Combibest-testin käyttö hiv-diagnoosissa. Nykyaikaiset menetelmät HIV-infektion diagnosointiin Video: opetuselokuva MGMU im.

Patentin RU 2283497 omistajat:

Keksintö liittyy biotekniikan ja lääketieteen alaan. Entsyymi-immunotestijärjestelmä ensimmäisen ja toisen tyypin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) vasta-aineiden kirjon tunnistamiseksi, ryhmän O ensimmäisen tyypin ja ensimmäisen tyypin p24 ihmisen immuunikatoviruksen antigeenin tunnistamiseksi sisältää immunosorbenttipohjaisen ihmisen immuunikatoviruksen antigeeneihin, jotka edustavat gp41:tä (env HIV-1 ja HIV-2 ryhmä O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), vasta-aineita HIV-antigeenille 1 p24 , ja havaitsemisreagenssit, kun taas edellä mainitut HIV-antigeenit ja HIV-vasta-aineet sorboidaan levyjen eri kuoppiin entsyymi-immunomääritystä varten, ja sorptioon käytetään 96-kuoppaisia ​​polystyreenilevyjä, jotka ovat kokoonpuristuvia tai ei-puristuvia. Keksintö saa aikaan tulosten arvioinnin lisääntyneen herkkyyden, yksinkertaistamisen ja subjektiivisuuden poissulkemisen. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 ill.

Keksintö liittyy biotekniikan ja lääketieteen alaan. Käyttö: ihmisen immuunikatoviruksen 1 ja 2, HIV 1 ryhmän O ja HIV 1 p24 antigeenin proteiineihin kohdistuvien spesifisten vasta-aineiden kaikkien luokkien erilainen havaitseminen.

Essence: entsyymi-immunomääritystestijärjestelmän hankkiminen kaikkien luokkien vasta-aineiden spektrin tunnistamiseksi yksittäisille proteiineille ja HIV 1 ja 2, HIV 1 ryhmän O ja HIV 1 p24 antigeenille veriseerumissa (plasmassa), immunoglobuliinien ja verituotteiden tunnistamiseksi. vasta-aineiden kirjo HIV 1 ja 2, HIV 1 ryhmän O, HIV 1 p24 -antigeenin havaitseminen ja positiivisten tai määrittelemättömien seulontatulosten vahvistaminen vasta-aineille HIV 1 ja 2, HIV 1 ryhmän O ja HIV 1 p24 antigeenille.

KEKSINNÖN KUVAUS

HIV-infektion laboratoriodiagnoosi perustuu kolmeen osa-alueeseen: a) HIV:n ja sen komponenttien indikaatio; b) HIV-vasta-aineiden havaitseminen; c) immuunijärjestelmän muutosten määrittäminen. Olemassa olevista laboratoriodiagnostiikan menetelmistä serologiset menetelmät ovat yleisimpiä - virusantigeenien vasta-aineiden havaitseminen.

HIV-infektion vasta-aineiden havaitsemiseen käytetään pääasiassa entsyymikytkentäistä immunosorbenttimääritystä (ELISA) ja immunoblottausta (IB). ELISA perustuu virusantigeenien immobilisointiin maljoille, jotka sitovat potilaan vasta-aineita, ja antigeeni-vasta-ainekompleksi havaitaan käyttämällä piparjuuriperoksidaasilla konjugoituja hiiren monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen immunoglobuliineille G ja M. Menetelmä on melko spesifinen ja herkkä ja mahdollistaa virusspesifisten vasta-aineiden havaitsemisen 95 %:lla potilaista. Loput 5 % tapauksista esiintyvät infektion alkuvaiheessa, jolloin veriseerumissa on vielä vähän vasta-aineita, tai taudin loppuvaiheessa, jolloin elimistö ei enää pysty syntetisoimaan vasta-aineita jyrkän verenkierron vuoksi. immuunijärjestelmää. Myös väärät positiiviset ELISA-tulokset ovat mahdollisia, pääasiassa potilailla, joilla on autoimmuuni- ja onkologisia sairauksia sekä Eshptein-Barr-viruksen aiheuttamia infektioita. Tässä tapauksessa on olemassa vasta-aineiden ristireaktio reumatekijää, Epstein-Barr-virusta tai antigeenisiä determinantteja vastaan, jotka ovat samankaltaisia ​​kuin tärkeimpien hluokkien 1 ja 2 proteiineja (HLA-4 ja DQW3) ja jotka pystyvät sitoutumaan HIV-antigeenit. Vääriä positiivisia tuloksia nähdään usein raskaana olevilla naisilla ja vanhuksilla. Hemolyysi, lipemia ja seerumien bakteerikontaminaatio voivat myös olla syynä epäluotettaviin tuloksiin.

Tässä suhteessa on ehdotettu useita menetelmiä, joita on käytetty vasta-aineiden havaitsemisen tulosten spesifisyyden testaamiseen. Näistä menetelmistä yleisimmin käytetty reaktio on "immuuniblot" muunnelmassa "Western Blot". Menetelmän ydin on seuraava: ensimmäisessä vaiheessa HIV-proteiinit erotetaan molekyylipainon mukaan käyttämälläesia. Tätä seuraa elektroforeettinen siirto polyakryyliamidigeelistä nitroselluloosakalvon pinnalle. Tällä tavalla siirretyt antigeenit havaitaan kalvolla epäsuoralla analyysillä: kalvoa inkuboidaan testimateriaalin kanssa; sisältämät vasta-aineet sitoutuvat HIV-antigeeneihin, jotka on siirretty nitroselluloosakalvolle, sitten kalvoliuskoja inkuboidaan konjugaatin kanssa; kun muodostuu antigeeni-vasta-ainekompleksi, konjugaatti kiinnittyy siihen, konjugaatista pesun ja substraatin kanssa inkuboinnin jälkeen tapahtuu niiden nitroselluloosaosien värjäytyminen, joissa antigeeni-vasta-aine-konjugaattikompleksin muodostuminen tapahtui. Piirustus näyttää esimerkkejä positiivisista, heikosti positiivisista ja negatiivisista immunoblot-tuloksista.

HIV-1- ja HIV-2-tartunnan saaneiden henkilöiden seerumista löytyy vasta-aineita seuraaville proteiineille (p) ja glykoproteiineille (gp): Taulukko A.

Taulukossa B on esitetty WHO:n ja Venäjän AIDSin ehkäisy- ja valvontakeskuksen suosittelemat immuuniblottauksen tulosten arviointikriteerit.

WHO:n kriteerien mukaan seerumit katsotaan positiivisiksi, jos IB-menetelmällä havaitaan vasta-aineita kahdelle HIV-1-vaippaproteiinille. Jos tapahtuu reaktio vain yhden vaippaproteiinin (gp160, gp120, gp41) kanssa yhdessä muiden proteiinien kanssa tapahtuvan reaktion kanssa tai ilman sitä, tulosta pidetään kyseenalaisena. Venäjän federaation aidsin ehkäisyä ja valvontaa käsittelevän terveysministeriön liittovaltion tieteellisen ja metodologisen keskuksen mukaan seerumit voidaan tulkita positiivisiksi jopa vasta-aineiden läsnä ollessa vain yhdelle vaippaproteiinille.

P24-antigeenin vasta-aineiden havaitseminen voi osoittaa serokonversion alkamisajankohdan, koska tämän proteiinin vasta-aineet ilmaantuvat ensin. Positiiviset reaktiot gag- ja pol-proteiineilla ilman reaktiota env-proteiinien kanssa voivat kuvastaa varhaisen serokonversion vaihetta sekä osoittaa HIV-2-infektion tai epäspesifisen reaktion.

Immunoblottauksen käytöllä asiantuntijamenetelmänä HIV:n diagnosoinnissa on useita merkittäviä haittoja:

1. HIV 1:n p24-antigeenin havaitsemisen vahvistamisen mahdottomuus käytettäessä testejä, jotka määrittävät samanaikaisesti HIV-antigeenin ja vasta-aineet, mikä tekee seulontatestien käyttämisen antigeenin ja vasta-aineiden samanaikaiseen havaitsemiseen epätarkoituksenmukaiseksi (merkityksettömäksi) HIV:lle (Venäjän federaation terveysministeriön määräys nro 292, 30. heinäkuuta 2001: "luovuttajien tutkimiseksi verensiirtoasemilla on käytettävä testijärjestelmiä, jotka havaitsevat sekä antigeenin että HIV-vasta-aineet").

