ifa ja he tekivät sen kahdesti, olen shokissa, en tiedä mitä tehdä en voi syödä enkä juoda .hän sanoi että minulla on selvä akuutti HIV-infektio ja varmistukseksi he lähettivät verestäni analyysin immunoblottausta varten AIDS-keskukseen,
nyt, piirtämällä analogian minulle viime aikoina tapahtuneista tapahtumista sekä kolmesta sairauslomasta peräkkäin, kokeilin kaikkia oireita ja olen kauhuissani siitä, mikä voisi olla, samana päivänä kotiutumisen jälkeen menin tehdä analyysi in vitro anonyymisti ja seuraavana päivänä ifa:n tulos oli sama +
Olen pahoillani näin yksityiskohtaisesta tiedosta, mutta olen pyyhkäisty pois ja tapettu, juon vahvoja rauhoittavia lääkkeitä ja minulla ei ole ruokahalua enkä käytännössä syö, olen laihtunut paljon
Minulla on myös sellainen kysymys, että lääkäri otteella sairaalasta osoitti HIV:n tuloksen ifa:lla löytyi ja sen alapuolella immunoblottaus on toiminnassa, mutta heti kun suljen bl:n klinikallani, kaikki menee kirjoitetaan sinne. mitä minun pitäisi tehdä, se ei ole enää luottamuksellista. Pyysin lääkäriä olemaan kirjoittamatta tätä analyysiä otteeseen, jonka hän kieltäytyi minulta, missä määrin oikeuksiani tietojen salassapitoon kunnioitetaan täällä.

Valitettavasti sairaalassa tehtyjen tutkimusten tulokset sopivat otteeseen, koska hoitavalla piirilääkärillä on oltava täydelliset tiedot terveydentilastasi. Tässä tilanteessa emme puhu tietojen luovuttamisesta, koska ne siirretään vain toiselle hoitavalle lääkärille, joka jatkaa tarkkailuasi.

Hei! Tein hiv-testit koska tarvitsin todistuksen FMS:stä, pariin viikkoon ei annettu testejä, sitten kutsuttiin päähän ja sain positiivisen tuloksen, ottivat joukon kuitteja ja lähettivät. ne alueelliseen AIDS-keskukseen lisätutkimuksia varten, kuten todistuksessa lukee. Haluan läpäistä toisella klinikalla ja sitten alueelliseen, vai onko järkevää ottaa se uudelleen? En vain ymmärrä, miksi he eivät antaneet niitä niin pitkään, mutta lääkäri sanoi, että he väittivät tehneen jonkinlaisen analyysin ja olen heille velkaa vielä 4 tuhatta ruplaa, koska jos he tekisivät sen, he todennäköisesti antaisivat yksityiskohtaisen tiedot sairaudesta todistuksen lisäksi?

Tässä tilanteessa ei pidä panikoida etukäteen - yhden positiivisen tuloksen saaminen ei vielä anna mahdollisuutta arvioida luotettavasti mahdollista tartuntaa, koska vääriä positiivisia tuloksia ei ole poissuljettu. Suosittelemme, että teet testin uudelleen ja jos saat positiivisen tuloksen, sinun on suoritettava uusi tutkimus - immunoblottaus. Laboratorio ei pääsääntöisesti anna tarkkoja tietoja tuloksista, mikä on normaalia ja yleistä käytäntöä. Hoitava lääkäri voi vastata kaikkiin kysymyksiisi tarkastuksen jälkeen henkilökohtaisella konsultaatiolla.

Unohdin lisätä, että kesäkuun alusta syyskuun puoliväliin tein itselleni anabolisten steroidien kuurin, nimittäin sustanon 250 on sekoitus testosteronia ja stanozololia primabolaanin kanssa, halusin valmistautua kesään ja lomaan, voisivatko he heikentää immuniteettini ja kaikkea mitä minulle tapahtui.

Immuunihäiriöt sekä autoimmuunisairauksien esiintyminen voivat antaa vääriä positiivisia tuloksia HIV-testistä. Siksi, jos ELISA:lla saadaan 2 positiivista tulosta, suositellaan immunoblottausta, jonka avulla voit vastata tarkasti kysymykseen, onko infektiota vai ei.

Mitä autoimmuunisairauksien esiintyminen tarkoittaa, mitä ne ovat?
yleisesti voin sanoa, että sairastuin melko usein varhaisesta lapsuudesta ja jopa pari kolme vuotta sitten pyysin hoitavaa lääkäriä pitämään immuniteetistani huolta, koska olin jatkuvasti väsynyt ja usein sairaana, lähinnä korva, kurkku, nenä. , mutta koko ajan HIV:stä oli negatiivisia tuloksia, annoin ne riittävän helposti, epäröimättä.

HIV-testin väärä positiivinen tulos voi olla äskettäisen virusinfektion, hepatiitti B -rokotuksen, tuberkuloosin, hepatiitti-, herpes-, sekä autoimmuunisairauksien, kuten nivelreuman, systeemisen lupus erythematosuksen, dermatomyosiitti, skleroderma, taustalla. sidekudossairaudet jne.

Haluan lisätä kysymykseeni, että immunoblotti tuli, se oli negatiivinen, mutta lääkäri sanoi, että koska oli kaksi jos + kun olin infektiosairaalassa, minun on silti otettava analyysi uudelleen, mutta vähän myöhemmin

Tässä tapauksessa lääketieteellinen taktiikka on perusteltua - suosittelemme, että otat immunoblotin uudelleen 1,5-2 kuukauden kuluttua.

Mikä on todennäköisyys: 2 ifa + verinäytteen ero noin 2 päivää, immunoblotti - ; oli infektiosairaalassa adenovirusinfektion ja parainfluenssan kanssa, jossa veri otettiin, immunoblotti lähetettiin AIDS-keskukseen

Hyvää iltapäivää! Rekisteröidyin LCD:lle, kävin läpi kaikki testit, lääkäri sanoi, että minulla on herpes veressäni, sitten he soittivat AIDS-keskuksesta ja sanovat, että minun täytyy hakea uudelleen, hain ja he kertovat minulle, että minulla on HIV positiivinen, paniikissa menimme mieheni kanssa toistamaan minulla oli myös ifa ja immunoblot + miehelläni analyysi, annoin sen uudelleen kuukauden kuluttua. Minulla on + mieheni - nyt olen raskaana viikolla 23!

Tässä tilanteessa on valitettavasti mahdollisuus saada HIV-infektio, mutta lopullista diagnoosia ei voida tehdä edes positiivisella immunoblotilla, ottaen huomioon raskaustilan. Tässä tilanteessa vaaditaan väärien positiivisten tulosten poissulkemista, joten suosittelemme, että teet testin uudelleen ja otat yhteyttä infektiotautiasiantuntijaan.

jos immunoblottaus osoitti positiivisen tuloksen HIV:lle ja seulonta on negatiivinen, mihin tulokseen pitäisi luottaa?

Immunoblot on tarkempi tutkimus, joten tässä tutkimuksessa, jos positiivinen tulos saadaan, on jatkettava tutkimusta ja vierailtava henkilökohtaisesti infektiotautiasiantuntijalla.

