Tartuntatautien virologiset tutkimusmenetelmät. Virologiset tutkimukset Varmuuskopiointi Time Machinella

Virusinfektioiden laboratoriodiagnoosissa on kolme pääasiallista lähestymistapaa.

1) materiaalin suora tutkimus virusantigeenin tai nukleiinihappojen esiintymisen varalta;

2) viruksen eristäminen ja tunnistaminen kliinisestä materiaalista;

Suorat menetelmät kliinisen materiaalin diagnosointiin

Suorat menetelmät ovat menetelmiä, jotka mahdollistavat viruksen, virusantigeenin tai virusnukleiinihapon (NA) havaitsemisen suoraan kliinisestä materiaalista, eli ne ovat nopeimpia (2-24 tuntia).

Elektronimikroskopia (EM). Tällä menetelmällä voit havaita todellisen viruksen.

immuunielektronimikroskooppi (IEM), joka käyttää spesifisiä vasta-aineita viruksille. Vasta-aineiden vuorovaikutuksen seurauksena virusten kanssa muodostuu komplekseja, jotka negatiivisen värjäyksen jälkeen on helpompi havaita.

Immunofluoresenssireaktio (RIF). Menetelmä perustuu väriainesitoutuneiden vasta-aineiden käyttöön

RIF-menetelmää käytetään laajalti akuuttien hengitystieinfektioiden etiologian nopeaan selvittämiseen ylempien hengitysteiden limakalvojen täpläjälkien analysoinnissa.

Entsyymi-immunomääritys (ELISA). Entsyymi-immunomääritysmenetelmät virusantigeenien määrittämiseksi ovat periaatteessa samanlaisia ​​kuin RIF, mutta ne perustuvat vasta-aineiden leimaamiseen entsyymeillä väriaineiden sijaan.

Radioimmunomääritys (RIA). Menetelmä perustuu vasta-aineiden leimaamiseen radioisotoopeilla, mikä varmistaa korkean herkkyyden virusantigeenin määrittämisessä.

Molekyyliset menetelmät. Aluksi erittäin spesifistä NA-hybridisaatiomenetelmää pidettiin klassisena menetelmänä virusgenomin havaitsemiseen, mutta nyt käytetään yhä enemmän virusgenomien eristämistä polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla.

Nukleiinihappojen molekyylihybridisaatio. Menetelmä perustuu komplementaaristen DNA- tai RNA-säikeiden hybridisaatioon kaksijuosteisten rakenteiden muodostukseen ja niiden havaitsemiseen.

PCR perustuu luonnollisen DNA:n replikaation periaatteeseen. Menetelmän ydin on virusspesifisen DNA-sekvenssin synteesisyklien (amplifikaatio) toistuva toistaminen käyttämällä lämpöstabiilia Taq DNA -polymeraasia ja kahta spesifistä aluketta - ns. alukkeita.

Sytologisilla menetelmillä on tällä hetkellä rajallinen diagnostinen arvo, mutta niitä tulisi silti käyttää useissa infektioissa. Ruumiinavausmateriaalit, biopsiat, sivelynäytteet tutkitaan, jotka asianmukaisen käsittelyn jälkeen värjätään ja analysoidaan mikroskoopilla.

Virusten onnistuneen eristämisen kannalta kliininen materiaali tulee ottaa epäillyn taudin patogeneesin mukaisesti ja mahdollisimman pian.

Yleensä ota:

- hengitystieinfektioiden tapauksessa - nenänielun huuhtelu;

- enterovirusinfektioiden kanssa - punoitus ja ulosteet (reo-, enterovirukset);

- ihon ja limakalvojen vaurioilla - raapiminen, rakkuloiden sisältö (herpes, vesirokko);

- eksanteemisilla infektioilla - vanupuikkoja (tuhkarokko, vihurirokko);

- arbovirusinfektioissa - veri, aivo-selkäydinneste.

Virusten eristämiseen käytetään soluviljelmiä, laboratorioeläimiä ja kanan alkioita. Prosessi on pitkä ja vaatii joskus useita siirtoja, ennen kuin virus havaitaan ja tunnistetaan yhdellä tai useammalla menetelmällä - neutralointitestillä (RN), RIF:llä, ELISA:lla tai PCR:llä.

Serodiagnostiikka

Antigeeni-vasta-ainereaktioon perustuvaa serologista diagnostiikkaa voidaan käyttää molempien määrittämiseen, ja sillä on rooli virusinfektion etiologian määrittämisessä jopa negatiivisilla virukseneristystuloksilla.

RSK on yksi perinteisistä serologisista testeistä, ja sitä käytetään monien virusinfektioiden diagnosointiin. Reaktioon osallistuu kaksi järjestelmää: potilaan seerumin vasta-aineet + standardivirus ja lampaan erytrosyytit + vasta-aineet niitä vastaan ​​sekä titrattu komplementti. Jos vasta-aineet ja virus täsmäävät, tämä kompleksi sitoo komplementin eikä lampaan punasolujen hajoamista tapahdu (positiivinen reaktio). Jos RSC on negatiivinen, komplementti edistää punasolujen hajoamista. Menetelmän haittana on sen riittämättömän korkea herkkyys ja reagenssien standardoinnin vaikeus IF-menetelmää, kuten ELISA:ta, käytetään vasta-aineiden määrittämiseen seerumista.

Virologiset tutkimusmenetelmät- menetelmät virusten biologian ja niiden tunnistamisen tutkimiseksi. Virologiassa käytetään laajalti molekyylibiologian menetelmiä, joiden avulla pystyttiin selvittämään viruspartikkelien molekyylirakenne, kuinka ne tunkeutuvat soluun ja virusten lisääntymisen ominaisuudet, virusnukleiinihappojen primäärirakenne ja proteiineja. Menetelmiä viruksen nukleiinihappojen ja proteiinien aminohappojen ainesosien sekvenssin määrittämiseksi kehitetään. On mahdollista yhdistää nukleiinihappojen ja niiden koodaamien proteiinien toiminnot nukleotidisekvenssiin ja selvittää solunsisäisten prosessien syyt, joilla on tärkeä rooli e-virusinfektiossa.

Virologiset tutkimusmenetelmät perustuvat myös immunologisiin prosesseihin (antigeenin vuorovaikutus vasta-aineiden kanssa), viruksen biologisiin ominaisuuksiin (hemagglutinaatiokyky, hemolyysi, entsymaattinen aktiivisuus), viruksen vuorovaikutuksen ominaisuuksiin isäntäsolun kanssa (sytopaattisen solun luonne). vaikutus, solunsisäisten sulkeumien muodostuminen jne.).