2. Vain IgG-luokan vasta-aineiden havaitseminen. On mahdotonta täysin vahvistaa positiivisia tuloksia, jotka on saatu 3. ja 4. sukupolven testeillä (IgG- ja IgM-vasta-aineiden havaitseminen).

3. Testituloksen tulkinnan subjektiivisuus, erityisesti "epävarmojen" ja "epävarmojen" tulosten tapauksessa ja serokonversion alkuvaiheissa (näissä tapauksissa nitroselluloosakalvojen havaittavissa olevat juovat ovat sumeita, tuskin näkyviä paljaalla silmällä , ja eri henkilöt arvioivat usein erimielisyyksiä).

4. Analyysin tulosten automaattisen kvantitatiivisen arvioinnin mahdottomuus.

5. Alempi herkkyys verrattuna ELISAan.

6. Varastoinnin hauraus (varastoinnin aikana nitroselluloosakalvon nauhat haalistuvat, eikä se voi olla objektiivinen vahvistus HIV:n havaitsemisesta tai havaitsematta jättämisestä kiistanalaisissa tapauksissa).

7. Vaikeus reaktion ja varastoinnin asettamisessa (nitroselluloosakalvonauhat ovat erittäin hauraita ja rikkoutuvat usein).

8. IS-sarjojen korkea hinta.

Tunnettu reagenssi, joka on sarja saman patogeenin, mukaan lukien HIV:n, antigeenien ja vasta-aineiden samanaikaiseen määritykseen (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Testijärjestelmää, joka mahdollistaisi HIV-infektion diagnosoinnin eri vaiheissa, ei kuitenkaan julkistettu.

Esillä olevan keksinnön tavoitteena on saada aikaan testijärjestelmä, jolla voidaan varmistaa HIV 1:n ja 2:n, HIV 1 -ryhmän O ja HIV 1:n p24-antigeenin vasta-aineiden seulontatestien positiiviset tai epäilyttävät tulokset käyttämällä testejä samanaikaiseen HIV:n havaitsemiseen. antigeenejä ja vasta-aineita.

Ehdotettu tekninen ratkaisu saavutetaan entsyymi-immunomääritystestijärjestelmällä, jolla tunnistetaan ensimmäisen ja toisen tyypin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) vasta-ainespektri, ryhmän O ensimmäinen tyyppi ja ihmisen immuunikatoviruksen p24-antigeeni. ensimmäisen tyypin p24, tunnettu siitä, että se sisältää immunosorbentin, joka perustuu antigeeneihin ihmisen immuunikatovirus, joita ovat gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 ryhmä O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), vasta-aineet HIV-antigeenille 1 p24 ja detektioreagenssit, jolloin edellä mainitut HIV-antigeenit ja HIV-vasta-aineet adsorboidaan levyjen eri kuoppiin entsyymi-immunomääritystä varten.

Lisäksi sorptioon käytetään 96-kuoppaisia ​​polystyreenikokoisia tai ei-kokoonpuristuvia levyjä entsyymi-immunomääritystä varten.

Esillä olevalla keksinnöllä saavutettu tekninen tulos on mahdollisuus vahvistaa positiiviset tulokset vasta-aineille HIV 1 ja 2, HIV 1 ryhmän O ja HIV 1 p24 antigeenille, korkea herkkyys, mahdollisuus tulosten automaattiseen tulkintaan, mikä eliminoi arviointi, testin suorittamisen helppous, vähemmän kuin olemassa olevilla IS-sarjoilla.

Tämä tekninen ratkaisu eroaa tunnetuista:

1. Käytä kiinteän faasin kantajalevynä immunologisiin reaktioihin.

2. P 24 HIV:n vasta-aineiden ja HIV-antigeenisarjan samanaikainen käyttö sorbenttina.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavalla esimerkillä.

Kehitetyn testijärjestelmän "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" aktiivinen periaate on:

Immunosorbentti - rekombinanttiantigeenit, jotka ovat samanlaisia ​​kuin HIV-1:n rakenneproteiinit: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 ryhmä O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) ja monoklonaalinen hiiren vasta-aineet HIV 1(p24) -antigeenille adsorboituna erikseen polystyreenilevyn suikaloille.

Immunosorbenttien valmistukseen:

1. HIV-1 gp41 on proteiini, jota tuottaa E. Coli -kanta nro AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 on proteiini, jota tuottaa E. Coli -kanta nro AHIV 109.

3. HIV-1 p24 - E. Coli -kannan nro AHIV 105 tuottama proteiini.

4. HIV-1 p31 - E. Coli -kannan nro AHIV 108 tuottama proteiini.

5. HIV-2 p36 - E. Coli -kannan nro AHIV 106 tuottama proteiini.

Konjugaatti 1, lyofilisoitu tai nestemäinen, hiiren monoklonaaliset vasta-aineet HIV1 p24 -antigeenille, konjugoitu biotiiniin.

1. Konjugaatti 2, lyofilisoitu tai neste, seos rekombinanttiantigeenejä, jotka ovat samanlaisia ​​kuin HIV-1:n rakenneproteiinit: gp41 (env HIV-1 ja HIV 1 ryhmä O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (po1 ); HIV-2: gp36 (env) konjugoitu biotiinin kanssa;

2. Konjugaatit 3, 4 - lyofilisoitu tai nestemäinen - streptavidiini, joka on leimattu piparjuuriperoksidaasilla;

Esitutkimusten aikana valittiin testijärjestelmän suunnittelu, sen komponenttien valmistustekniikka ja optimoitiin olosuhteet entsyymi-immunomäärityksen suorittamiselle.

Kun ELISA asetetaan testijärjestelmään "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", 25 μl konjugaattia-1 lisätään levyn kuoppiin, joissa on adsorboituneet p24:n vasta-aineet, ja kuopat, joissa on adsorboituja antigeenejä - 25 µl konjugaattia-2. Reaktiokaavio on esitetty alla. Seuraavaksi jokaiseen kuoppaan lisätään 25 μl testinäytettä. Samanaikaisesti antigeeneja sisältävissä kuopissa väri muuttuu oranssista vaaleanpunaiseksi ja vasta-aineita sisältävässä kaivossa vihreästä harmaaseen. Seosta inkuboidaan 45 minuuttia 37 °C:ssa ravistelijassa (tai 1 tunti 37 °C:ssa termostaatissa). Sitten ilman pesua tabletin kuoppiin lisätään 50 μl konjugaattia 3 p24-antigeenin määrittämistä varten ja 50 μl konjugaattia 4 lisätään kuoppiin vasta-aineiden määrittämiseksi. Kun on inkuboitu 20 minuuttia 37 °C:ssa ravistelijassa (tai 30 minuuttia 37 °C:ssa termostaatissa), levy pestään ja kehitetään substraattiseoksella. Kokonaisreaktioaika 1 tunti 25 minuuttia (tai 1 tunti 50 minuuttia). Testinäytteessä oleva p24-antigeeni sitoutuu p24:n monoklonaalisiin vasta-aineisiin, ja spesifiset vasta-aineet muodostavat kompleksin rekombinanttiantigeenien kanssa levyllä. Tuloksena oleva immuunikompleksi anti-p24 p24:n kanssa havaitaan anti-p24-biotiinikonjugaateilla, sitten streptavidiini-peroksidaasilla, ja Ag-HIV:n immuunikompleksit At-HIV:n kanssa havaitaan Ag-biotiinikonjugaatilla ja sitten streptavidiini-peroksidaasilla. .

Reaktion asettamiskaavio.

Tulosten huomioiminen suoritetaan spektrofotometrisesti kahdella aallonpituudella: 450/620-680 nm instrumentin ollessa asetettuna "ilmalle". Otetaan huomioon tulokset yhdellä aallonpituudella 450 nm.