Mikä se on - immunoblot? Tämä on yleinen menetelmä ihmisen virusinfektioiden laboratoriodiagnoosissa. Sitä pidetään yhtenä tarkimmista ja luotettavimmista tavoista havaita HIV. Luotettavuudessaan se ylittää jopa immunoblot-tuloksia, joita pidetään kiistämättöminä ja lopullisina.

yleistä tietoa

Immunoblot - mikä se on? HIV-infektion tunnistamiseksi henkilössä on suoritettava laboratoriotesti veriseerumista vasta-aineiden esiintymisen varalta. Western blot -tekniikkaa kutsutaan myös Western blot -tekniikaksi. Sitä käytetään ihmisen virusinfektioiden havaitsemiseen lisäasiantuntijamenetelmänä. On tarpeen vahvistaa ELISA - laboratoriotesti, jonka avulla voit määrittää HIV-vasta-aineiden esiintymisen veressä. Positiivinen ELISA-analyysi tarkistetaan uudelleen immunoblottauksella. Sitä pidetään herkimpänä, monimutkaisimpana ja kalleimpana.

tarkoitus

Mikä se on - immunoblot? Tämä on tekniikka veriseerumin laboratoriotestaukseen viruksen vasta-aineiden esiintymisen varalta. Tutkimuksen aikana asiantuntija esierottaa viruksen proteiinit geelissä ja siirtää ne nitroselluloosakalvolle. Immunoblottaus on tarkoitettu HIV:n määrittämiseen eri vaiheissa. Ensimmäisessä vaiheessa komponenteistaan ​​puhdistettu virus altistetaan elektroforeesille, ja sen koostumuksen muodostavat antigeenit erotetaan molekyylipainon mukaan.

Se lisääntyy elävässä solussa upottaen geneettisen tietonsa siihen. Tässä vaiheessa henkilöstä tulee HIV-viruksen kantaja, jos hän on saanut tartunnan. Sairauden erityispiirre on, että se ei välttämättä ilmene pitkään aikaan. Virus tuhoaa lymfosyyttejä, jolloin ihmisen vastustuskyky heikkenee ja elimistö ei pysty vastustamaan infektioita. Jos HIV hoidetaan asiantuntevasti ja ajoissa, potilas elää kypsään vanhuuteen. Hoidon puute johtaa väistämättä kuolemaan. Infektiohetkestä, mutta ilman hoitoa, enimmäiselinikä on enintään kymmenen vuotta.

Erikoisuudet

Immunoblot-analyysi on luotettava menetelmä, jonka avulla voit määrittää vasta-aineiden esiintymisen ensimmäisen ja toisen tyypin HIV-antigeeneille. Jos henkilö on saanut tartunnan, vasta-aineita ilmaantuu kahden viikon kuluessa, mikä voidaan havaita paljon myöhemmin. HIV:n erikoisuus on, että vasta-aineiden määrä kasvaa nopeasti ja jää potilaan vereen. Vaikka niitä esiintyisikin, tauti ei välttämättä ilmene kahteen tai useampaan vuoteen. ELISA-menetelmä ei aina määritä tarkasti taudin esiintymistä, joten tulosten vahvistaminen immunoblottauksella ja PCR:llä vaaditaan, jos entsyymi-immunomääritys on positiivinen.

Indikaatioita tapaamiseen

Mikä tämä "immunoblotti" on, on jo selvitetty, mutta kenelle tämä tutkimus on määrätty? Syy immunoblottausmenetelmän testeihin on positiivinen ELISA-tulos. On välttämätöntä käydä läpi entsyymi-immunomääritys potilaille, joille leikataan. Lisäksi analyysi tulisi tehdä raskautta suunnitteleville naisille sekä kaikille seksuaalisesti siveettömille. Määritä immunoblottaus HIV-potilaille, jos ELISA-tulokset ovat epävarmoja. Seuraavat hälyttävät oireet voivat olla syynä mennä lääkäriin:

• voimakas painonpudotus;
• heikkous, työkyvyn menetys;
• suolistosairaus (ripuli), joka kestää kolme viikkoa;
• kehon kuivuminen;
• kuume;
• turvonneet imusolmukkeet kehossa;
• kandidiaasin, tuberkuloosin, keuhkokuumeen, toksoplasmoosin, herpesin pahenemisen kehittyminen.

Potilaan ei tarvitse valmistautua ennen laskimoveren luovuttamista. 8-10 tuntia ennen tutkimusta et voi syödä. Ei ole suositeltavaa juoda alkoholi- ja kahvijuomia päivää ennen verenluovutusta, harjoittaa raskasta fyysistä harjoittelua, kokea jännitystä.

Missä analyysi tehdään?

Missä voin tehdä HIV-testin? ELISA-, immunoblot-tutkimukset suoritetaan kaupunkien yksityisillä klinikoilla, tulokset julkaistaan ​​päivässä. Myös välitön diagnoosi on mahdollista. Valtion lääketieteellisissä laitoksissa ELISA-testit ja immunoblottaus suoritetaan ilmaiseksi Venäjän federaation lainsäädännön mukaisesti. Raskaana olevat naiset sekä potilaat, jotka joutuvat sairaalaan tai leikkaukseen, on testattava tartuntatautien varalta.

Miten tutkimus tehdään?

Kuinka ELISA suoritetaan? Immunoblottipositiivinen/negatiivinen vahvistaa tai kumoaa entsyymi-immunomäärityksen tulokset. Tutkimusprosessi on melko yksinkertainen. Asiantuntija suorittaa laskimoverinäytteen, ajassa se kestää enintään viisi minuuttia. Näytteenoton jälkeen pistoskohta on desinfioitava ja suljettava laastarilla. Näytteenotto suoritetaan tyhjään vatsaan, joten toimenpiteen jälkeen ei haittaa syödä pala tummaa suklaata tai juoda makea kuuma juoma.

Saadaksesi lähetteen ilmaiseen analyysiin julkisessa lääketieteellisessä laitoksessa, sinun tulee käydä yleislääkärillä. Yleisesti ottaen immunoblotti ei eroa muista verikokeista näytteenottotavan suhteen. Tutkimusmetodologia on yksinkertainen. Jos ihmisen veressä on virus, elimistö alkaa tuottaa vasta-aineita sen tuhoamiseksi. Jokaisella viruksella on oma sarjansa antigeeniproteiineja. Näiden vasta-aineiden havaitseminen on Western blot -tekniikan perusta.

Hinta

Paljonko analyysi maksaa? HIV-immunoblotti ei sovellu halvaan tutkimukseen. Keskimäärin seulontatutkimus entsyymi-immunomäärityksellä maksaa 500-900 ruplaa. Immunoblottaus on todentamistutkimus, jonka hinta on kolmesta viiteen tuhatta ruplaa. Monimutkaisemmat menetelmät ovat paljon kalliimpia. Esimerkiksi sinun on maksettava siitä noin 12 000 ruplaa.

Tuloksen tulkinta

Yleisimmät menetelmät HIV-infektion diagnosoimiseksi ovat entsyymi-immunomääritys ja immunoblottaus. Niitä käytetään immuunikatoviruksen seerumin vasta-aineiden määrittämiseen. Infektion esiintyminen varmistetaan yleensä kahdella testillä: seulonnalla ja varmistustestillä. Lääkärin tulee suorittaa tutkimuksen tulosten tulkinta, hän myös tekee diagnoosin ja määrää hoidon. Jos immunoblotti on positiivinen, tämä tarkoittaa, että ihmiskehossa on virus.