Virusinfektioiden diagnosoinnissa, virusten viljelyssä, eristämisessä ja tunnistamisessa sekä rokotevalmisteiden valmistuksessa käytetään laajasti kudos- ja soluviljelymenetelmää. Käytetään primaarisia, sekundaarisia, stabiileja jatkuvia ja diploidisia soluviljelmiä. Primääriviljelmät saadaan dispergoimalla kudosta proteolyyttisillä entsyymeillä (trypsiini, kollagenaasi). Solujen lähde voivat olla ihmisten ja eläinten alkioiden kudokset ja elimet (useammin munuaiset). Solususpensio ravintoalustassa asetetaan ns. patjoihin, pulloihin tai petrimaljoihin, joissa suonen pintaan kiinnittymisen jälkeen solut alkavat lisääntyä. Virusinfektioon käytetään yleensä yksisolukerrosta. Ravinneneste valutetaan, virussuspensio lisätään tietyissä laimennoksissa ja solujen kanssa kosketuksen jälkeen lisätään tuoretta ravintoalustaa, yleensä ilman seerumia.

Useimmista primääriviljelmistä peräisin olevia soluja voidaan jatkoviljellä, ja niitä kutsutaan sekundaariviljelmiksi. Kun solut kulkevat edelleen, muodostuu fibroblastin kaltaisten solujen populaatio, joka kykenee lisääntymään nopeasti ja joista suurin osa säilyttää alkuperäisen kromosomijoukon. Nämä ovat niin sanottuja diploidisia soluja. Solujen sarjaviljelyssä saadaan stabiileja jatkuvia soluviljelmiä. Siirtojen aikana ilmaantuu nopeasti jakautuvia homogeenisia soluja, joissa on heteroploidinen kromosomisarja. Stabiilit solulinjat voivat olla yksikerroksisia ja suspensioita. Yksikerroksiset viljelmät kasvavat jatkuvan kerroksen muodossa lasin pinnalla, suspensioviljelmät kasvavat suspensioina erilaisissa astioissa sekoittimia käyttäen. Siellä on yli 400 solulinjaa, jotka on peräisin 40 eri eläinlajista (mukaan lukien kädelliset, linnut, matelijat, sammakkoeläimet, kalat, hyönteiset) ja ihmisistä.

Yksittäisten elinten ja kudosten paloja (elinviljelmiä) voidaan viljellä keinotekoisissa ravintoaineissa. Tämäntyyppiset viljelmät säilyttävät kudosrakenteen, mikä on erityisen tärkeää erilaistumattomissa kudosviljelmissä lisääntymättömien virusten (esimerkiksi koronavirukset) eristämisessä ja siirrossa.

Infektoituneissa soluviljelmissä virukset voidaan havaita solun morfologian muutoksella, sytopaattisella vaikutuksella, joka voi olla spesifinen, inkluusioiden esiintymisellä, määrittämällä virusantigeenit solussa ja viljelynesteessä; viruksen jälkeläisten biologisten ominaisuuksien määrittäminen viljelynesteessä ja virusten titraus kudosviljelmässä, kananpoikien alkioissa tai herkissä eläimissä; havaitsemalla yksittäisiä virusnukleiinihappoja soluissa molekyylihybridisaatiolla tai nukleiinihappoklustereita sytokemiallisella menetelmällä käyttäen fluoresenssimikroskopiaa.

Virusten eristäminen on työläs ja pitkä prosessi. Se suoritetaan väestön keskuudessa kiertävän viruksen tyypin tai muunnelman määrittämiseksi (esimerkiksi viruksen a serovariantin tunnistamiseksi, viruksen a villi- tai rokotekanta jne.); tapauksissa, joissa on tarpeen toteuttaa kiireellisiä epidemiologisia toimenpiteitä; kun uusia virustyyppejä tai muunnelmia ilmaantuu; tarvittaessa vahvista alustava diagnoosi; virusten osoittamiseen ympäristön kohteissa. Viruksia eristettäessä otetaan huomioon mahdollisuus niiden säilymiseen ihmiskehossa sekä kahden tai useamman viruksen aiheuttaman sekainfektion esiintyminen. Yhdestä virionista saatua geneettisesti homogeenista viruspopulaatiota kutsutaan virusklooniksi ja sen hankintaprosessia kloonaukseksi.

Virusten eristämiseen käytetään herkkien laboratorioeläinten infektioita, kanan alkioita, mutta useimmiten käytetään kudosviljelmää. Viruksen esiintyminen määräytyy yleensä spesifisen solun rappeutumisen perusteella (sytopaattinen vaikutus),

Useiden virusten, esimerkiksi virusten a, eristämiseen käytetään kanan alkioita, joidenkin Coxsackie-virusten ja useiden arbovirusten - vastasyntyneiden hiirten - eristämiseen. Eristettyjen virusten tunnistaminen suoritetaan serologisilla testeillä ja muilla menetelmillä.

Kun työskentelet virusten kanssa, niiden tiitteri määritetään. Virusten titraus suoritetaan yleensä kudosviljelmässä määrittämällä virusta sisältävän nesteen suurin laimennus, jossa tapahtuu kudosten rappeutumista, muodostuu sulkeumia ja virusspesifisiä antigeenejä. Plakkimenetelmää voidaan käyttää useiden virusten titraamiseen. Plakit tai negatiiviset viruspesäkkeet ovat yksikerroksisen kudosviljelmän viruksen tuhoamien solujen pesäkkeitä agar-päällysteen alla. Pesäkkeiden laskenta mahdollistaa virusten tarttuvan aktiivisuuden kvantitatiivisen analyysin sen perusteella, että yksi tarttuva viruspartikkeli muodostaa yhden plakin. Plakit tunnistetaan värjäämällä viljelmä elintärkeillä väriaineilla, yleensä neutraalilla punaisella; plakit eivät adsorboi väriainetta ja ovat siksi näkyvissä vaaleina täplinä värjäytyneiden elävien solujen taustalla. Viruksen tiitteri ilmaistaan ​​plakkia muodostavien yksiköiden lukumääränä 1:ssä ml.

Virusten puhdistus ja väkevöinti suoritetaan tavallisesti differentiaalisella ultrasentrifugoinnilla, jota seuraa sentrifugointi konsentraatio- tai tiheysgradienteissa. Virusten puhdistamiseen käytetään immunologisia menetelmiä, ioninvaihtokromatografiaa, immunosorbentteja jne.