Analyysin tulokset otetaan huomioon, jos optisen tiheyden (OD) keskiarvot kaivoissa, joissa on K-, ovat enintään 0,2, kaivoissa, joissa on K+ - vähintään 1,0. OP-kritiikki. lasketaan kaavalla:

OP-kritiikki. gp41 = vrt. arvo OP K-(gp41)+0,15

OP-kritiikki. gp120 = vrt. arvo OP K-(gp120)+0,15

OP-kritiikki. p24 = vrt. arvo OP K-(р24)+0,15

OP-kritiikki. p31 = vrt. arvo OP K-(31)+0,15

OP-kritiikki. gp36 = vrt. arvo OP K-(gp36)+0,15

OP-kritiikki. Ag p24 = vrt. arvo OD to- (Ag p24)+0,04

jossa 0,15 ja 0,04 ovat kertoimia, jotka on määritetty valmistajan tilastollisen käsittelyn menetelmällä. Testijärjestelmän kehittämisessä käytettiin seuraavia:

1. Veriseeruminäytteet terveiltä luovuttajilta (n=610).

2. Veriseeruminäytteet potilailta, joilla on erilaisia ​​infektiosairauksia, joihin ei liity HIV:tä (ARI, keuhkokuume, tonsilliitti, herpeettiset ja sytomegalovirusinfektiot, kuppa, klamydia, virushepatiitti A, B ja C (n=224)).

3. Veriseeruminäytteet potilailta, joilla on erilaisia ​​ei-tarttuvia sairauksia - vammat, sydän- ja verisuonijärjestelmän sairaudet, onkologia (n=35).

4. Raskaana olevien naisten seeruminäytteet (n=40).

5. Veriseeruminäytteet, seropositiiviset ELISA:ssa ja vahvistettu immunoblotilla (n=428).

6. Seeruminäytteet, joiden tulos on positiivinen entsyymi-immunomääritystestijärjestelmissä HIV 1,2 -vasta-aineiden ja p24-antigeenin samanaikaista määritystä varten, ja määrittelemätön immunoblot-tulos (n=123).

7. Sisäinen paneeli seerumeista, jotka sisältävät ja eivät sisällä HIV 1.2:n vasta-aineita, testattu Venäjän federaation terveysministeriön rekisteröimillä entsyymi-immunomäärityksillä ja immunoblotilla (n=21).

8. Standardi "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Ranska, kat. 72217, joka on viruslysaatista saatu antigeeni.

9. Yrityksen sisäinen standardi. Näyte, joka sisälsi p24-antigeeniä pitoisuutena 200 pg/ml, saatu viruslysaatista ja titrattu "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" -yhtiön "BIO RAD", Ranska, kat. nro 72217.

10. Standardipaneeli seerumeita, jotka sisältävät vasta-aineita ensimmäisen tyypin ihmisen immuunikatovirukselle (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

11. Standardipaneeli seerumeita, jotka sisältävät vasta-aineita toisen tyypin ihmisen immuunikatovirukselle (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

12. Standardipaneeli seerumeita, jotka eivät sisällä vasta-aineita ensimmäisen ja toisen tyypin ihmisen immuunikatovirukselle (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

Testijärjestelmän herkkyyden arviointi p24-antigeenin havaitsemiseksi suoritettiin käyttämällä standardia "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", yrityksen sisäistä standardia. Käyttämällä sisäistä standardia valmistettiin 4 peräkkäistä 2-kertaista laimennusta 40 pg/ml - 5 pg/ml laimentimena normaalilla luovuttajan plasmalla, jossa ei ollut vasta-aineita HIV 1, 2:lle. Pienin määrä havaittavaa antigeeniä otettiin herkkyyskriteeriksi. Saadut tiedot on esitetty taulukossa 1.

Testijärjestelmän herkkyyden arvioimiseksi spesifisten vasta-aineiden havaitsemiseksi käytettiin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV 1, 2) vasta-aineita sisältäviä näytepaneeleja (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-28-216- 02P (HIV 2) s.003).

Saadut tiedot on esitetty taulukoissa 3, 4.

Testijärjestelmän "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" diagnostista tehokkuutta verrattiin testijärjestelmiin "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV". 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostics of HIV Uniform II Ag/Am" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1.2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Tätä tarkoitusta varten sisäpaneelin seeruminäytteitä testattiin kaikissa osoitetuissa testeissä. Taulukossa 5 esitetyt tulokset osoittavat "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1:n" korkean diagnostisen tehokkuuden.

Testijärjestelmän "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" herkkyystutkimukset suoritettiin myös immunoblotissa HIV-positiivisiksi vahvistettujen potilaiden veriseerumilla. Näistä seerumeista testattiin yhteensä 428 näytettä. On saatu useita vaihtoehtoja erilaisten HIV-proteiinien ja p24-antigeenien vasta-aineiden havaitsemiseksi. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

Kun testattiin HIV 1 -positiivisia näytteitä, 3 % seerumeista osoitti positiivisen reaktion gp36:lla (env HIV 2). MP/OPcrit näissä näytteissä ei ylittänyt 2,0. Tietomme HIV 1:n (gp41) ja HIV 2:n (gp36) ulkovaippaproteiinien ristireaktiivisuudesta ovat yhdenmukaisia ​​kirjallisuustietojen kanssa.

Tulosten tulkinta

"DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" -testin HIV-positiivisten seerumien ja näytteiden testaus standardi- ja sisäisistä paneeleista mahdollisti tämän testin tulosten tulkintakriteerien kehittämisen. Suositellut kriteerit on esitetty taulukossa 7.

Näiden kriteerien perusteella kaikki HIV-positiiviset seeruminäytteet (n=428) tunnistettiin positiivisiksi "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1" -tutkimuksessa. Standardipaneelin 16 näytteestä, jotka sisälsivät HIV-vasta-aineita 1, 14 määritettiin positiivisiksi ja 2 määrittämättömiksi. Kaikki 8 näytettä standardipaneelista, jotka sisälsivät vasta-aineita HIV 2:ta vastaan, määritettiin positiivisiksi. Sisäpaneelin 10 näytteestä, jotka sisälsivät HIV-vasta-aineita, 1 tunnistettiin positiivisiksi ja 3 määrittämättömiksi.

Testijärjestelmän "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Agr24 HIV 1" herkkyystutkimukset suoritettiin myös potilaiden veriseerumeilla, joiden tulos oli positiivinen entsyymi-immunomääritysjärjestelmissä, jotka havaitsevat samanaikaisesti vasta-aineet ja p24-antigeenin, ja epämääräinen immunoblotissa. Yhteensä 123 tällaista näytettä testattiin. Tiedot on esitetty taulukossa 8.

Testattaessa seerumeita määrittelemättömällä immunoblot-tuloksella (n=123) "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPEKTRI+AGr24 HIV 1" -tutkimuksessa 72 näytettä (58,5 %) osoitti positiivisen tuloksen. Näistä 26 seerumia (21,1 %) on positiivisia vain p24:lle, 20 (16,3 %) - vain vasta-aineille, 16 (13 %) - p24:lle, jossa on vasta-aineita jollekin proteiineille, 10 (8,1 %) - p24:lle ja vasta-aineita kahdelle tai useammalle proteiinille. Siten pelkkien vasta-aineiden testaus (ei p24:n havaitsemista) johtaisi siihen, että 30 näytettä (24,4 %) olisivat positiivisia. P24-antigeenin havaitseminen testissä mahdollisti 42 lisänäytettä (34,1 %) määrittämisen positiiviseksi.

Testijärjestelmän spesifisyyden arvioimiseksi käytettiin standardipaneelia seerumeita, jotka eivät sisältäneet vasta-aineita HIV 1, 2:lle (n = 20); veriseeruminäytteet terveiltä luovuttajilta (n=610), veriseeruminäytteet potilailta, joilla on erilaisia ​​tartuntatauteja (n=224), jotka eivät liity HIV:hen; veren seeruminäytteet potilailta, joilla on erilaisia ​​ei-tarttuvia sairauksia - vammat, sydän- ja verisuonijärjestelmän sairaudet, onkologia (n=35); raskaana olevien naisten seeruminäytteet (n=40). Kaikkiaan testattiin 929 näytettä. Yksi näyte terveiden luovuttajien veriseerumista osoitti väärän positiivisen tuloksen - gp41- ja p24-vasta-aineita havaittiin. 7 veriseeruminäytettä terveiltä luovuttajilta ja 2 veriseeruminäytettä potilailta, joilla oli tartuntatauteja, jotka eivät liity HIV:hen, osoittivat väärän positiivisen tuloksen p24:lle.