Positiivinen tulos ei saa olla syy itsehoitoon, koska jokaisella potilaalla voi olla oma kuva sairaudesta. Laadullinen analyysi sisältää seulonnan ja todentamisen. Jos potilaalla ei ole virusta, tulos ilmoitetaan negatiiviseksi. Jos seulonnalla havaitaan, suoritetaan ylimääräinen varmennustutkimus. Immunoblot on analyysi, joka vahvistaa tai kumoaa seulonnan. Jos testiliuskassa näkyy tummumista tietyillä alueilla (proteiinin lokalisaatiokohdissa), tehdään HIV-diagnoosi. Jos tulokset ovat epävarmoja, testit suoritetaan kolmen kuukauden kuluessa.

Voit estää immuunikatoviruksen tartunnan noudattamalla tiettyjä sääntöjä: vältä satunnaista seksiä, käytä kondomia kontaktien aikana, älä käytä huumeita. Jos tauti havaitaan raskaana olevalla naisella, on tärkeää noudattaa tiukasti hoitavan lääkärin suosituksia, älä unohda suorittaa tutkimuksia viruksen esiintymisen varalta.

IMMUNOBLOT(Western blot) - menetelmä veriseerumin laboratoriotestaukseen HIV-vasta-aineiden esiintymisen varalta; se on tarkempi testi kuin ELISA, ja sitä käytetään ELISA-tulosten vahvistamiseen. ELISA - entsyymikytkentäinen immunosorbenttimääritys (ELISA) - laboratoriotesti, jonka avulla voit määrittää HIV-vasta-aineiden esiintymisen veressä; HIV-vasta-ainetesti.

WHO:n suosituksen mukaan HIV-infektion diagnosoinnissa käytetään immunoblottausta (western blot) lisäasiantuntijamenetelmänä, jonka pitäisi vahvistaa ELISA-tulokset. Tätä menetelmää käytetään yleensä positiivisen ELISA-tuloksen tarkistamiseen, koska sitä pidetään herkempänä ja spesifisempänä, vaikkakin monimutkaisempaa ja kalliimpaa.

Immunoblottaus yhdistää entsyymi-immunomäärityksen (ELISA) viruksen proteiinien alustavaan elektroforeettiseen erotukseen geelissä ja niiden siirtämiseen nitroselluloosakalvolle. Immunoblot-menettely koostuu useista vaiheista (). Ensinnäkin, esipuhdistettu ja sen aineosiksi tuhottu HIV:lle suoritetaan elektroforeesi, kun taas kaikki viruksen muodostavat antigeenit erotetaan molekyylipainon mukaan. Sitten antigeenit siirretään blottauksella geelistä nitroselluloosaliuskalle tai nailonsuodattimelle, joka sisältää nyt HIV:lle tyypillisen spektrin proteiineja, jotka ovat näkymätöntä silmälle. Seuraavaksi testimateriaali (seerumi, potilaan veriplasma jne.) levitetään liuskalle, ja jos näytteessä on spesifisiä vasta-aineita, ne sitoutuvat niitä tarkasti vastaaviin antigeeniproteiinien liuskeisiin. Myöhempien manipulaatioiden (kuten ELISA) seurauksena tämän vuorovaikutuksen tulos visualisoidaan - tehdään näkyväksi. Raitojen esiintyminen kaistaleen tietyillä alueilla vahvistaa tiukasti määriteltyjen HIV-antigeenien vasta-aineiden läsnäolon tutkitussa seerumissa.

Immunoblottausta käytetään yleisimmin HIV-infektion diagnoosin vahvistamiseen. WHO pitää seerumia positiivisena, jos immunoblottauksella havaitaan vasta-aineita jollekin kahdelle HIV-vaippaproteiinille. Näiden suositusten mukaan, jos tapahtuu reaktio vain yhden vaippaproteiinin (gp160, gp120, gp41) kanssa yhdessä muiden proteiinien kanssa tai ilman reaktiota muiden proteiinien kanssa, tulosta pidetään kyseenalaisena ja suositellaan toista tutkimusta, jossa käytetään eri sarjaa. sarjasta tai toiselta yritykseltä. Jos sen jälkeen tulos jää epäselväksi, tutkimuksia jatketaan 3 kuukauden välein.

Immunoblottausta varten ensimmäisessä vaiheessa veriseerumin sisältämät proteiinit erotetaan geelissä niiden molekyylipainon ja varauksen mukaan sähkökentän avulla (geelielektroforeesimenetelmä). Sitten geelille levitetään nitroselluloosa- tai nailonkalvo ja "kostutetaan" (tämä on blotting). Tämä suoritetaan erityisessä kammiossa, joka mahdollistaa materiaalin täydellisen siirron geelistä kalvolle. Tämän seurauksena geelissä ollut proteiinijärjestelyn kuvio toistetaan kalvolle (blot), jota voidaan sitten helposti manipuloida. Aluksi kalvo käsitellään vasta-aineilla haluttua antigeeniä vastaan, ja sitoutumattoman materiaalin poispesun jälkeen lisätään radioaktiivisesti leimattua konjugaattia, joka sitoutuu spesifisesti vasta-aineisiin (kuten ELISA:ssa). Tuloksena olevan antigeeni-vasta-aine-leimatun konjugaattikompleksin sijainti määritetään autoradiografialla käyttäen röntgenfilmiä. Sen ilmenemisen jälkeen kaikki käy selväksi, onko veressä antigeenejä vai ei.

Immunoblottaus -(englannista "blot" - spot) - menetelmä antigeenien (tai vasta-aineiden) tunnistamiseksi tunnettujen seerumien (tai antigeenien) avulla. Se on geelielektroforeesin ja ELISA:n yhdistelmä. Aluksi bakteerisolut tai virionit tuhotaan ultraäänellä, minkä jälkeen kaikki viruksen tai bakteerisolujen antigeenit erotetaan elektroforeesilla ja kaupallinen reagenssi saadaan erityiselle nitroselluloosakalvolle. Immunoblottausta tehtäessä potilaan testiseerumia levitetään kalvolle tunnettujen antigeenien kanssa. Inkubaation ja sitoutumattomien vasta-aineiden poispesun jälkeen ne etenevät ELISAan - kalvolle levitetään entsyymillä leimattua ihmisen immunoglobuliinien antiseerumia ja kromogeenistä substraattia, joka muuttaa väriä vuorovaikutuksessa entsyymin kanssa. Immunoglobuliini-entsyymikompleksien antigeeni-vasta-aine-antiseerumin läsnä ollessa kantajalle ilmestyy värillisiä täpliä. Immunoblottausmenetelmän avulla voit havaita erikseen vasta-aineita patogeenin eri antigeeneille (esimerkiksi HIV-infektiossa immunoblottaus havaitsee vasta-aineet gp120:lle, gp24:lle ja muille viruksen antigeeneille).

Radioimmunomääritys (RIA)

Menetelmä perustuu antigeeni-vasta-ainereaktioon käyttämällä antigeeniä tai vasta-aineleimaa radionuklidin kanssa. Leimana käytetään 125I, 14C, 3H, 51Cr ja muita radionuklideja. Syntyvät immuunikompleksit eristetään järjestelmästä ja niiden radioaktiivisuus määritetään laskureilla (β-säteily). Säteilyn intensiteetti on suoraan verrannollinen sitoutuneiden antigeeni- ja vasta-ainemolekyylien lukumäärään.