Virusinfektioiden laboratoriodiagnostiikka sisältää taudinaiheuttajan tai sen komponenttien havaitsemisen kliinisestä materiaalista; viruseristys tästä materiaalista; serodiagnoosi. Laboratoriodiagnostiikkamenetelmän valinta kussakin yksittäistapauksessa riippuu taudin luonteesta, taudin ajanjaksosta ja laboratorion kyvyistä. Nykyaikainen virusinfektioiden diagnoosi perustuu pikamenetelmiin, joiden avulla saat vastauksen muutaman tunnin kuluttua kliinisen materiaalin ottamisen jälkeen taudin varhaisessa vaiheessa, kuten elektroni- ja immuunielektronimikroskoopilla,

Negatiivisti värjäytyneiden virusten elektronimikroskopia mahdollistaa virusten erottamisen ja niiden pitoisuuden määrittämisen. Elektronimikroskopian käyttö virusinfektioiden diagnosoinnissa rajoittuu tapauksiin, joissa viruspartikkelien pitoisuus kliinisessä materiaalissa on riittävän korkea (10 5/1 ml ja korkeampi). Menetelmän haittana on kyvyttömyys erottaa samaan taksonomiseen ryhmään kuuluvia viruksia. Tämä haitta poistetaan käyttämällä immuunielektronimikroskooppia. Menetelmä perustuu immuunikompleksien muodostumiseen, kun viruspartikkeleihin lisätään spesifistä seerumia, samalla kun viruspartikkeleita konsentroidaan samanaikaisesti, mikä mahdollistaa niiden tunnistamisen. Menetelmää käytetään myös vasta-aineiden havaitsemiseen. Expressdiagnostiikasta varten suoritetaan elektronimikroskooppitutkimus kudosuutteista, ulosteista, vesikkeleistä ja nenänielun eritteistä. Elektronimikroskopiaa käytetään laajalti viruksen morfogeneesin tutkimiseen, sen ominaisuuksia laajennetaan käyttämällä leimattuja vasta-aineita.

Virusspesifisten nukleiinihappojen havaitsemiseen perustuva molekyylihybridisaatiomenetelmä mahdollistaa yksittäisten geenikopioiden havaitsemisen, eikä sille ole herkkyydeltään vertaista. Reaktio perustuu DNA:n tai RNA:n komplementaaristen juosteiden (koettimien) hybridisaatioon ja kaksijuosteisten rakenteiden muodostumiseen. Halvin koetin on kloonattu yhdistelmä-DNA. Koetin on leimattu radioaktiivisilla esiasteilla (yleensä radioaktiivisella fosforilla). Kolorimetristen reaktioiden käyttö on lupaavaa. Molekyylihybridisaatiosta on useita muunnelmia: pistehybridisaatio, blot-hybridisaatio, sandwich-hybridisaatio, in situ -hybridisaatio jne.

LgM-luokan vasta-aineet ilmaantuvat aikaisemmin kuin luokan G vasta-aineet (3-5. sairauspäivänä) ja häviävät muutaman viikon kuluttua, joten niiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon. IgM-luokan vasta-aineet havaitaan immunofluoresenssi- tai entsyymi-immunomäärityksellä käyttämällä anti-m-antiseerumia (anti-IgM-raskasketjuseerumia).

Virologian serologiset menetelmät perustuvat klassisiin immunologisiin reaktioihin (ks. Immunologiset tutkimusmenetelmät ): komplementin kiinnitysreaktiot

Virusten yksittäisten antigeenien ja niiden vasta-aineiden tunnistamiseksi monimutkaisissa seoksissa ilman edeltävää proteiinipuhdistusta käytetään immunoblottausta. Menetelmässä yhdistetään proteiinifraktiointi käyttäen polyja sitä seuraava proteiinien immunomääritys entsyymi-immunomäärityksellä. Proteiinien erottelu vähentää antigeenin kemiallisen puhtauden vaatimuksia ja mahdollistaa yksittäisten antigeeni-vasta-aine-parien tunnistamisen. Tämä tehtävä on olennainen esimerkiksi HIV-infektion serodiagnosissa, jossa väärät positiiviset entsyymi-immunomääritysreaktiot johtuvat vasta-aineiden läsnäolosta soluantigeeneille, joita esiintyy virusproteiinien riittämättömän puhdistuksen seurauksena. Vasta-aineiden tunnistaminen potilaiden seerumeista sisäisille ja ulkoisille virusantigeeneille mahdollistaa taudin vaiheen määrittämisen ja populaatioiden analysoinnissa virusproteiinien vaihtelun. HIV-infektion immunoblottausta käytetään varmistustestinä yksittäisten virusantigeenien ja niiden vasta-aineiden havaitsemiseksi. Populaatioita analysoitaessa menetelmällä määritetään virusproteiinien vaihtelu. Menetelmän suuri arvo on mahdollisuudessa analysoida yhdistelmä-DNA-tekniikalla syntetisoituja antigeenejä, selvittää niiden koko ja antigeenideterminanttien läsnäolo.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virology, Methods, toim. B. Meikhi, käänn. Englannista, M., 1988; Mikrobiologisten ja virologisten tutkimusmenetelmien käsikirja, toim. M.O. Birger, M., 1982.

Virologisia tutkimusmenetelmiä käytetään laajalti lääketieteessä monien virusluonteisten tartuntatautien ja joidenkin onkologisten sairauksien diagnosoinnissa.

Virologisilla tutkimusmenetelmillä tunnistetaan, tutkitaan myös niiden biologiaa ja kykyä vaikuttaa eläin- ja ihmissoluihin, mikä auttaa edelleen ymmärtämään virustautien patogeneesiä ja valitsemaan oikeat hoitomenetelmät. Virologisilla tutkimusmenetelmillä on taudin etiologian selvittämisen ja hoidon tehokkuuden seurannan lisäksi suuri merkitys epidemian vastaisten toimenpiteiden määrittämisessä ja toteutuksessa.

Suorat tutkimusmenetelmät virologiassa

Suorat virologiset tutkimusmenetelmät mahdollistavat viruksen, viruksen nukleiinihapon tai virusantigeenin havaitsemisen suoraan kliinisestä materiaalista ja ovat siten nopeimpia (ekspressiomenetelmät - jopa 24 tuntia). Nämä menetelmät ovat vähemmän informatiivisia ja vaativat laboratoriovahvistuksen epäsuorilla diagnostisilla menetelmillä, koska usein saadaan vääriä negatiivisia tai vääriä positiivisia tuloksia. Suorat menetelmät sisältävät seuraavat tutkimusmenetelmät:

• elektronimikroskopia virusten värjäyksellä negatiivisella värjäyksellä (voit määrittää viruksen läsnäolon ja sen pitoisuuden materiaalissa, jos 1 ml sisältää vähintään 105 viruspartikkelia);
• immuunielektronimikroskooppi, joka perustuu spesifisten vasta-aineiden vuorovaikutukseen virusten kanssa muodostaen komplekseja, jotka on helpompi havaita negatiivisella kontrastilla kuin virukset yksinään;
• entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), jossa käytetään entsyymileimattuja vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeeneihin muodostaen komplekseja, jotka havaitaan, kun käytetyn entsyymin substraattia lisätään;
• immunofluoresenssireaktio (RIF) - suora tai epäsuora - perustuu fluoresoivaan väriaineeseen liittyvien vasta-aineiden käyttöön;
• radioimmunomääritys (RIA) perustuu radioisotoopilla leimattujen vasta-aineiden ja gamma-laskurien käyttöön;
• sytologiset menetelmät perustuvat värjäytyneiden sivelysolujen, biopsioiden, ruumiinavausmateriaalien mikroskooppiseen tutkimukseen;
• molekyylimenetelmät - nukleiinihappojen molekyylihybridisaatio ja polymeraasiketjureaktio (ensimmäinen perustuu nukleiinihappojen komplementaaristen juosteiden havaitsemiseen leiman avulla, toinen perustuu virusspesifisen DNA-sekvenssin replikaatioperiaatteeseen kolmessa vaiheessa) .

Nukleiinihappojen molekyylihybridisaatioon on kolme vaihtoehtoa - pistehybridisaatio, blot-hybridisaatio (käytetään HIV-infektion diagnosointiin) ja in situ -hybridisaatio (suoraan infektoiduissa soluissa). PCR:ää (polymeraasiketjureaktiota) käytetään nykyään yhä enemmän virusinfektioiden seurannassa ja diagnosoinnissa tämän menetelmän korkean herkkyyden ja spesifisyyden vuoksi.

Epäsuorat virologiset tutkimusmenetelmät

Nämä menetelmät perustuvat viruksen eristämiseen ja tunnistamiseen. Nämä ovat enemmän aikaa ja aikaa vieviä menetelmiä, mutta tarkempia. Tällaisten tutkimusten materiaalina voi olla rakkuloiden, raapimien (vesirokko, ihon ja limakalvojen herpeettiset vauriot), nenänielun huuhtelu (hengitystieinfektiot), veri ja selkäydinneste (arbovirusinfektiot), ulosteet (enteroviruksen kanssa) sisältö. infektiot), vanupuikko (tuhkarokko, vihurirokko jne.). Koska virukset voivat lisääntyä vain elävissä soluissa, viruksen viljely tapahtuu kudosviljelmässä, kanan alkiossa tai eläimen kehossa (hamsteri, valkoinen hiiri, koira, kissa, jotkut apinalajit). Viruksen indikaatio suoritetaan sytopaattisella vaikutuksella, hemadsorptioreaktiossa, väritestissä, hemagglutinaation estoreaktion tulosten mukaan, kanan alkioissa tai kudosviljelmissä tapahtuvien muutosten tai niiden puuttumisen mukaan, kanan alkioiden tai kudosviljelmien eloonjäämisen mukaan. herkkiä eläimiä.

Virologiassa käytetyt serologiset diagnostiset menetelmät

Serologisella tarkoitetaan antigeeni-vasta-ainereaktioon perustuvia virologisia tutkimusmenetelmiä. Tässä tapauksessa käytetään useimmiten parillisia veriseerumia, jotka otetaan usean viikon välein. Kun vasta-ainetiitteri nousee 4 kertaa tai useammin, reaktiota pidetään positiivisena. Virusten tyyppispesifisyyden määrittämiseksi käytetään viruksen neutralointireaktiota, ryhmäspesifisyyden määrittämiseksi komplementin kiinnitysreaktiota. Passiivisen hemagglutinaation, hemagglutinaation eston, käänteisen passiivisen hemagglutinaation, RIF:n ja entsyymi-immunomäärityksen eri muunnelmat ovat myös laajalti käytössä.

Suhteellisen äskettäin geenitekniikan tutkimuksen aikana on kehitetty menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi. Monoklonien kapea spesifisyys voitetaan käyttämällä useita monoklonaalisia vasta-aineita eri virusdeterminanteille. Tämä lisäsi virologisten tutkimusmenetelmien herkkyyttä ja spesifisyyttä virusantigeenien määrittämisessä. Tällä hetkellä virusinfektioiden immunologiseen diagnosointiin on luotu monia erilaisia ​​testijärjestelmiä.

menetelmät virusten biologian tutkimiseksi ja niiden tunnistamiseksi. Virologiassa käytetään laajalti molekyylibiologian menetelmiä, joiden avulla pystyttiin selvittämään viruspartikkelien molekyylirakenne, kuinka ne tunkeutuvat soluun ja virusten lisääntymisen ominaisuudet, virusnukleiinihappojen primäärirakenne ja proteiineja. Menetelmiä viruksen nukleiinihappojen ja proteiinien aminohappojen ainesosien sekvenssin määrittämiseksi kehitetään. On mahdollista yhdistää nukleiinihappojen ja niiden koodaamien proteiinien toiminnot nukleotidisekvenssiin ja selvittää solunsisäisten prosessien syyt, joilla on tärkeä rooli virusinfektion patogeneesissä.

Virologiset tutkimusmenetelmät perustuvat myös immunologisiin prosesseihin (antigeenin vuorovaikutus vasta-aineiden kanssa), viruksen biologisiin ominaisuuksiin (hemagglutinaatiokyky, hemolyysi, entsymaattinen aktiivisuus), viruksen vuorovaikutuksen ominaisuuksiin isäntäsolun kanssa ( sytopaattisen vaikutuksen luonne, solunsisäisten sulkeumien muodostuminen jne.).

Virusinfektioiden diagnosoinnissa, virusten viljelyssä, eristämisessä ja tunnistamisessa sekä rokotevalmisteiden valmistuksessa käytetään laajasti kudos- ja soluviljelymenetelmää. Käytetään primaarisia, sekundaarisia, stabiileja jatkuvia ja diploidisia soluviljelmiä. Primääriviljelmät saadaan dispergoimalla kudosta proteolyyttisillä entsyymeillä (trypsiini, kollagenaasi). Solujen lähde voivat olla ihmisten ja eläinten alkioiden kudokset ja elimet (useammin munuaiset). Solususpensio ravintoalustassa asetetaan ns. patjoihin, pulloihin tai petrimaljoihin, joissa suonen pintaan kiinnittymisen jälkeen solut alkavat lisääntyä. Virusinfektioon käytetään yleensä yksisolukerrosta. Ravinneneste valutetaan, virussuspensio lisätään tietyissä laimennoksissa ja solujen kanssa kosketuksen jälkeen lisätään tuoretta ravintoalustaa, yleensä ilman seerumia.