Testijärjestelmän spesifisyyden arvioimiseksi käytettiin negatiivisten näytteiden standardipaneelia (OSO 42-28-214-94-02p, s. 009). Spesifisyys oli 100 %.

Siten tutkimukset ovat osoittaneet, että testijärjestelmän "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" spesifisyys on 99 % tutkittaessa veriseeruminäytteitä normaaleista luovuttajista ja potilaista, joilla on erilaisia ​​tarttuvia ja somaattiset sairaudet.

Saadut tiedot osoittavat kehitetyn testijärjestelmän "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" korkean diagnostisen tehokkuuden. Testijärjestelmällä voidaan havaita vasta-aineita yksittäisille HIV-tyyppien 1 ja 2 proteiineille ja HIV1 p24 -antigeenille positiivisen seulontatuloksen varmistamiseksi vasta-aineita havaitsevilla testijärjestelmillä tai testijärjestelmillä, jotka havaitsevat samanaikaisesti vasta-aineita ja HIV1 p24 -antigeenin. Testijärjestelmää voidaan käyttää vaihtoehtoisena immunoblot-testinä positiivisten tulosten vahvistamiseen sekä HIV:n ja p24-antigeenin vasta-aineiden dynamiikan tutkimiseen infektion eri vaiheissa.

TESTIN EDUT

1. Vahvistava entsyymi-immunomäärityslevyformaatti

2. Varmistustesti, jossa yhdistetään HIV 1, 2 -vasta-ainespektri ja HIV 1 p24 -antigeeni

3. Kaikkien Ig-luokkien vasta-aineiden havaitseminen

4. Herkkyys p24:n havaitsemiseksi on vähintään 5 pg/ml

5. Vähentää epämääräisiä tuloksia verrattuna immunoblotiin

6. Analyysiaika - 1 tunti 25 minuuttia (immunoblotti - 3 - 20 tuntia)

7. Kaikkien komponenttien ja näytteiden käyttöönoton visuaalinen arviointi.

1. ELISA-testijärjestelmä ensimmäisen ja toisen tyypin ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) vasta-ainespektrin, ryhmän O ensimmäisen tyypin ja ensimmäisen tyypin p24 ihmisen immuunikatoviruksen p24-antigeenin havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää immunosorbentin, joka perustuu immuunikatoviruksen antigeeneihin gp41 (env HIV-1 ja HIV-2 ryhmä O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), vasta-aineita HIV-antigeeniin 1 p24 ja havaitsemisreagensseihin, kun taas edellä mainitut HIV-antigeenit ja HIV-vasta-aineet adsorboidaan levyjen eri kuoppiin entsyymi-immunomääritystä varten.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ELISA-testijärjestelmä, tunnettu siitä, että sorptioon käytetään 96-kuoppaisia ​​polystyreenistä kokoonpuristuvia tai ei-kokoonpainuvia levyjä entsyymi-immunomääritystä varten.

Hiv-tartunnan oikea-aikainen diagnosointi on erittäin tärkeä toimenpide, koska aikaisempi hoito voi pitkälti määrittää taudin jatkokehityksen ja pidentää potilaan elinikää. Viime vuosina tämän kauhean taudin havaitsemisessa on edistytty merkittävästi: vanhat testijärjestelmät korvataan edistyneemmillä, tutkimusmenetelmistä on tulossa helpommin saavutettavissa ja niiden tarkkuus kasvaa merkittävästi.

Tässä artikkelissa puhumme nykyaikaisista HIV-infektion diagnosointimenetelmistä, jotka ovat hyödyllisiä tietää tämän ongelman oikea-aikaisessa hoidossa ja potilaan normaalin elämänlaadun ylläpitämisessä.

HIV:n diagnosointimenetelmät

Venäjällä HIV-infektion diagnosoimiseksi suoritetaan standardimenettely, joka sisältää kaksi tasoa:

• ELISA-testijärjestelmä (seulonta-analyysi);
• immuuniblottaus (IB).

Myös muita diagnostisia menetelmiä voidaan käyttää:

• pikatestit.

ELISA-testijärjestelmät

Diagnoosin ensimmäisessä vaiheessa HIV-infektion havaitsemiseen käytetään seulontatestiä (ELISA), joka perustuu laboratorioissa luotuihin HIV-proteiineihin, jotka vangitsevat elimistössä infektion seurauksena muodostuvia spesifisiä vasta-aineita. Sen jälkeen kun ne ovat vuorovaikutuksessa testijärjestelmän reagenssien (entsyymien) kanssa, indikaattorin väri muuttuu. Lisäksi nämä värimuutokset käsitellään erikoislaitteilla, jotka määräävät suoritetun analyysin tuloksen.

Tällaiset ELISA-testit pystyvät näyttämään tuloksia muutaman viikon kuluessa HIV-tartunnan saamisesta. Tämä analyysi ei määritä viruksen läsnäoloa, mutta havaitsee vasta-aineiden tuotannon sitä vastaan. Joskus ihmiskehossa HIV-vasta-aineiden tuotanto alkaa 2 viikon kuluttua tartunnasta, mutta useimmilla ihmisillä ne tuotetaan myöhemmin, 3-6 viikon kuluttua.

ELISA-testejä on neljä sukupolvea, joilla on eri herkkyys. Viime vuosina on käytetty useammin III ja IV sukupolven testijärjestelmiä, jotka perustuvat synteettisiin peptideihin tai rekombinanttisiin proteiineihin ja joilla on suurempi spesifisyys ja tarkkuus. Niitä voidaan käyttää HIV-tartunnan diagnosoimiseen, HIV:n levinneisyyden seurantaan ja turvallisuuden varmistamiseen luovutetun veren testauksessa. III ja IV sukupolven ELISA-testijärjestelmien tarkkuus on 93-99 % (herkempiä ovat Länsi-Euroopassa valmistetut testit - 99 %).

ELISA-testin suorittamiseksi potilaan suonesta otetaan 5 ml verta. Viimeisen aterian ja analyysin välillä tulee olla vähintään 8 tuntia (yleensä se tehdään aamulla tyhjään vatsaan). Tällaista testiä suositellaan ottamaan aikaisintaan 3 viikon kuluttua väitetystä tartunnasta (esimerkiksi suojaamattoman yhdynnän jälkeen uuden seksikumppanin kanssa).

ELISA-testin tulokset saadaan 2-10 päivän kuluttua:

• negatiivinen tulos: osoittaa HIV-infektion puuttumisen eikä vaadi lähetettä asiantuntijalle;
• väärä negatiivinen tulos: voidaan havaita infektion varhaisessa vaiheessa (enintään 3 viikkoa), AIDSin myöhäisvaiheissa, joissa on vaikea immuunivaste ja väärä verenvalmistelu;
• väärä positiivinen tulos: se voidaan havaita joissakin sairauksissa ja väärän veren valmistelun yhteydessä;
• positiivinen tulos: viittaa HIV-infektioon, vaatii IB:n ja potilaan lähetteen AIDS-keskuksen erikoislääkärille.

Miksi ELISA-testi voi antaa vääriä positiivisia tuloksia?

ELISA-testin HIV-testin vääriä positiivisia tuloksia voidaan havaita väärän veren käsittelyn yhteydessä tai potilailla, joilla on seuraavat sairaudet:

• multippeli myelooma;
• Epstein-Barr-viruksen aiheuttamat tartuntataudit;
• tila jälkeen ;
• autoimmuunisairaudet;
• raskauden taustaa vasten;
• tila rokotuksen jälkeen.

Yllä kuvatuista syistä veressä voi olla epäspesifisiä ristiinreagoivia vasta-aineita, joiden tuotantoa ei ole provosoinut HIV-infektio.