RIA:n kiinteän faasin versiota, jossa käytetään polystyreenipaneelien kuoppiin adsorboituja leimattuja vasta-aineita tai antigeenejä, käytetään laajalti.

RIA:ta käytetään mikrobien, virusten, erilaisten hormonien, entsyymien, lääkeaineiden, immunoglobuliinien sekä muiden testimateriaalin sisältämien aineiden havaitsemiseen pieninä pitoisuuksina 10–12–10–15 g/l.

testikysymykset

Immuunibakteriolyysireaktio: millainen reaktio se on? mikä on antigeeni, mikä on vasta-aine, reaktiomekanismi, asettumismenetelmät, käytännön sovellus. Immuuni hemolyysireaktio: tarvittavat ainesosat, asettamismenetelmä; säätimet, käytännön sovellus. Paikallisen hemolyysin reaktio geelissä (Yerne-reaktio): reaktion periaate, formulointimenetelmä, käytännön sovellus. Komplementin kiinnitysreaktio: reaktioperiaate; mitä muodostuu, kun immuuniseerumi on vuorovaikutuksessa tietyn antigeenin kanssa; mitä komplementille tapahtuu, jos se on läsnä tässä vuorovaikutuksessa? Mikä on komplementin kohtalo, jos antigeenin ja vasta-aineiden välillä ei ole spesifistä affiniteettia? Mitä reaktiota voidaan käyttää määrittämään, mitä komplementille tapahtui; miksi tätä reaktiota käytetään; mikä on RSK:n näkyvä positiivinen tulos? Miksi? Mitä komplementin ominaisuutta käytetään CSC:n ensimmäisessä vaiheessa? Toisessa vaiheessa? Jos RSK:n lopputulos on hemolyysi, tarkoittaako se positiivista vai negatiivista tulosta? Selitä tulokset: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+. Nimeä ensimmäisen RSK-järjestelmän ainesosat ja toisen RSK-järjestelmän ainesosat. Miksi testiseerumi on inaktivoitava? Miten komplementti titrataan? Hemolyyttinen seerumi: mitä se sisältää, miten se saadaan, mikä on tiitteri ja miten se määritetään? Mitä eläimiä käytetään RSC-komponenttien saamiseksi? Tekniikka asettaa RSC kylmään. Kun määritetään mitä seuraavista reaktioista komplementin osallistuminen on välttämätöntä: saostuminen, flokkulaatio, agglutinaatio, epätäydellisten vasta-aineiden havaitseminen, immuunibakteriolyysi, immuunihemolyysi, Yerne, CSC? Immunofluoresenssireaktio (RIF) - ilmaisee tapahtumien järjestyksen suorassa Coons-reaktiossa; tarvittavat ainesosat. Mikä on antigeeni, mikä on vasta-aine, miten vasta-aineet leimataan, miten reaktion tulos otetaan huomioon, miltä positiivinen tulos näyttää? Käytännön sovellus - mitä voidaan määrittää tällä reaktiolla? Epäsuora immunofluoresenssireaktio - osoita tämän reaktion tapahtumien järjestys, tarvittavat ainesosat, mikä on antigeeni, mitä immuuniseerumia käytetään; käytännön käyttö; epäsuoran RIF:n etu suoraan reaktioon verrattuna. Entsyymi-immunomääritys (ELISA) - reaktion periaate; tarvittavat ainesosat; ilmoittaa tapahtumien järjestys, kun reaktio muodostetaan antigeenin havaitsemiseksi testimateriaalissa; tarvittavat ainesosat; mitä tapahtuu positiiviselle tulokselle, miltä se näyttää? Määritä toimintosarja ELISA:n aikana vasta-aineiden havaitsemiseksi testiseerumissa; tarvittavat ainesosat; mitä tapahtuu positiiviselle tulokselle? Immunoblottaus - reaktion periaate; tärkeimmät vaiheet; tarvittavat ainesosat; Miten tulos huomioidaan? reaktioetuja. Radioimmunomääritys (RIA) - mitkä ovat reaktion päävaiheet; millä vasta-aineet tai antigeenit leimataan, miten tulos otetaan huomioon? Immunoelektronimikroskooppi - menetelmän periaate; tärkeimmät vaiheet; tarvittavat ainesosat; Millä vasta-aineet on leimattu? miten reaktion tulos otetaan huomioon. Immobilisaatioreaktiot - menetelmän periaate, asetustekniikka, komponentit, tulosten laskenta.

Itseharjoitteluprosessissa suoritettavat tehtävät.

Täytä immuniteettireaktioiden taulukko tämän aiheen kattamien reaktioiden osalta.

Immuunireaktiot

Opiskelijan työt käytännön oppitunnilla

Aloita työskentely välittömästi RSC:n 1. vaiheen muotoilulla, mutta kirjoita se muistivihkoon myöhemmin (katso alla).

1. Immuuni hemolyysin reaktio. Katso immuunihemolyysin demonstraatioreaktiota, piirrä se kaaviona, selitä tulos koe- ja kontrolliputkissa.

2. Komplementin sitoutumisreaktio

a) pura RSC taulukon mukaisesti;

b) piirrä muistikirjaan kaavio RSC:n asettamisesta taulukon muodossa;

c) laita RSK:n toinen vaihe (ensimmäinen vaihe laitetaan oppitunnin alkuun);

d) purkaa RSK:ta varten tarvittavat diagnostiset valmisteet;

e) ottaa tulos huomioon. Muotoile johtopäätös spesifisten vasta-aineiden esiintymisestä testiseerumissa.

3. Immunofluoresenssireaktio. Tutki taulukkoa, laadi kaavio reaktion asettamisesta muistikirjaasi; katso diagnostiset seerumit; määrittää, mitä seerumi sisältää, miten se on valmistettu, mihin reaktioon (suora tai epäsuora RIF) sitä käytetään. Katso RIF:n esittelytulosta fluoresoivassa mikroskoopissa.

4. Entsyymi-immunomääritys (ELISA). Piirrä muistikirjaasi reaktiokaavio kahdessa versiossa: antigeenin havaitsemiseksi testimateriaalista ja vasta-aineiden havaitsemiseksi seerumista. Tarkista HIV- ja B-hepatiittidiagnoosin ainesosat. Selvitä, mitä kukin ainesosa sisältää ja mihin sitä käytetään.

5. Immunoblottaus. Tee kaavio reaktiosta muistikirjaasi; katso demo - reaktion tulos.

6. Radioimmunomääritys (RIA). Piirrä reaktiokaavio muistikirjaasi.

7. Immuunielektronimikroskooppi (IEM). Katso esittely - reaktion tulos, piirrä reaktiokaavio muistikirjaasi, merkitse antigeeni (virus) ja leimatut vasta-aineet nuolilla.

Immunoblottaus on erittäin herkkä proteiinien havaitsemismenetelmä, joka perustuu elektroforeesin ja ELISA:n tai RIA:n yhdistelmään. Immunoblottausta käytetään HIV-infektion diagnostiikkamenetelmänä jne.