Useimmista primääriviljelmistä peräisin olevia soluja voidaan jatkoviljellä, ja niitä kutsutaan sekundaariviljelmiksi. Kun soluja kuljetetaan edelleen, muodostuu fibroblastin kaltaisten solujen populaatio, joka kykenee lisääntymään nopeasti ja joista suurin osa säilyttää alkuperäisen kromosomijoukon. Nämä ovat niin sanottuja diploidisia soluja. Solujen sarjaviljelyssä saadaan stabiileja jatkuvia soluviljelmiä. Siirtojen aikana ilmaantuu nopeasti jakautuvia homogeenisia soluja, joissa on heteroploidinen kromosomisarja. Stabiilit solulinjat voivat olla yksikerroksisia ja suspensioita. Yksikerroksiset viljelmät kasvavat jatkuvan kerroksen muodossa lasin pinnalla, suspensioviljelmät kasvavat suspensioina erilaisissa astioissa sekoittimia käyttäen. Siellä on yli 400 solulinjaa, jotka on peräisin 40 eri eläinlajista (mukaan lukien kädelliset, linnut, matelijat, sammakkoeläimet, kalat, hyönteiset) ja ihmisistä.

Yksittäisten elinten ja kudosten paloja (elinviljelmiä) voidaan viljellä keinotekoisissa ravintoaineissa. Tämäntyyppiset viljelmät säilyttävät kudosrakenteen, mikä on erityisen tärkeää erilaistumattomissa kudosviljelmissä lisääntymättömien virusten (esimerkiksi koronavirukset) eristämisessä ja siirrossa.

Infektoituneissa soluviljelmissä virukset voidaan havaita solun morfologian muutoksella, sytopaattisella vaikutuksella, joka voi olla spesifinen, inkluusioiden esiintymisellä, määrittämällä virusantigeenit solussa ja viljelynesteessä; viruksen jälkeläisten biologisten ominaisuuksien määrittäminen viljelynesteessä ja virusten titraus kudosviljelmässä, kananpoikien alkioissa tai herkissä eläimissä; havaitsemalla yksittäisiä virusnukleiinihappoja soluissa molekyylihybridisaatiolla tai nukleiinihappoklustereita sytokemiallisella menetelmällä käyttäen fluoresenssimikroskopiaa.

Virusten eristäminen on työläs ja pitkä prosessi. Se suoritetaan väestön keskuudessa kiertävän viruksen tyypin tai muunnelman määrittämiseksi (esimerkiksi influenssaviruksen serovariantin, polioviruksen villi- tai rokotekannan tunnistamiseksi jne.); tapauksissa, joissa on tarpeen toteuttaa kiireellisiä epidemiologisia toimenpiteitä; kun uusia virustyyppejä tai muunnelmia ilmaantuu; tarvittaessa vahvista alustava diagnoosi; virusten osoittamiseen ympäristön kohteissa. Viruksia eristettäessä otetaan huomioon mahdollisuus niiden säilymiseen ihmiskehossa sekä kahden tai useamman viruksen aiheuttaman sekainfektion esiintyminen. Yhdestä virionista saatua geneettisesti homogeenista viruspopulaatiota kutsutaan virusklooniksi ja sen hankintaprosessia kloonaukseksi.

Virusten eristämiseen käytetään herkkien laboratorioeläinten infektioita, kanan alkioita, mutta useimmiten käytetään kudosviljelmää. Viruksen esiintyminen määräytyy yleensä spesifisen solun rappeutumisen (sytopaattisen vaikutuksen), symplastien ja synsytian muodostumisen, solunsisäisten sulkeumien havaitsemisen sekä immunofluoresenssin, hemadsorption, hemagglutinaation (hemagglutinaatioviruksissa) jne. avulla. . Nämä merkit voidaan havaita vasta 2-3 viruksen läpikulkukerran jälkeen.

Useiden virusten, kuten influenssavirusten, eristämiseen käytetään kanan alkioita, joidenkin Coxsackie-virusten ja useiden arbovirusten eristämiseen käytetään vastasyntyneitä hiiriä. Eristettyjen virusten tunnistaminen suoritetaan serologisilla testeillä ja muilla menetelmillä.

Kun työskentelet virusten kanssa, niiden tiitteri määritetään. Virusten titraus suoritetaan yleensä kudosviljelmässä määrittämällä virusta sisältävän nesteen suurin laimennus, jossa tapahtuu kudosten rappeutumista, muodostuu sulkeumia ja virusspesifisiä antigeenejä. Plakkimenetelmää voidaan käyttää useiden virusten titraamiseen. Plakit tai negatiiviset viruspesäkkeet ovat yksikerroksisen kudosviljelmän viruksen tuhoamien solujen pesäkkeitä agar-päällysteen alla. Pesäkkeiden laskenta mahdollistaa virusten tarttuvan aktiivisuuden kvantitatiivisen analyysin sen perusteella, että yksi tarttuva viruspartikkeli muodostaa yhden plakin. Plakit tunnistetaan värjäämällä viljelmä elintärkeillä väriaineilla, yleensä neutraalilla punaisella; plakit eivät adsorboi väriainetta ja ovat siksi näkyvissä vaaleina täplinä värjäytyneiden elävien solujen taustalla. Viruksen tiitteri ilmaistaan ​​plakkia muodostavien yksiköiden lukumääränä 1:ssä ml.

Virusten puhdistus ja väkevöinti suoritetaan tavallisesti differentiaalisella ultrasentrifugoinnilla, jota seuraa sentrifugointi konsentraatio- tai tiheysgradienteissa. Virusten puhdistamiseen käytetään immunologisia menetelmiä, ioninvaihtokromatografiaa, immunosorbentteja jne.

Virusinfektioiden laboratoriodiagnostiikka sisältää taudinaiheuttajan tai sen komponenttien havaitsemisen kliinisestä materiaalista; viruseristys tästä materiaalista; serodiagnoosi. Laboratoriodiagnostiikkamenetelmän valinta kussakin yksittäistapauksessa riippuu taudin luonteesta, taudin ajanjaksosta ja laboratorion kyvyistä. Nykyaikainen virusinfektioiden diagnostiikka perustuu express-menetelmiin, joiden avulla saat vasteen muutaman tunnin kuluttua kliinisen materiaalin ottamisesta taudin varhaisessa vaiheessa. Näitä ovat elektroni- ja immuunielektronimikroskooppi sekä immunofluoresenssi, molekyylihybridisaatiomenetelmä. , IgM-luokan vasta-aineiden havaitseminen jne.