Viime vuosina väärien positiivisten tulosten esiintymistiheys on vähentynyt merkittävästi, koska on käytetty III ja IV sukupolven testijärjestelmiä, jotka sisältävät herkempiä peptidi- ja rekombinanttiproteiineja (ne syntetisoidaan in vitro geenitekniikalla). Tällaisten ELISA-testien käytön jälkeen väärien positiivisten tulosten esiintymistiheys on vähentynyt merkittävästi ja on noin 0,02-0,5 %.

Väärä positiivinen tulos ei tarkoita, että henkilö on saanut HIV-tartunnan. Tällaisissa tapauksissa WHO suosittelee toista ELISA-testiä (pakollinen IV sukupolvi).

Potilaan veri lähetetään referenssi- tai välityslaboratorioon, jossa on merkintä "repeat", ja se testataan IV sukupolven ELISA-testijärjestelmällä. Jos uuden analyysin tulos on negatiivinen, ensimmäinen tulos tunnistetaan virheelliseksi (väärä positiivinen) eikä IB:tä suoriteta. Jos tulos on positiivinen tai epävarma toisen testin aikana, potilaalle on tehtävä IB 4-6 viikon kuluessa HIV-tartunnan vahvistamiseksi tai kumoamiseksi.

immuuniblottaus

HIV-infektion lopullinen diagnoosi voidaan tehdä vasta, kun immuuniblottaus (IB) on saatu positiiviseksi. Sen toteuttamiseen käytetään nitroselluloosaliuskaa, johon levitetään virusproteiineja.

Verinäytteet IB:tä varten otetaan laskimosta. Sitten se käy läpi erityiskäsittelyn ja sen seerumin sisältämät proteiinit erotetaan erityisessä geelissä varauksen ja molekyylipainon mukaan (manipulaatio suoritetaan erikoislaitteilla sähkökentän vaikutuksesta). Veriseerumigeelille laitetaan nitroselluloosaliuska ja blottaus ("blottaus") suoritetaan erityisessä kammiossa. Liuska käsitellään ja jos käytetyt materiaalit sisältävät HIV-vasta-aineita, ne sitoutuvat IB:n antigeenisiin vyöhykkeisiin ja näkyvät viivoina.

IB katsotaan positiiviseksi, jos:

• amerikkalaisten CDC-kriteerien mukaan - nauhassa on kaksi tai kolme riviä gp41, p24, gp120 / gp160;
• amerikkalaisen FDA:n kriteerien mukaan - nauhassa on kaksi riviä p24, p31 ja linja gp41 tai gp120 / gp160.

99,9 %:ssa tapauksista positiivinen IB-tulos viittaa HIV-infektioon.

Linjojen puuttuessa - IB on negatiivinen.

Kun linjoja tunnistetaan gp160:n, gp120:n ja gp41:n kanssa, IB on kyseenalainen. Tällainen tulos voidaan havaita, kun:

• onkologiset sairaudet;
• raskaus;
• säännölliset verensiirrot.

Tällaisissa tapauksissa on suositeltavaa suorittaa toinen tutkimus käyttämällä toisen yrityksen valmistamaa pakkausta. Jos tulos jää epäselväksi lisä-IB:n jälkeen, seuranta on tarpeen kuuden kuukauden ajan (IB suoritetaan 3 kuukauden välein).

polymeraasiketjureaktio

PCR-testillä voidaan havaita viruksen RNA. Sen herkkyys on melko korkea ja se mahdollistaa HIV-tartunnan havaitsemisen jo 10 päivän kuluttua tartunnasta. Joissakin tapauksissa PCR voi antaa vääriä positiivisia tuloksia, koska sen korkea herkkyys voi reagoida myös muiden infektioiden vasta-aineisiin.

Tämä diagnostiikkatekniikka on kallis, vaatii erikoislaitteita ja erittäin päteviä asiantuntijoita. Nämä syyt eivät salli sen suorittamista väestön massatestauksen aikana.

PCR:ää käytetään seuraavissa tapauksissa:

• HIV-tartunnan havaitsemiseksi vastasyntyneillä, jotka ovat syntyneet HIV-tartunnan saaneille äideille;
• HIV:n havaitsemiseksi "ikkunajaksossa" tai epäilyttävän IB:n tapauksessa;
• kontrolloida HIV-pitoisuutta veressä;
• luovuttajan veren tutkimiseen.

Ainoastaan ​​PCR-testillä HIV-diagnoosia ei tehdä, vaan se suoritetaan diagnostisena lisämenetelmänä riitojen ratkaisemiseksi.

Express-menetelmät

Yksi HIV-diagnostiikan innovaatioista on ollut pikatestit, joiden tulokset voidaan arvioida 10-15 minuutissa. Tehokkaimmat ja tarkimmat tulokset saadaan kapillaarivirtausperiaatteeseen perustuvilla immunokromatografisilla testeillä. Ne ovat erityisiä liuskoja, joille levitetään verta tai muita testinesteitä (sylkeä, virtsaa). HIV-vasta-aineiden läsnä ollessa 10-15 minuutin kuluttua testiin ilmestyy värillinen ja kontrollinauha - positiivinen tulos. Jos tulos on negatiivinen, vain kontrolliviiva tulee näkyviin.

Kuten ELISA-testeissä, pikatestien tulokset tulee vahvistaa IB-analyysillä. Vasta sen jälkeen voidaan tehdä HIV-infektion diagnoosi.

Kotitestaukseen on olemassa pikapakkauksia. OraSure Technologies1 (USA) -testi on FDA:n hyväksymä, saatavana ilman reseptiä, ja sitä voidaan käyttää HIV:n havaitsemiseen. Testin jälkeen, jos tulos on positiivinen, potilasta suositellaan tutkimukseen erikoistuneessa keskuksessa diagnoosin vahvistamiseksi.

FDA ei ole vielä hyväksynyt muita kotikäyttöön tarkoitettuja testejä, ja niiden tulokset voivat olla hyvin kyseenalaisia.

Huolimatta siitä, että pikatestit ovat tarkkuudeltaan huonompia kuin IV-sukupolven ELISA-testit, niitä käytetään laajalti väestön lisätestaukseen.

HIV-tartuntatestin voi tehdä missä tahansa poliklinikalla, Keskussairaalassa tai erikoistuneissa AIDS-keskuksissa. Venäjän alueella niitä pidetään ehdottoman luottamuksellisesti tai nimettömänä. Jokainen potilas voi odottaa saavansa lääketieteellistä tai psykologista neuvontaa ennen analyysiä tai sen jälkeen. HIV-testeistä joudut maksamaan vain kaupallisissa hoitolaitoksissa, ja julkisilla klinikoilla ja sairaaloissa ne tehdään maksutta.

Lue lisää siitä, kuinka voit saada HIV-tartunnan ja mitä myyttejä tartunnan saamismahdollisuuksista on olemassa

Kuvaus

Koulutus

Indikaatioita

Tulosten tulkinta

Kuvaus

Määritysmenetelmä Entsyymi-immunomääritys (ELISA).

Tutkittava materiaali Seerumi

Kotikäynti mahdollista

Yhdistetty HIV-tyypin 1 ja 2 vasta-aineiden ja HIV p24 -antigeenin havaitseminen, kvalitatiivinen testi.

Huomio. Positiivisten ja epäilyttävien reaktioiden tapauksessa tuloksen antamisen määräaikaa voidaan pidentää 10 työpäivään asti. HIV (ihmisen immuunikatovirus), joka aiheuttaa AIDSin (hankitun immuunikato-oireyhtymän), kuuluu retrovirusten perheeseen. Se tarttuu ihmisestä toiseen käyttämällä saastuneita neuloja ja ruiskuja suonensisäiseen huumeiden käyttöön tai terapeuttisiin toimenpiteisiin sekä sukupuoliyhteyden kautta, sekä hetero- että homoseksuaalisesti. Viruksen leviäminen voi tapahtua tartunnan saaneen veren ja verituotteiden siirron, elinten tai siemennesteen luovutuksen kautta sekä terveydenhuollon työntekijöille, jos he ovat loukkaantuneet tartunnan saaneista neuloista tai instrumenteista. HIV-tartunta on mahdollista tarttuessaan tartunnan saaneelta äidiltä lapselle (pystyreitti), vaikka nykyaikaiset ehkäisymenetelmät antiretroviraalista hoitoa käyttämällä voivat vähentää tämän riskin minimiin, jos kaikkia suosituksia noudatetaan.