Yleisesti ottaen immunoblottaus ymmärretään kiinteälle tukikalvolle siirrettyjen proteiinien seoksen analyysiksi, johon ne sitoutuvat kovalenttisilla sidoksilla, minkä jälkeen suoritetaan immunodetektio.

On mahdollista analysoida suoraan substraatille kerrostettu proteiiniseos (dot blot -analyysi) tai sen alustavan fraktioinnin jälkeen sähköfokusoinnilla, kiekkoelektroforeesilla tai kaksiulotteisella elektroforeesilla (Western blotting).

Patogeeniantigeenit erotetaanesilla, siirretään sitten geelistä aktivoidulle paperille tai nitroselluloosakalvolle ja kehitetään ELISA:lla.

Yritykset tuottavat tällaisia ​​liuskoja antigeenien "bloteilla". Näille liuskoille levitetään potilaan seerumia. . Sitten inkubaation jälkeen potilas pestään potilaan sitoutumattomista vasta-aineista ja levitetään seerumia entsyymillä leimattuja ihmisen immunoglobuliineja vastaan. . Liusalle muodostunut kompleksi (antigeeni + potilaan vasta-aine + vasta-aine ihmisen Ig:tä vastaan) havaitaan lisäämällä kromogeenistä substraattia, joka muuttaa väriä entsyymin vaikutuksesta.

Tätä menetelmää sovelletaan myös bakteerien, faagien tai virusten kloonien valintaan, jotka ilmentävät kohdekloonattujen geenien tuotteita.

Proteiinien siirto kalvolle suoritetaan joko passiivisesti tai käyttämällä sähkösiirtolaitetta. Proteiinin kalvolle siirtymisen tehokkuuteen vaikuttavat monet tekijät, kuten proteiinien molekyylipaino, geelin huokoisuus, siirtoaika ja käytetyn puskuriliuoksen (trans-puskuri) koostumus.

Kokeen tehtävistä ja ehdoista riippuen valitaan siirtoolosuhteet, jotka tuottavat parhaat tulokset. Yleisesti käytetyt substraatit ovat nitroselluloosaa, polyvinylideenidifluoridia (PVDF) tai positiivisesti varautuneita nailonkalvoja. Nitroselluloosa voi sitoa jopa 80-100 mikrogrammaa proteiinia 1 cm2:tä kohti.

Pienen molekyylipainon proteiinit (joiden molekyylipaino on alle 20 kDa) voivat hävitä pesujen seurauksena, jolloin voidaan alustavasti tutkia tiettyjen geneettisten lokusten polymorfismia vastaavien restriktio-DNA-fragmenttien pituuksilla.

Lisäksi Southern-hybridisaatiota käyttämällä on helppo selvittää, onko kohdegeenissä tietyn restriktioentsyymin hydrolyysikohta sen sisäisessä osassa, jonka avulla voit valita optimaalisen strategian tutkittavan genomin alueen kloonaamiseksi.

Saman kaavan mukaan RNA-molekyylejä voidaan siirtää myös agaroosigeelistä nitroselluloosasuodattimelle. Tätä menetelmää on kutsuttu Northern blottingiksi toisin kuin Southern blotting, koska sukunimi Southern tarkoittaa englanniksi "eteläistä".

Siirtoa suodattimille proteiinigeelistä kutsuttiin vastaavasti Western blot -menetelmäksi. Nat(SDS) denaturoidut suuret proteiinit (yli 100 kDa) voivat siirtyä huonosti kalvoon, jos transpuskurissa on etanolia. Alkoholi parantaa merkittävästi proteiinien siirtymistä SDS-polyakryyliamidigeelistä, mutta kaventaa geelin huokosia, mikä johtaa suurten proteiinien pidättymiseen.

PVDF-kalvo on optimoitu immunodetektioon ja pystyy säilyttämään spesifisesti sitoutuneita proteiineja 160 µg/cm2 asti erittäin alhaisella epäspesifisellä sitoutumisella.

Immunoblottaus

Tämän kalvon tärkeä ominaisuus on sen toistuvan käytön mahdollisuus. Zeta-Probe-nailonkalvot sitovat tehokkaasti SDS-proteiineja ilman alkoholia, ja tämä sitoutuminen on resistentti myöhemmille käsittelyille. Pienen molekyylipainon proteiinit säilyvät myös tehokkaasti. Zeta-Probe-kalvojen korkea sitoutumiskapasiteetti, noin 480 μg proteiinia 1 cm2:tä kohti, mahdollistaa pienten proteiinimäärien havaitsemisen määritysseoksissa.

Sen jälkeen kun antigeeni on immobilisoitu kalvolle, jäljellä olevat sitoutumiskohdat estetään gelatiinin tai naudan seerumin albumiinin tai rasvattoman maidon liuoksilla.

Sitten kalvoa inkuboidaan liuoksessa, jossa on polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita testattua antigeeniä vastaan. Sitoutumattomien vasta-aineiden poispesun jälkeen kalvoa inkuboidaan sekundaaristen vasta-aineiden liuoksessa, jotka ovat alkalisen fosfataasientsyymien (alkalinen fosfataasi, AP) tai piparjuuriperoksidaasin (HRP) konjugaatti lajien vastaisten vasta-aineiden kanssa (vuohen vasta-aineet kanille, hiirelle tai ihmisen immunoglobuliinit) tai proteiinit A (Staphylococcus aureus -proteiini) tai G (Streptococcus sp. -proteiini), joilla on korkea affiniteetti immunoglobuliinien Fc-alueeseen.

Muodostuneiden immuunikompleksien havaitseminen suoritetaan kemiallisella tai kemiluminesenssimenetelmällä. Käytettäessä alkalisen fosfataasikonjugaatteja kemiallisen reaktion substraatteja ovat 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti (BCIP) tai tetratsoliumsininen (NBT) ja pipkäytettäessä 4-kloori-1-naftoli ja vetyperoksidi.

Entsymaattisten reaktioiden seurauksena kalvolle muodostuu värillinen vyöhyke tai täplä antigeeni-vasta-ainekompleksin lokalisaatiokohtaan.

Tämän menetelmän herkkyys on 100 pg proteiinia käytettäessä AP-konjugaatteja ja 100-500 pg käytettäessä HRP-konjugaatteja. Immuunikompleksien kemiluminesenssitunnistus voi havaita alle 5 pg antigeeniä. Tämän menetelmän periaate on, että kun HRP reagoi vetyperoksidin ja syklisen diasyylihydratsiiniluminolin kanssa, säteilee valoa aallonpituudella 428 nm, joka voidaan tallentaa valoherkälle kalvolle.

Immunoblottausreaktio (RI) kehitettiin ELISA:n perusteella. Se on spesifisin ja herkin immunokemiallisen analyysin menetelmä. Immunoblottaus (englanninkielisestä blotista - kastua, spot) yhdistää ELISA:n ja elektroforeesin. Sitä ei käytetä HIV:n monimutkaisten vasta-aineiden havaitsemiseen, vaan vasta-aineita sen yksittäisille rakenneproteiineille (proteiinit-p24, glykoproteiinit-gp120, gp41 jne.). Katso asiantuntijoiden (vahvistavat) reaktiot HIV-infektion diagnoosia varten.