Negatiivisti värjäytyneiden virusten elektronimikroskopia mahdollistaa virusten erottamisen ja niiden pitoisuuden määrittämisen. Elektronimikroskopian käyttö virusinfektioiden diagnosoinnissa rajoittuu tapauksiin, joissa viruspartikkelien pitoisuus kliinisessä materiaalissa on riittävän korkea (10 5/1 ml ja korkeampi). Menetelmän haittana on kyvyttömyys erottaa samaan taksonomiseen ryhmään kuuluvia viruksia. Tämä haitta poistetaan käyttämällä immuunielektronimikroskooppia. Menetelmä perustuu immuunikompleksien muodostumiseen, kun viruspartikkeleihin lisätään spesifistä seerumia, samalla kun viruspartikkeleita konsentroidaan samanaikaisesti, mikä mahdollistaa niiden tunnistamisen. Menetelmää käytetään myös vasta-aineiden havaitsemiseen. Expressdiagnostiikasta varten suoritetaan elektronimikroskooppitutkimus kudosuutteista, ulosteista, vesikkeleistä ja nenänielun eritteistä. Elektronimikroskopiaa käytetään laajalti viruksen morfogeneesin tutkimiseen, sen ominaisuuksia laajennetaan käyttämällä leimattuja vasta-aineita.

Virusspesifisten nukleiinihappojen havaitsemiseen perustuva molekyylihybridisaatiomenetelmä mahdollistaa yksittäisten geenikopioiden havaitsemisen, eikä sille ole herkkyydeltään vertaista. Reaktio perustuu DNA:n tai RNA:n komplementaaristen juosteiden (koettimien) hybridisaatioon ja kaksijuosteisten rakenteiden muodostumiseen. Halvin koetin on kloonattu yhdistelmä-DNA. Koetin on leimattu radioaktiivisilla esiasteilla (yleensä radioaktiivisella fosforilla). Kolorimetristen reaktioiden käyttö on lupaavaa. Molekyylihybridisaatiosta on useita muunnelmia: pistehybridisaatio, blot-hybridisaatio, sandwich-hybridisaatio, in situ -hybridisaatio jne.

LgM-luokan vasta-aineet ilmaantuvat aikaisemmin kuin luokan G vasta-aineet (3-5. sairauspäivänä) ja häviävät muutaman viikon kuluttua, joten niiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon. IgM-luokan vasta-aineet havaitaan immunofluoresenssi- tai entsyymi-immunomäärityksellä käyttämällä anti-μ-antiseerumia (anti-IgM-raskasketjuseerumia).

Virologian serologiset menetelmät perustuvat klassisiin immunologisiin reaktioihin (ks. Immunologiset tutkimusmenetelmät) : komplementin kiinnitysreaktiot, hemagglutinaation esto, biologinen neutralointi, immunodiffuusio, epäsuora hemagglutinaatio, radiaalinen hemolyysi, immunofluoresenssi, entsyymi-immunomääritys, radioimmunomääritys. Moniin reaktioihin on kehitetty mikromenetelmiä, ja niiden tekniikoita kehitetään jatkuvasti. Näitä menetelmiä käytetään virusten tunnistamiseen tunnettujen seerumeiden avulla ja serodiagnosointiin, jotta voidaan määrittää vasta-aineiden lisääntyminen toisessa seerumissa ensimmäiseen verrattuna (ensimmäinen seerumi otetaan ensimmäisinä päivinä taudin jälkeen, toinen - sen jälkeen 2-3 viikkoa). Diagnostinen arvo on vähintään nelinkertainen vasta-aineiden lisääntyminen toisessa seerumissa. Jos lgM-luokan vasta-aineiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon, lgC-luokan vasta-aineet säilyvät useita vuosia ja joskus koko elämän.

Virusten yksittäisten antigeenien ja niiden vasta-aineiden tunnistamiseksi monimutkaisissa seoksissa ilman edeltävää proteiinipuhdistusta käytetään immunoblottausta. Menetelmässä yhdistetään proteiinifraktiointi käyttäen polyja sitä seuraava proteiinien immunomääritys entsyymi-immunomäärityksellä. Proteiinien erottelu vähentää antigeenin kemiallisen puhtauden vaatimuksia ja mahdollistaa yksittäisten antigeeni-vasta-aine-parien tunnistamisen. Tämä tehtävä on olennainen esimerkiksi HIV-infektion serodiagnosissa, jossa väärät positiiviset entsyymi-immunomääritysreaktiot johtuvat vasta-aineiden läsnäolosta soluantigeeneille, joita esiintyy virusproteiinien riittämättömän puhdistuksen seurauksena. Vasta-aineiden tunnistaminen potilaiden seerumeista sisäisille ja ulkoisille virusantigeeneille mahdollistaa taudin vaiheen määrittämisen ja populaatioiden analysoinnissa virusproteiinien vaihtelun. HIV-infektion immunoblottausta käytetään varmistustestinä yksittäisten virusantigeenien ja niiden vasta-aineiden havaitsemiseksi. Populaatioita analysoitaessa menetelmällä määritetään virusproteiinien vaihtelu. Menetelmän suuri arvo on mahdollisuudessa analysoida yhdistelmä-DNA-tekniikalla syntetisoituja antigeenejä, selvittää niiden koko ja antigeenideterminanttien läsnäolo.