Viruksen vuorovaikutusprosessi solun kanssa sisältää useita vaiheita: viruksen sitoutuminen soluun, sen vapautuminen kuoresta, tunkeutuminen sytoplasmaan, DNA-synteesi viruksen RNA:sta ja virus-DNA:n integroituminen genomiin isäntäsolusta. Tämän jälkeen infektion piilevä vaihe alkaa. Tässä tilassa proviraalinen DNA voi olla olemassa jonkin aikaa osoittamatta aktiivisuutta ja vaikuttamatta isäntäsolun elintärkeään aktiivisuuteen. Niin kauan kuin virusproteiineja ei ilmene, virukselle ei ole immuunivastetta. HIV-vasta-aineet, jotka kuvaavat kehon immuunivastetta, ilmaantuvat viruksen DNA:n aktivoitumisen ja viruksen aktiivisen lisääntymisen alkamisen jälkeen. Piilevän ajanjakson kesto riippuu useista tekijöistä, mukaan lukien organismin yksilölliset geneettiset ominaisuudet.

HIV-vasta-aineita saattaa ilmaantua toisesta viikosta tartunnan jälkeen; niiden pitoisuus kasvaa 2-4 viikossa ja säilyy useita vuosia. 90-95 %:lla tartunnan saaneista ne ilmaantuvat kolmen ensimmäisen kuukauden aikana tartunnan jälkeen, 5-9 %:lla - kolmen ja kuuden kuukauden aikana, 0,5-1 %:lla - myöhemmin.

Infektion ensimmäisinä viikkoina, jopa ennen vasta-aineiden ilmaantumista virukselle (eli ennen serokonversiota), HIV-antigeenien, mukaan lukien sen p24-kapsidiproteiinin, läsnäolo voidaan havaita seerumi- tai plasmanäytteistä. Myöhemmin, serokonversion jälkeen, siitä tulee yleensä havaitsematon.

Neljännen sukupolven yhdistelmämääritykset, kuten HIV Ag/Ab Combo -testi (Architect, Abbott), havaitsevat sekä HIV-tyypin 1 että tyypin 2 vasta-aineet ja HIV p24 -antigeenin, mikä mahdollistaa infektion varhaisen havaitsemisen. INVITRO-laboratoriossa HIV-infektion havaitsemiseen käytetyn seulontatestin erityispiirteitä ovat tutkimuksen korkea spesifisyys (> 99,5 %); Määrityksen 100 % herkkyys vasta-aineille, jotka ovat ominaisia ​​serokonversion ajanjaksolle, ja testin herkkyys p24-antigeenille on noin 18 pg/ml.

HIV:n laboratoriotestien menettelyä säännellään tiukasti Venäjän federaation terveysministeriön määräyksillä, ja se sisältää HIV-vasta-aineiden seulontatutkimuksen (seulontatutkimuksen) vaiheen käyttöön hyväksytyillä entsyymi-immunomääritysmenetelmillä (ELISA). , ja tarkemman (vahvistavan) tutkimuksen vaihe kaupungin AIDS-keskuksen laboratoriossa. On huomattava, että edes parhaat seulonta-ELISA-järjestelmät eivät takaa 100-prosenttista spesifisyyttä, toisin sanoen on olemassa mahdollisuus saada epäspesifisiä, vääriä positiivisia tuloksia, jotka liittyvät potilaan veriseerumin ominaisuuksiin. Tästä syystä positiivista ELISA-seulontatulosta ei välttämättä voida vahvistaa varmistustesteissä, minkä jälkeen potilaalle annetaan negatiivinen tai epämääräinen tulos. Jos varmistustutkimuksen tulos on epäselvä, testaus on toistettava dynamiikkana 2-3 viikon kuluttua.

Hiv-tartunnan laboratoriodiagnoosilla HIV-tartunnan saaneiden äitien lapsilla on omat ominaisuutensa. Äidin HIV-vasta-aineet (IgG-luokka) voivat kiertää heidän veressään jopa 18 kuukauden ajan syntymähetkestä. HIV-vasta-aineiden puuttuminen vastasyntyneillä ei tarkoita, että virus ei olisi läpäissyt istukan estettä. HIV-tartunnan saaneiden äitien lapsille tehdään laboratoriodiagnostinen tutkimus 36 kuukauden kuluessa syntymästä.

Koulutus

Erityistä valmistelua ei vaadita. Verinäyte on suositeltavaa ottaa aikaisintaan 4 tuntia viimeisen aterian jälkeen. Yleisiä suosituksia tutkimukseen valmistautumisesta löytyy. Testi HIV-antigeenin ja -vasta-aineiden havaitsemiseksi on suositeltavaa tehdä aikaisintaan kaksi viikkoa mahdollisen tartunnan jälkeen ja toistaa se kolmen ja kuuden viikon kuluttua, jos tulos on negatiivinen. Tutkimushakemusten rekisteröinti INVITRO LLC:ssä tapahtuu passin tai sitä korvaavan asiakirjan (muuttokortti, tilapäinen asuinpaikkarekisteröinti, varusmiestodistus, passitoimiston todistus passin katoamisen varalta, rekisteröintikortti) mukaan. hotellista). Esitetyn asiakirjan tulee sisältää tiedot väliaikaisesta tai pysyvästä rekisteröinnistä Venäjän federaation alueella ja valokuva. Passin (sen korvaavan asiakirjan) puuttuessa potilaalla on oikeus tehdä anonyymi hakemus biomateriaalin toimittamiseksi. Anonyymillä tutkimuksella hakemukselle ja asiakkaalta saadulle biomateriaalinäytteelle annetaan numero, jonka vain potilas ja tilauksen tehneet hoitohenkilöstö tietävät. ! Anonyymisti suoritettujen tutkimusten tuloksia ei voida toimittaa sairaalahoitoon, ammatillisiin tutkimuksiin, eikä niitä tarvitse rekisteröidä ORUIB:iin.

Indikaatioita tapaamiseen

• Imusolmukkeiden suureneminen useammalla kuin kahdella alueella.
• Leukopenia ja lymfopenia.
• Yöhikoilut.
• Äkillinen painonpudotus tuntemattomasta syystä.
• Yli kolme viikkoa jatkunut ripuli tuntemattomasta syystä.
• Kuume tuntemattomasta syystä.
• Raskauden suunnittelu.
• Preoperatiivinen valmistelu, sairaalahoito.
• Seuraavien infektioiden tai niiden yhdistelmien tunnistaminen: tuberkuloosi, selvä toksoplasmoosi, usein toistuva herpesvirusinfektio, sisäelinten kandidiaasi, toistuva herpes-zoster-neuralgia, mykoplasman, pneumokystien tai legionella-keuhkokuumeen aiheuttama.
• Kaposin sarkooma nuorena.
• Satunnaista seksiä.

Tulosten tulkinta

Testitulosten tulkinta sisältää tietoa hoitavalle lääkärille, eikä se ole diagnoosi. Tämän osan tietoja ei tule käyttää itsediagnostiikkaan tai itsehoitoon. Lääkäri tekee tarkan diagnoosin käyttämällä sekä tämän tutkimuksen tuloksia että tarvittavia tietoja muista lähteistä: historia, muiden tutkimusten tulokset jne.

Mittayksiköt riippumattomassa laboratoriossa INVITRO: kvalitatiivinen testi. Tulosten esitystapa: HIV 1:n ja 2:n sekä p24-antigeenin vasta-aineiden puuttuessa vastaus on "negatiivinen". Mikäli seulonta-ELISA-testissä havaitaan HIV-vasta-aineita tai antigeeniä, seeruminäyte lähetetään varmistus-immunoblot-menetelmällä analyysiin kaupungin AIDS-keskukseen, joka varmistaa positiiviset ja epämääräiset tulokset.

Positiivinen tulos:

1. HIV-infektio;
2. väärä positiivinen tulos, joka vaatii toistuvia tai lisätutkimuksia*);
3. tutkimus ei ole informatiivinen alle 18 kuukauden ikäisille lapsille, jotka ovat syntyneet HIV-tartunnan saaneille äideille.