Reaktio suoritetaan useissa vaiheissa:

Virus tuhotaan komponenteiksi - antigeeneiksi (p24, gp120, gp 41 jne.), Joille suoritetaan elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä, toisin sanoen antigeenien erottaminen fraktioiksi molekyylipainon mukaan.

2. Geeli peitetään nitroselluloosakalvolla ja antigeenifraktiot siirretään siihen elektroforeesin avulla. Nitroselluloosa käyttäytyy kuin imupaperi. Kalvo leikataan nauhoiksi (nauhoiksi). Yritykset tuottavat tällaisia ​​liuskoja antigeenien "bloteilla".

Immunoblottaus - ylimääräinen epäsuora menetelmä

Nauhat, joihin on levitetty HIV-antigeenejä, upotetaan potilaan seerumiin ja pestään sitten sitoutumattomasta materiaalista.

4. Liuskoja inkuboidaan peroksidaasilla leimatun antiglobuliiniseerumin kanssa ja pestään.

Substraatti lisätään ja värillisten fraktioiden (täplien) lukumäärä merkitään muistiin, mikä vastaa AG-AT-kompleksin lokalisointivyöhykettä.

Raitojen esiintyminen kaistaleen tietyillä alueilla vahvistaa tiukasti määriteltyjen HIV-antigeenien vasta-aineiden läsnäolon tutkitussa seerumissa. Immunoblottaustuloksen katsotaan olevan positiivinen, jos kalvolla on näkyvissä juovia, jotka vastaavat mitä tahansa kahta kolmesta HIV-antigeenistä - p24, gp41 ja gp 120 (kuvio 37).

PIIRUSTUKSET

LUETTELO KÄYTETTYÄ KIRJALLISTA

Pääkirjallisuus

Lääketieteellinen mikrobiologia, virologia ja immunologia: oppikirja lääketieteen opiskelijoille. yliopistot, 2. painos, korjattu. ja ylimääräisiä — 702 s. Ed. A.A. Vorobjov. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologia, virologia ja immunologia: opas laboratoriotutkimuksiin: opinto-opas / (V.B. Sboychakov et al.); toim. V.B.Sboychakova, M.M.Karapats. – M.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 s.: ill.

3. Lääketieteellinen mikrobiologia, immunologia ja virologia [Elektroninen resurssi]: hunajan oppikirja.

yliopistot - 760 p. — Käyttötila: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. Pietari: Spetslit, 2010.

4. Lääketieteellinen mikrobiologia, virologia ja immunologia [Sähköinen lähde]: oppikirja: 2 osaa / V. 1. - 448 s. — Pääsytila: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: Geotar Media, 2010. .

5. Lääketieteellinen mikrobiologia, virologia ja immunologia [Sähköinen lähde]: oppikirja: 2 osaa Vol. 2. - 480 s. Käyttötila: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: Geotar Media, 2010.

lisäkirjallisuutta

1. Immunodiagnostiset reaktiot: oppikirja / koonnut: G.K. Davletshina, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtarieva, M.M.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: Venäjän terveysministeriön GBOU VPO BSMU:n kustantaja, 2016. - 86s.

2. Joidenkin ominaisuuksien ominaisuudet, jotka määrittävät Enterobacter-, Сitrobacter-, Serratia-, E. coli-, Proteus-bakteerien yhteisviljeltyjen muunnelmien patogeenisen potentiaalin: tieteellinen julkaisu / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 s.

Etusivu » Immunoblot - mikä se on? Immunoblotti tartuntatautien diagnosoinnissa

Immunoblot - mikä se on? Immunoblotti tartuntatautien diagnosoinnissa

Mikä on immunoblotti? Tämä on yleinen menetelmä ihmisen virusinfektioiden laboratoriodiagnoosissa. Se on yksi tarkimmista ja luotettavimmista tavoista havaita HIV.

Luotettavuuden vuoksi se on jopa suurempi kuin entsyymikytkentäinen immunosorbentti (elisa) -määritys. Immunoblot-tuloksia pidetään vakuuttavina ja ratkaisevina. Yleistä tietoa

Immunoblot - mikä se on? Jotta voit tunnistaa henkilön HIV-positiiviseksi, sinun on suoritettava laboratoriotesti, jolla testataan vasta-aineiden esiintyminen veren seerumissa.

Western blot -leikkeiden menetelmää kutsutaan myös Western blot -menetelmäksi (western blot). Sitä käytetään ihmisen virusinfektioiden havaitsemiseen lisäasiantuntijamenetelmänä. Tämä on tarpeen ELISA-testin vahvistamiseksi - laboratoriotesti, jonka avulla voit määrittää HIV-vasta-aineiden esiintymisen veressä. Immunoblot-testi uudelleen positiivinen ELISA.

Sitä pidetään herkimpänä, monimutkaisimpana ja kalleimpana.

Kohde

Mikä on immunoblotti? Tämä menetelmä veren seerumin laboratoriotestaukseen viruksen vasta-aineiden esiintymisen varalta.

Erityisissä tutkimuksissa viruksen kokonaisproteiinista geelissä ja nitroselluloosakalvoilla.

Immunoblottaus (vasta-aineiden havaitseminen potilaiden seerumista tiettyjä patogeeniantigeenejä vastaan)

Western blot -leikkausmenetelmä on tarkoitettu HIV-infektion määrittämiseen eri vaiheissa. Ensimmäisessä vaiheessa puhdistetulle virukselle sen rakenneosista suoritetaan elektroforeesi ja siihen sisältyvät antigeenit jaettuna molekyylipainolla.

Ihmisen immuunikatovirus replikoituu elävissä soluissa, jotka on upotettu sen geneettiseen tietoon. Tässä vaiheessa henkilöstä tulee HIV-viruksen kantaja, jos olet saanut tartunnan.

Tämän taudin erityispiirre on, että se ei ilmene pitkään aikaan. Virus tuhoaa lymfosyyttejä, jolloin ihmisen vastustuskyky heikkenee ja elimistö ei pysty taistelemaan infektioita vastaan.

Jos HIV hoidetaan oikein ja ajoissa, potilas elää kypsään vanhuuteen. Hoidon puute johtaa väistämättä kuolemaan. Infektiohetkestä, mutta ilman hoitoa, enimmäisaika on enintään kymmenen vuotta.

Erikoisuudet

Immunoblot-analyysi on luotettava menetelmä, jonka avulla voit määrittää vasta-aineiden esiintymisen ensimmäisen ja toisen tyypin HIV-antigeeneille.

Jos henkilö on saanut tartunnan, kahden viikon kuluttua vasta-aineita, jotka voidaan havaita paljon myöhemmin. HIV:lle on ominaista, että vasta-aineiden määrä kasvaa nopeasti ja jää potilaan vereen. Vaikka niitä esiintyisikin, tauti ei välttämättä ilmene kahteen tai useampaan vuoteen. ELISA-menetelmä ei aina osoita tarkasti taudin olemassaoloa, vaan vaatii PCR- ja Western blot -leikkeiden tulosten vahvistamisen, jos entsyymi-immunomääritys osoitti positiivisen tuloksen.

Indikaatioita varten

Millainen ”immunoblotti” on jo löydetty, mutta mikä on tulossa tutkimukseen?