20) Virionien päärakennekomponentti (täydelliset viruspartikkelit) on nukleokapsidi, so. proteiinivaippa (kapsidi), joka sulkee sisäänsä viruksen genomin (DNA tai RNA). Useimpien virusperheiden nukleokapsidia ympäröi lipoproteiinivaippa. Joissakin viruksissa (orto-, paramykso-, rabdo-, filo- ja retrovirukset) vaipan ja nukleokapsidin välissä on glykosyloimaton matriisiproteiini, joka antaa virioneille lisää jäykkyyttä. Useimpien perheiden viruksilla on vaippa, jolla on tärkeä rooli tarttuvuudessa. Virionit hankkivat vaipan ulkokerroksen, kun nukleokapsidi tunkeutuu solukalvon läpi silmuuttamalla. Virus koodaa vaippaproteiineja, ja lipidit lainataan solukalvolta. Yleensä dimeerien ja trimeerien muodossa olevat glykoproteiinit muodostavat peplomeerejä (ulokkeita) virionien pinnalle (orto-, paramyksovirukset, rabdo-, filo-, korona-, bunya-, areena-, retrovirukset). Glykosyloidut fuusioproteiinit liittyvät peplomeereihin ja niillä on keskeinen rooli viruksen pääsyssä soluun. Virionien kapsidit ja vaipat muodostuvat useista yhden tai useamman tyyppisen proteiinialayksikön kopiosta itsekokoamisprosessin seurauksena. Vuorovaikutus proteiini-proteiinijärjestelmässä heikkojen kemiallisten sidosten vuoksi johtaa symmetristen kapsidien yhdistymiseen. Erot viruksissa virionien muodossa ja koossa riippuvat rakenteellisten proteiinialayksiköiden muodosta, koosta ja lukumäärästä sekä niiden välisen vuorovaikutuksen luonteesta. Kapsidi koostuu monista morfologisesti ilmennetyistä alayksiköistä (kapsomeereistä), jotka on koottu viruspolypeptideistä tiukasti määritellyllä tavalla, suhteellisen yksinkertaisten geometristen periaatteiden mukaisesti. Proteiinialayksiköt, jotka liittyvät toisiinsa, muodostavat kahden tyyppisen symmetrian kapsideja: isometrisen ja kierteisen. Vaipallisten virusten nukleokapsidin rakenne on samanlainen kuin vaipattomien virusten nukleokapsidin rakenne. Virusten kuoren pinnalla erotetaan morfologisesti ekspressoituneet glykoproteiinirakenteet - peplomeerit. Superkapsidikalvon koostumus sisältää lipidejä (jopa 20-35 %) ja hiilihydraatteja (jopa 7-8 %), jotka ovat soluperäisiä. Se koostuu kaksoiskerroksesta solulipidejä ja virusspesifisiä proteiineja, jotka sijaitsevat lipidibiokerroksen ulkopuolella ja sisällä. Superkapsidikalvon ulkokerrosta edustaa yksi tai useampi peplometrityyppi (uloke), joka koostuu yhdestä tai useammasta glykoproteiinimolekyylistä. Vaipallisten virusten nukleokapsidia kutsutaan usein ytimeksi, kun taas nukleiinihapon sisältävien virionien keskusosaa kutsutaan nukleoidiksi. Kapsomeerit (peplomeerit) koostuvat rakenneyksiköistä, jotka on rakennettu yhdestä tai useammasta homologisesta tai heterologisesta polypeptidiketjusta (proteiinialayksiköistä). virusten luokittelu Isometriset kapsidit eivät ole palloja, vaan säännöllisiä monitahoja (ikosaedrejä). Niiden lineaariset mitat ovat identtiset symmetria-akseleilla. Kasparin ja Klugin (1962) mukaan kapsomeerit on järjestetty ikosaedrisen symmetrian mukaan. Tällaiset kapsidit koostuvat identtisistä alayksiköistä, jotka muodostavat ikosaedrin. Niissä on 12 kärkeä (kulmaa), 30 pintaa ja 20 pintaa tasakylkisten kolmioiden muodossa. Tämän säännön mukaan polioviruksen ja suu- ja sorkkatautiviruksen kapsidin muodostaa 60 proteiinirakenneyksikköä, joista jokainen koostuu neljästä polypeptidiketjusta. Ikosaedri ratkaisee optimaalisesti ongelman, joka liittyy toistuvien alayksiköiden pakkaamiseen tiukkaan kompaktiin rakenteeseen minimaalisella tilavuudella. Vain jotkin rakenteellisten alayksiköiden konfiguraatiot voivat muodostaa viruksen ikosaedrin pinnat, kärjet ja pinnat. Esimerkiksi adenoviruksen rakenteelliset alayksiköt muodostavat kuusikulmaisia ​​kapsomeerejä (heksoneja) pinnoilla ja pinnoilla ja viisikulmaisia ​​kapsomeerejä (peptoneja) yläosissa. Joissakin viruksissa molemmat kapsomeerityypit muodostuvat samoista polypeptideistä, toisissa eri polypeptideistä. Koska eri virusten rakenteelliset alayksiköt eroavat toisistaan, jotkut virukset näyttävät olevan kuusikulmainen, toiset pallomaisempia. Kaikilla tunnetuilla DNA:ta sisältävillä selkärankaisten viruksilla, lukuun ottamatta isorokkoviruksia, sekä monilla RNA:ta sisältävillä viruksilla (7 perhettä) on kuutiokapsidisymmetriatyyppi. Reoviruksilla, toisin kuin muilla selkärankaisten viruksilla, on kaksoiskapsidi (ulkoinen ja sisäinen), joista kukin koostuu morfologisista yksiköistä. Kierteisen symmetriatyypin viruksilla on lieriömäinen filamenttirakenne, niiden genominen RNA on spiraalin muotoinen ja sijaitsee kapsidin sisällä. Kaikki kierukkasymmetriset eläinvirukset ovat lipoproteiinikuoren ympäröimiä. Helikaalisille nukleokapsideille on tunnusomaista pituus, halkaisija, heliksin jako ja kapsomeerien lukumäärä kierteen kierrosta kohti. Joten Sendai-viruksessa (paramyksovirus) nukleokapsidi on noin 1 μm pitkä, 20 nm halkaisijaltaan ja 5 nm:n heliksiväli. Kapsidi koostuu noin 2400 rakenneyksiköstä, joista jokainen on proteiini, jonka molekyylipaino on 60 kD. Heliksin kierrosta kohti on 11-13 alayksikköä. Viruksissa, joissa on kierteinen nukleokapsidisymmetria, proteiinimolekyylien laskostuminen heliksiksi varmistaa maksimaalisen vuorovaikutuksen nukleiinihapon ja proteiinialayksiköiden välillä. Ikosaedrisissä viruksissa nukleiinihappo kiertyy virionien sisällä ja on vuorovaikutuksessa yhden tai useamman kapsidin sisällä sijaitsevan polypeptidin kanssa.

Antireseptorit (reseptorit) Virus- pintavirioniproteiinit, esimerkiksi hemagglutiniini, jotka sitoutuvat komplementaarisesti herkän solun vastaavaan reseptoriin.

21) Immunologiset menetelmät virologisessa tutkimuksessa.

Serologisten testien kyky havaita yksittäisiä vasta-aineluokkia vaihtelee. Esimerkiksi agglutinaatiotesti on hyvä IgM-vasta-aineiden havaitsemiseen, mutta se on vähemmän herkkä IgG-vasta-aineiden havaitsemiseen. Komplementin kiinnittymis- ja hemolyysikokeet, jotka vaativat komplementtia, eivät havaitse komplementtiin kiinnittymättömiä vasta-aineita, kuten IgA- ja IgE-vasta-aineita. Viruksen neutralointireaktioon osallistuvat vain vasta-aineet, jotka on suunnattu patogeenisyyteen liittyvien virionin pinnan antigeenideterminantteja vastaan. Herkkyys I. m. ja. ylittää kaikki muut menetelmät antigeenien ja vasta-aineiden tutkimiseen, erityisesti radioimmunomääritys ja entsyymi-immunomääritys mahdollistavat proteiinin läsnäolon havaitsemisen nanogrammoina ja jopa pikogrammeina mitattuna. I. m.:n ja. määritä ryhmä ja tarkista veren turvallisuus (hepatiitti B ja HIV-infektio). Kankaiden ja ruumiiden siirtämisessä Ja. m. mahdollistavat kudosyhteensopivuuden määrittämisen ja yhteensopimattomuuden vaimennusmenetelmien testauksen. Oikeuslääketieteessä Castellani-reaktiota käytetään määrittämään proteiinin lajispesifisyys ja agglutinaatioreaktiota veriryhmän määrittämiseen.