*Seulontatestijärjestelmän HIV 1 ja 2 -vasta-aineiden ja HIV 1 ja 2 -antigeenin (HIV Ag/Ab Combo, Abbott) spesifisyyden reagenssien valmistaja arvioi olevan noin 99,6 % sekä väestössä että ryhmässä. potilaat, joilla on mahdollisia häiriöitä (infektiot HBV, HCV, vihurirokko, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. jne.), autoimmuunipatologiat (mukaan lukien nivelreuma, antinukleaaristen vasta-aineiden esiintyminen), raskaus , kohonneet IgG-, IgM-tasot, monoklonaalinen gammopatia, hemodialyysi, useat verensiirrot).

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA - englanti) astui käytännön lääketieteen elämään jonnekin muualle viime vuosisadan 60-luvulla. Hänen aloitustehtävänsä oli histologinen tutkimus tieteellisiin tarkoituksiin, joka kiteytyi elävän organismin solujen antigeenisen rakenteen etsimiseen ja tunnistamiseen.

ELISA-menetelmä perustuu spesifisten (AT) ja vastaavien antigeenien (AG) vuorovaikutukseen antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostumisen kanssa, joka havaitaan entsyymin avulla. Tämä tosiasia johti tutkijat ajatukseen, että menetelmää voidaan käyttää diagnostisiin tarkoituksiin eri luokkien spesifisten immunoglobuliinien tunnistamiseksi, jotka osallistuvat immuunivasteeseen tietylle infektiolle. Ja se oli läpimurto kliinisessä laboratoriodiagnostiikassa!

Menetelmää alettiin käyttää aktiivisesti vasta 80-luvun alussa ja sitten pääasiassa erikoistuneissa laitoksissa. Verensiirtokeskuksille ja -asemille, tartuntataudeille ja sukupuolisairaaloille toimitettiin ensimmäiset entsyymi-immunomääritysanalysaattorit, koska Afrikan mantereella syntynyt kauhea AIDS ilmestyi kanssamme ja liittyi välittömästi "vanhoihin" infektioihin, mikä vaati välittömiä toimenpiteitä diagnosointiin. ja etsii terapeuttisia lääkkeitä, jotka vaikuttavat häneen.

ELISA-menetelmän laajuus

Entsyymi-immunomäärityksen mahdollisuudet ovat todella laajat. Nyt on vaikea kuvitella, kuinka voidaan tehdä ilman tällaisia ​​​​tutkimuksia, joita käytetään kirjaimellisesti kaikilla lääketieteen aloilla. Näyttää siltä, ​​​​että ELISA voi tehdä onkologiassa? Osoittautuu, että voi. Ja paljon. Analyysin kyky löytää tietyntyyppisille pahanlaatuisille kasvaimille tyypillisiä markkereita on perustana kasvaimen varhaiselle havaitsemiselle, kun sitä ei pienen koon vuoksi vielä havaita muilla menetelmillä.

Nykyaikaisessa kliinisessä laboratoriodiagnostiikassa (CDL) on kasvainmarkkerien lisäksi merkittävä ELISA-paneelien arsenaali, jonka avulla diagnosoidaan erilaisia ​​patologisia tiloja (tartuntaprosessit, hormonaaliset häiriöt) ja seurataan lääkkeitä niiden vaikutuksen tunnistamiseksi potilaan kehon eikä muuten vain ihmisen. Tällä hetkellä entsyymi-immunomääritys on laajalti käytössä eläinlääkintäpalvelussa, koska "pienemmät veljemme" ovat myös alttiita monille sairauksille, joista he joskus kärsivät kovasti.

Tällä tavalla, ELISA voi herkkyytensä ja spesifisyytensä vuoksi määrittää suonesta otetusta verinäytteestä:

• Hormonaalinen tila (kilpirauhasen ja lisämunuaisen hormonit, sukupuolihormonit);
• Virus- ja bakteeri-infektion esiintyminen (HIV, B ja C, klamydia, kuppa ja sekä monet muut patogeenisten mikro-organismien aiheuttamat sairaudet);
• Jäljet ​​mikro-organismien elintärkeästä toiminnasta, joka aloitti tartuntaprosessin, joka päättyi onnistuneesti ja siirtyi immuunivasteen muodostumisvaiheeseen tälle taudinaiheuttajalle. Tällaiset jäljet ​​eli vasta-aineet jäävät monissa tapauksissa kiertämään veressä koko elämän ajan, mikä suojaa ihmistä uudelleentartunnalta.

Mikä on IF:n ydin?

Entsyymi-immunomääritysmenetelmän avulla voidaan määrittää paitsi itse patogeenin läsnäolo (laadullinen analyysi), myös sen määrällinen pitoisuus potilaan veren seerumissa.

Virus- tai bakteeriannos vaikuttaa merkittävästi tartuntaprosessin kulkuun ja lopputulokseen, joten kvantitatiivisella analyysillä on tärkeä rooli eri muodoissa ja vaiheissa olevien sairauksien diagnosoinnissa ja hoidossa.

Mutta kun tiedämme entsyymi-immunosorbenttimääritykset ELISA-menetelmänä, emme edes ajattele, kuinka se onnistuu kattamaan niin laajan valikoiman planeetallamme asuvia mikro-organismeja, joista monet muodostavat suoran uhan ihmisten terveydelle ja elämälle. eläimet. Tosiasia on, että ELISA:ssa on monia vaihtoehtoja (ei-kilpaileva ja kilpaileva - suora ja epäsuora), joista jokainen ratkaisee oman ongelmansa ja mahdollistaa siten kohdistetun haun.

Jommankumman luokan immunoglobuliinien havaitsemiseen käytetään perinteistä 96-kuoppaista polystyreenipaneelia (tablettia), jonka kuoppiin adsorboituneet rekombinanttiproteiinit konsentroidaan kiinteään faasiin. Veriseerumin kanssa kuoppaan joutuneet vasta-aineet tai antigeenit löytävät "tutun" esineen ja muodostavat sen kanssa kompleksin (AG - AT), joka entsyymikonjugaatin kiinnittyessä ilmenee kuopan värin muutoksena. tuloksia lukiessa.

Entsyymi-immunomääritys suoritetaan tietyn spesifisyyden omaaville testijärjestelmille, jotka on valmistettu erityisissä laboratorioissa ja varustettu kaikilla tarvittavilla reagoivilla komponenteilla. Tutkimukset voidaan suorittaa aluslevyillä ("aluslevyillä") ja lukuspektrofotometreillä, joissa suurin osa käsityöstä on mukana. Täysautomaattisissa koneissa, jotka vapauttavat laboratorion avustajan yksitoikkoisesta tiputuksesta, pesusta ja muista rutiinitehtävistä, on tietysti nopeampaa ja mukavampaa työskennellä, mutta kaikilla laboratorioilla ei ole varaa sellaiseen ylellisyyteen ja jatkaa työskentelyä vanhanaikaisesti - puoliautomaattisissa laitteissa.

ELISA-tulosten tulkinta kuuluu laboratoriodiagnostiikan lääkärin toimivaltaan, kun taas lähes kaikkiin immunokemiallisiin reaktioihin kuuluva ominaisuus antaa vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia vastauksia otetaan välttämättä huomioon.

Video: moderni entsyymi-immunomääritys

ELISA-tulokset esimerkiksi kuppasta

ELISA soveltuu kaikkien muotojen havaitsemiseen, ja lisäksi sitä käytetään seulontatutkimuksissa. Analyysissä käytetään potilaan laskimoverta, joka on otettu tyhjään mahaan. Työssä käytetään levyjä, joilla on tietty spesifisyys (AT-luokat A, M, G) tai kokonaisvasta-aineita.

Ottaen huomioon, että kupan vasta-aineet tuotetaan tietyssä järjestyksessä, ELISA voi helposti vastata kysymykseen siitä, milloin infektio tapahtui ja missä vaiheessa prosessi on, ja saatujen tulosten dekoodaus voidaan esittää seuraavassa muodossa:

• IgM ilmaisee infektioprosessin keston (voi ilmaantua kroonisten tulehdussairauksien pahenemisen aikana);
• IgA ilmoittaa, että infektio tapahtui yli kuukausi sitten;
• IgG osoittaa, että infektio on täydessä vauhdissa tai äskettäin hoidettu, mikä on helppo selvittää anamneesia kerättäessä.