Syy ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) immunoblotin testaamiseen on positiivinen ELISA-tulos. On välttämätöntä käydä läpi entsyymi-immunosorbenttimääritys potilailla, joille on menossa leikkaus. Lisäksi sinun tulee tehdä analyysi raskautta suunnittelevista naisista sekä naisista, jotka ovat siveettömiä. Western blot -leikkeitä annetaan HIV-infektiopotilaille, jos elisa-tulokset ovat kyseenalaisia.

Lääkärikäynnin syynä voivat olla seuraavat hälyttävät oireet: nopea painonpudotus, heikkous, toimintakyvyn heikkeneminen, kolme viikkoa kestävät suolistosairaudet (ripuli), nestehukka, kuume, turvonneet imusolmukkeet kehossa, kandidiaasi, tuberkuloosi, keuhkokuume, toksoplasmoosi, herpesin paheneminen.

Potilaan ei tarvitse valmistautua ennen laskimoveren luovuttamista.

Älä syö 8-10 tuntia ennen testiä. Ei ole suositeltavaa juoda alkoholia ja kahvia, raskaita fyysisiä harjoituksia, kokea jännitystä verenluovutusta edeltävänä päivänä.

Missä analyysi tehdään?

Missä voin tehdä HIV-testin?

ELISA, kaupunkien yksityisillä klinikoilla tehty immunoblot-analyysi, antaa tulokset vuorokaudessa. Myös välitön diagnoosi on mahdollista. Julkisissa laitoksissa elisan lääketieteelliset testit ja Western blot -osuudet ovat ilmaisia ​​Venäjän federaation lainsäädännön mukaisesti.

Pakollinen tartuntatautiseulonta raskaana oleville naisille sekä sairaalahoitoa tai leikkausta tarvitseville potilaille Miten tämä tutkimus tehdään?

Kuinka ELISA suoritetaan? Immunoblotti positiivinen/negatiivinen vahvistaa tai kumoaa elisa-tulokset. Toimenpide on melko yksinkertainen. Asiantuntija ottaa laskimoverta, ajallaan se kestää alle viisi minuuttia.

Näytteenoton jälkeen pistoskohta on desinfioitava ja suljettava laastarilla. Näytteenotto suoritetaan tyhjään vatsaan, joten toimenpiteen jälkeen ei haittaa syödä tummaa suklaata tai makeaa kuumaa juomaa.

Saadaksesi lähetteen ilmaiseen analyysiin julkisessa lääketieteellisessä laitoksessa, sinun tulee käydä terapeutilla.

Yleisesti ottaen immunoblotti ei eroa muista näytteenotolla tehdyistä verikokeista. Tutkimusmetodologia on yksinkertainen. Jos ihmisen veressä on virus, elimistö alkaa tuottaa vasta-aineita sen tuhoamiseksi. Jokaiselle virukselle on olemassa monia proteiiniantigeenejä. Näiden vasta-aineiden havaitseminen on Western blot -leikkausmenetelmän perusta. Hinta

Kuinka paljon analyysiä? Immunoblot HIV viittaa halvaan tutkimukseen.

Keskimäärin seulonta-immunomääritysmenetelmät vaihtelevat 500 - 900 ruplaa. Western blot -osat on tutkimustarkastus, jonka hinta vaihtelee kolmesta viiteen tuhanteen ruplaan. Monimutkaisemmat menetelmät ovat paljon kalliimpia. Esimerkiksi polymeraasiketjureaktion (PCR) analysoinnista joudut maksamaan noin 12 000 ruplaa.

Tulosten tulkinta

Yleisimmät menetelmät HIV-infektion diagnosoimiseksi ovat entsyymi-immunomääritys ja immunoblottaus.

Ne on tarkoitettu ihmisen immuunikatoviruksen seerumin vasta-aineiden määrittämiseen. Infektio varmistetaan yleensä kahdella testillä: seulonnalla ja varmistustestillä. Lääkärin tulee tehdä tulosten tulkinta, hän diagnosoi ja määrää hoidon. Jos immunoblotti on positiivinen, se tarkoittaa, että ihmiskehossa on virus.

Positiivinen tulos ei saa olla syy itsehoitoon, koska jokaisella potilaalla voi olla oma kuva sairaudesta.

Laadullinen analyysi sisältää seulonnan ja sertifioinnin. Jos potilaalla ei ole virusta, tulos on "negatiivinen". Kun tämä todistus löytyy, suoritetaan lisäseulontatestejä. Immunoblot-analyysi, joka vahvistaa tai kumoaa seulonnan. Jos testiliuskat ilmestyvät tiettyjen alueiden tummumiseen (proteiinin sijainti), diagnoosi on "HIV".

Jos tulokset ovat epäilyttäviä, testit suoritetaan kolmen kuukauden kuluessa.

Ihmisen immuunikatoviruksen aiheuttaman tartunnan estämiseksi on mahdollista, jos noudatat tiettyjä sääntöjä: vältä satunnaista seksuaalista kontaktia, käytä kondomia kontaktin aikana, älä käytä huumeita.

Jos tauti havaitaan raskaana olevalla naisella, on tärkeää noudattaa hoitavan lääkärin suosituksia, älä unohda viruksen esiintymisen testejä.

Mitä Western Blotting on?

Proteiinien tunnistaminen monimutkaisissa seoksissa tai eri kudosten uutteissa on yksi usein kohdatuista ongelmista. Käyttämällä tällaista työkalua spesifisinä vasta-aineina on mahdollista määrittää tutkittava proteiini minimaalisilla aika- ja taloudellisilla kustannuksilla.

Western blot -menetelmässä proteiiniseos erotetaan ensimmäisessä vaiheessa elektroforeesilla natriumdodekyylisulfaatin (SDS) läsnä ollessa ja siirretään sitten nitroselluloosakalvolle elektroblottauksella.

Tämän menetelmän ydin on siinä, että elektroforeesin jälkeen geeli asetetaan nitroselluloosakalvolle suodatinpaperikerrosten väliin. Tällä tavalla koottu "sandwich" asetetaan sähkökenttään siten, että proteiini-SDS-kompleksit liikkuvat geelilevyn poikki ja immobilisoituvat (epäspesifisen sorption seurauksena) nitroselluloosakalvon pinnalle.

Proteiini-SDS-kompleksin sitoutumisessa nitroselluloosakalvoon osallistuu pääasiassa sähköisiä voimia, ja tämä vuorovaikutus on monipisteinen ja johtaa proteiinien "levitykseen" kalvon pinnalle. Siten sähkösiirron jälkeen saamme geelin jäljennöksen nitroselluloosalla, jossa proteiinit on järjestetty samalla tavalla kuin polyakryyliamidigeelissä.

SDS:n - elektroforeesin, sähkönsiirron ja proteiinien sorption geelistä nitroselluloosakalvolle - suorituksen jälkeen proteiinin tertiäärinen konformaatio muuttuu suuresti, jos on yleisesti ottaen oikein puhua proteiinin tertiäärisen rakenteen olemassaolosta tällaisen prosessin jälkeen. ankara kohtelu. Siksi tutkittavan proteiinin immunokemialliseen havaitsemiseen käytetään yleensä vain mono- tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä proteiinimolekyylin lineaarisille alueille.

51. Entsyymi-immunomääritys, immunoblottaus. Mekanismi, komponentit, sovellus.

Vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä konformaatioepitoopeille (tai kohdille, joihin liittyy alayksiköiden välisiä kontakteja) eivät yleensä sovellu käytettäväksi Western blot -menetelmässä.

Proteiinin siirron jälkeen kalvoa inkuboidaan peräkkäin tutkittavalle proteiinille spesifisten vasta-aineiden kanssa ja sitten primääristen vasta-aineiden Fc-fragmenteille spesifisten sekundaaristen vasta-aineiden kanssa, jotka on konjugoitu entsyymi- (tai johonkin muuhun) leimaan (kuva 1).

1 A). Siinä tapauksessa, että tutkitulle antigeenille spesifiset primaariset vasta-aineet konjugoidaan suoraan leiman kanssa, sekundäärisiä vasta-aineita ei tarvita (kuvio 1 B). Tutkitun proteiinin lokalisaatiokohdassa muodostuneet immuunikompleksit "ilmentyvät" kromogeenisen substraatin avulla (leimatyypistä riippuen).

Menetelmän herkkyys ja spesifisyys riippuu suuresti siitä, mitä vasta-aineita tutkimuksessa käytetään.

Käytettyjen vasta-aineiden on oltava spesifisiä ainutlaatuiselle aminohapposekvenssille, joka on spesifinen vain tutkittavalle proteiinille. Muuten vasta-aineiden vuorovaikutus (etenkin karkeiden proteiiniuutteiden tapauksessa) useiden proteiinimolekyylien kanssa on mahdollista, mikä puolestaan ​​​​johtaa useiden värillisten juovien ilmestymiseen kalvolle.

Tutkittavan proteiinin tunnistaminen tässä tapauksessa on usein vaikeaa tai jopa mahdotonta.

Toinen tärkeä tekijä, joka on pidettävä mielessä vasta-aineita valittaessa, on affiniteetti. Mitä korkeampi käytettyjen vasta-aineiden affiniteetti on, mitä kirkkaammin ja kirkkaammin proteiinijuovat värjäytyvät, sitä suurempi on menetelmän herkkyys. Korkean affiniteetin vasta-aineita käytettäessä voidaan saavuttaa 1 ng:n herkkyys tai jopa suurempi.

Kalvoon sitoutuneen antigeenin ja vasta-aineiden vuorovaikutuksen tuloksen visualisoimiseksi käytetään sekundaarisia vasta-aineita, jotka on konjugoitu aineisiin, jotka kykenevät antamaan tietyn signaalin tietyissä olosuhteissa.

Yleensä sellaisena aineena käytetään entsyymiä (peroksidaasia tai fosfataasia), jonka reaktiotuotteella on väriä ja se saostuu kalvolle liukenemattoman sakan muodossa.

Tässä menetelmässä on myös mahdollista käyttää fluoresoivia leimoja.

Riisi. 1. Kaavio tutkitun proteiinin immunokemiallisesta värjäyksestä: A - käyttämällä entsyymileimaan konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita; B - primaarinen vasta-aine on suoraan konjugoitu entsyymileiman kanssa.

Protokolla:

I. Geelin ja kalvon valmistus ja proteiinin sähkösiirto

Polyakryyliamidigeeli asetettiin elektroforeesin jälkeen hauteeseen, jossa oli blottauspuskuria (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glysiini, 10 % etanoli).

Kaksi arkkia suodatuspaperia, jotka on leikattu imupaperikasetin muotoon ja kostutettu imupuskurilla, asetetaan kasetin sille osalle, joka on anodia päin. Sitten suodatinpaperin päälle asetetaan samalla puskurilla esikostutettu nitroselluloosakalvo varmistaen, ettei kalvon ja paperin välissä ole ilmakuplia.

Sen jälkeen geeli tulee asettaa varovasti kalvolle kiinnittäen jälleen erityistä huomiota ilmakuplien puuttumiseen geelin ja kalvon välissä. Sandwich viimeistelee kaksi kerrosta kostutettua suodatinpaperia, jotka asetetaan geelin pinnalle (kuva 2). Saatu sandwich kiinnitetään kasettiin ja asetetaan elektrodien väliin siten, että kalvo on anodia päin.

Riisi. 2. Kaavio proteiinien sähkösiirrosta kalvoon.

II. sähkösiirto

Proteiinien sähkösiirto nitroselluloosakalvolle suoritetaan puskurissa, joka sisältää 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glysiiniä, 10 % etanolia, 30–50 minuutin ajan vakiojännitteellä 100 V.

Sähkösiirtoaika riippuu siirrettävien proteiinien koosta, mitä suurempi proteiini, sitä kauemmin sähkösiirto kestää. Sähkökuljetuksen laatu ja proteiinivyöhykkeiden järjestys arvioitiin värjäämällä nitroselluloosakalvo 0,3 % Ponceau S:llä 1 % etikkahapossa. Ennen immunovärjäystä kalvo tulee pestä useita kertoja lievästi emäksisellä vesipitoisella Tris-liuoksella proteiineihin sitoutuneen väriaineen poistamiseksi.

III. Nitroselluloosakalvolle immobilisoitujen proteiinien immunokemiallinen värjäys

Epäspesifisten vasta-aineen sitoutumiskohtien estämiseksi kalvoa inkuboidaan jatkuvasti sekoittaen huoneenlämpötilassa 30 minuuttia PBST:ssä (paremman estämisen vuoksi voidaan käyttää PBST-liuosta, joka sisältää 10 % rasvatonta maitojauhetta).

Blokkaamisen jälkeen kalvoa inkuboidaan tunnin ajan huoneenlämpötilassa jatkuvasti sekoittaen PBST:ssä, joka sisältää 1-10 μg/ml spesifisiä vasta-aineita.

Vasta-aineiden optimaalinen pitoisuus valitaan empiirisesti ja riippuu vasta-aineiden vuorovaikutuksen affiniteetista antigeenin kanssa.

Inkuboinnin lopussa kalvo pestiin 5 kertaa PBST:llä ja siirrettiin piparjuuriperoksidaasilla konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden liuokseen. Konjugaatin laimennuksen ilmoittaa yleensä valmistaja pakkauksessa tai tutkija valitsee sen empiirisesti. Inkuboi kalvoa sekundaaristen vasta-aineiden liuoksessa 1 tunnin ajan jatkuvasti sekoittaen.

Perusteellisen pesun (vähintään 5-6 puskurinvaihtoa) jälkeen PBST-kalvo siirretään kromogeeniseen substraattiliuokseen, joka sisältää 3 mg diaminobentsidiiniä (DAB) ja 10 µl 30-prosenttista vetyperoksidia 10 ml:ssa 0,1 M Tris-HCl:a, pH 7,6. .

Inkubointi suoritetaan sekoittaen 5 - 10 minuuttia. Substraatin kanssa inkuboinnin päätyttyä kalvo tulee pestä PBST:llä, kuivata suodatinpaperilla blotamalla ja tehdä välittömästi sähköinen kopio skannaamalla värillisenä. Jos kalvo kuivuu kokonaan, värjätyt proteiiniraidat haalistuvat ja kuva on vähemmän kirkas ja kontrastinen.

Huomautus: DAB on myrkyllistä ja mahdollisesti syöpää aiheuttava. Työskentele vain kumihansikkailla!