Kun testataan kuppaa, negatiiviset kuopat (ja negatiivinen kontrolli) pysyvät värittöminä, kun taas positiiviset (kuten positiiviset kontrollit) ovat kirkkaan keltaisia ​​testin aikana lisätyn kromogeenin värimuutoksen vuoksi. Värin voimakkuus ei kuitenkaan aina vastaa kontrollia, eli se voi olla hieman vaaleampi tai hieman kellertävä. Nämä ovat kyseenalaisia ​​tuloksia, jotka pääsääntöisesti joutuvat tarkastelemaan uudelleen ottamalla huomioon spektrofotometrillä saadut kvantitatiiviset indikaattorit, mutta yleensä väri on suoraan verrannollinen immuunikompleksien (antigeenien ja vasta-aineiden) lukumäärään. toisilleen).

Mielenkiintoisin entsyymi-immunomääritys - ELISA HIV:lle

Analyysi kenties enemmän kuin muista kiinnostaa laajaa väestöryhmää, koska ei vielä voida varmuudella sanoa, että monet sosiaaliset ongelmat (prostituutio, huumeriippuvuus jne.) ovat kadonneet. Valitettavasti HIV ei koske vain näitä ihmisyhteiskunnan osia, voit saada tartunnan erilaisissa olosuhteissa, jotka eivät liity seksuaaliseen siveettömyyteen tai huumeiden käyttöön. Mutta jos HIV-testiä tarvitaan, sinun ei pitäisi pelätä, että kaikki ympärillä olevat saavat tietää tällaisessa laboratoriossa käymisestä. Nyt HIV-tartunnan saaneet ovat lain suojaamia, ja epäilyttävät voivat kääntyä nimettömiin toimistoihin, joissa he voivat ratkaista ongelman ilman pelkoa julkisuudesta ja tuomitsemisesta.

HIV-infektion diagnosointiin käytettävä entsyymi-immunomääritys on yksi ensisijaisista standarditutkimuksista, joka kuitenkin vaatii erityisolosuhteita, koska aihe on erittäin herkkä.

On järkevää tehdä HIV:n ELISA seksuaalisen kontaktin, verensiirron ja muiden infektioon liittyvien lääketieteellisten toimenpiteiden jälkeen ja inkubaatioajan lopussa ("seronegatiivinen ikkuna"), mutta on pidettävä mielessä, että tämä ajanjakso ei ole vakio. Se voi päättyä 14-30 päivässä tai se voi kestää jopa kuusi kuukautta, joten keskiarvon katsotaan olevan 45-90 päivän väli. Hiv-tartunnalle luovutetaan verta samalla tavalla kuin muihinkin infektioihin – suonesta tyhjään mahaan. Tulokset ovat valmiita riippuen materiaalin kertymisestä laboratorioon ja sen työmäärästä (2-10 päivää), vaikka useimmat laboratoriot antavat vastauksen samana tai seuraavana päivänä.

Mitä HIV-tuloksista voidaan odottaa?

HIV-infektion ELISA-testillä havaitaan vasta-aineita kahdelle virustyypille: HIV-1 (yleisempi Venäjällä ja muissa Euroopan ja Aasian maissa) ja HIV-2 (yleisempi Länsi-Afrikassa).

HIV ELISA:n tehtävänä on etsiä luokan G vasta-aineita, joita havaitaan kaikista testijärjestelmistä, mutta myöhemmin, sekä luokan A ja M vasta-aineita, jotka on havaittu uuden sukupolven rekombinanttitestipakkauksista, jotka mahdollistavat vasta-aineiden havaitsemisen varhaisimmat vaiheet (itämisaika on seronegatiivinen ikkuna). ELISA:sta voidaan odottaa seuraavia vastauksia:

1. Ensisijainen positiivinen tulos: veri tarkistetaan uudelleen samantyyppisellä, mutta mahdollisuuksien mukaan eri sarjalla olevalla testijärjestelmällä ja toisen henkilön toimesta (laboratorioavustaja);
2. Toistuva (+) sisältää uuden verinäytteen potilaasta, jonka tutkimus on samanlainen kuin ensisijainen analyysi;
3. Seuraavaan positiiviseen tulokseen tehdään vertailuanalyysi, jossa käytetään erittäin spesifisiä testisarjoja (2-3 kpl);
4. Positiivinen tulos molemmissa (tai kolmessa) järjestelmässä lähetetään immunoblottaukseen (sama ELISA, mutta suoritetaan erikseen erityisen spesifisille testipakkauksille).

Päätelmä HIV-tartunnasta tehdään vain immunoblottauksen perusteella. Keskustelua tartunnan saaneen henkilön kanssa käydään täysin luottamuksellisesti. Lääketieteellisten salaisuuksien paljastaminen Venäjällä ja muissa maissa on rikosoikeudellisen rangaistuksen alaista.

Klamydian ja sytomegaloviruksen testit entsyymi-immunomäärityksellä ovat myös saavuttaneet erityisen suosion, koska niiden avulla voit määrittää tartunnan ajan, taudin vaiheen ja terapeuttisten toimenpiteiden tehokkuuden.

Esittelyn aikana on myös mahdollista tarkkailla eri luokkien vasta-aineiden ilmaantumista. tartunnanaiheuttajan aiheuttaman patologisen tilan eri vaiheissa:

• IgM voidaan havaita jo seitsemän päivää tartunnan jälkeen;
• IgA osoittavat, että infektio on elänyt kehossa yli kuukauden;
• IgG vahvistaa klamydian diagnoosin, auttaa seuraamaan hoitoa ja määrittämään sen tehokkuuden. On huomioitava, että luokan G vasta-aineet säilyvät ja kiertävät elimistössä taudin kestosta riippumatta, joten analyysin oikean tulkinnan kannalta on otettava huomioon viitearvot (normit), jotka tapa, ovat erilaisia ​​jokaiselle CDL:lle: ottaen huomioon testijärjestelmän merkki ja sarjaan sisältyvien reagenssien spesifisyys. Normiarvot syötetään ELISA-tuloksen viereiseen lomakkeeseen.

Mitä tulee, tässä se on hieman erilainen: luokan M vasta-aineet ilmaantuvat noin puolessatoista kuukaudessa, eli positiivinen tulos (IgM+) tulee primaariinfektion vaiheeseen tai piilevän infektion uudelleenaktivoitumisen aikana ja pysyy sellaisena 4 kuukaudesta kuuteen kuukauteen.

Luokan G vasta-aineiden esiintyminen on ominaista primaarisen akuutin infektion tai uudelleeninfektion alkamiselle. Analyysi toteaa, että virus on läsnä, mutta ei anna tietoa tartuntaprosessin vaiheesta. Toisaalta myös IgG-tiitterinormin määrittäminen aiheuttaa hankaluuksia, koska se riippuu täysin tietyn henkilön immuunitilanteesta, joka kuitenkin määräytyy luokan G immunoglobuliinien havaitsemisen perusteella. tarpeen arvioida luokan G vasta-aineiden kykyä olla vuorovaikutuksessa CMV:n kanssa, jotta se myöhemmin "neutralisoidaan" (AT-aviditeetti). Taudin alkuvaiheessa IgG:t sitoutuvat erittäin huonosti viruksen antigeeneihin (alhainen aviditeetti) ja vasta sitten alkavat osoittaa aktiivisuutta, joten voimme puhua vasta-aineiden aviditeetin lisääntymisestä.

Entsyymi-immunomäärityksen eduista voidaan puhua pitkään, koska tämä menetelmä on onnistunut ratkaisemaan monia diagnostisia ongelmia käyttämällä vain laskimoverta. Tutkimusaineiston ottamisessa ei tarvita pitkiä odotuksia, huolia ja ongelmia. Lisäksi ELISA-testijärjestelmät kehittyvät jatkuvasti, eikä enää ole kaukana se päivä, jolloin testi antaa 100 %:n luotettavuuden tulokselle.

Video: Moskovan valtion lääketieteellisen yliopiston opetuselokuva. Sechenov ELISA:n perusteista