Immunologisia menetelmiä käytetään laajalti tartuntatautien laboratoriodiagnostiikassa. Sairauden etiologia selviää myös sen perusteella, kuinka paljon vasta-aineita taudinaiheuttajalle on lisääntynyt toipilaan veren seerumissa verrattuna taudin ensimmäisinä päivinä otettuun näytteeseen. Perustuu I. m. ja. tutkia väestön immuniteettia massatartuntojen, kuten influenssan, suhteen ja arvioida myös ennaltaehkäisevien rokotusten tehokkuutta.

Riippuen niiden mekanismista ja tulosten tilistä I. m. ja. voidaan jakaa agglutinaatioilmiöön perustuviin reaktioihin; reaktiot, jotka perustuvat saostumisilmiöön; reaktiot, joihin liittyy komplementti; neutralointireaktio; reaktiot kemiallisilla ja fysikaalisilla menetelmillä.

Agglutinaatioilmiöön perustuvat reaktiot. Agglutinaatio on solujen tai yksittäisten hiukkasten - antigeenin kantajien - liimaamista tähän antigeeniin immuuniseerumin avulla.

Bakteerien agglutinaatiotesti sopivalla antibakteerisella seerumilla on yksi yksinkertaisimmista serologisista testeistä. Bakteerisuspensio lisätään testatun veriseerumin erilaisiin laimennoksiin ja tietyn kosketusajan jälkeen t ° 37 °:ssa rekisteröidään, missä veren seerumin agglutinaation korkein laimennos tapahtuu. Bakteerien agglutinaatioreaktiota käytetään monien tartuntatautien diagnosointiin: luomistauti, tularemia, lavantauti ja paratyfoidi, basillaarinen punatauti ja lavantauti.

Passiivisen tai epäsuoran hemagglutinaation (RPGA, RNGA) reaktio. Se käyttää erytrosyyttejä tai neutraaleja synteettisiä materiaaleja (esimerkiksi lateksihiukkasia), joiden pinnalle adsorboituu antigeenejä (bakteeri-, virus-, kudos-) tai vasta-aineita. Niiden agglutinaatio tapahtuu, kun sopivat seerumit tai antigeenit lisätään.

Passiivista hemagglutinaatioreaktiota käytetään bakteerien (lavantauti ja sivutauti, punatauti, luomistauti, rutto, kolera jne.), alkueläinten (malaria) ja virusten (influenssa, adenovirusinfektiot, virushepatiitti B, tuhkarokko, punkkien levittämä) aiheuttamien sairauksien diagnosointiin. enkefaliitti, Krimin verenvuotokuume jne.), sekä tiettyjen hormonien määrittämiseen, potilaan yliherkkyyden tunnistamiseksi lääkkeille ja hormoneille, kuten penisilliinille ja insuliinille.

Hemagglutinaation estotesti (HITA) perustuu ilmiöön, joka estää (estää) immuuniseerumin erytrosyyttien hemagglutinaation virusten vaikutuksesta, ja sitä käytetään virusten vasta-aineiden havaitsemiseen ja titraamiseen. Se toimii pääasiallisena influenssan, tuhkarokkon, vihurirokon, sikotautien, puutiaisaivotulehduksen ja muiden virusinfektioiden, joiden aiheuttajilla on hemagglutinoivaa ominaisuuksia, serodiagnosointimenetelmänä. esimerkiksi puutiaisaivotulehduksen serodiagnosointia varten potilaan seerumin kaksinkertaiset laimennokset alkalisessa boraattipuskuriliuoksessa kaadetaan paneelin kuoppiin. Sitten lisätään tietty määrä, yleensä 8 AU (agglutinaatioyksikköä) puutiaisaivotulehdusantigeeniä, ja 18 tunnin altistuksen jälkeen t ° 4 °:ssa lisätään happamaan fosfaattipuskuriliuokseen valmistettu hanhen erytrosyyttien suspensio. Jos potilaan veren seerumissa on vasta-aineita puutiaisaivotulehdusvirukselle, antigeeni neutraloituu eikä punasolujen agglutinaatiota tapahdu.

Sadeilmiöön perustuvat reaktiot. Saostuminen tapahtuu vasta-aineiden ja liukoisten antigeenien vuorovaikutuksen seurauksena. Yksinkertaisin esimerkki saostumisreaktiosta on läpinäkymättömän saostumisvyöhykkeen muodostuminen koeputkessa vasta-aineen antigeenin kerrostumisen rajalle. Laajalti käytössä on erilaisia ​​saostusreaktioita puolinestemäisissä agar- tai agaroosigeeleissä (Ouchterlonin kaksoisimmunodiffuusiomenetelmä, radiaalinen immunodiffuusiomenetelmä, immunoelektroforeesi), jotka ovat sekä kvalitatiivisia että kvantitatiivisia. Antigeenien ja vasta-aineiden vapaan diffuusion seurauksena geelissä niiden optimaalisen suhteen vyöhykkeellä muodostuu spesifisiä komplekseja - saostumisvyöhykkeitä, jotka havaitaan visuaalisesti tai värjäämällä. Menetelmän ominaisuus on, että jokainen antigeeni-vasta-aine-pari muodostaa yksilöllisen saostumisvyöhykkeen, eikä reaktio riipu muiden antigeenien ja vasta-aineiden läsnäolosta tutkittavassa järjestelmässä.

Reaktiot, joissa on mukana komplementti, jota käytetään tuoreena marsun seerumina, perustuvat Clq-komplementin alakomponentin ja sitten muiden komplementin komponenttien kykyyn kiinnittyä immuunikomplekseihin.

Komplementin kiinnitysreaktio (CFR) mahdollistaa antigeenien tai vasta-aineiden titrauksen antigeeni-vasta-ainekompleksin komplementin kiinnittymisasteen mukaan. Tämä reaktio koostuu kahdesta vaiheesta: antigeenin vuorovaikutus testiveriseerumin kanssa (testijärjestelmä) ja hemolyyttisen seerumin vuorovaikutus lampaan erytrosyyttien kanssa (indikaattorijärjestelmä). Positiivisella reaktiolla komplementin kiinnittyminen tapahtuu tutkittavassa järjestelmässä, ja sitten vasta-aineilla herkistettyjä erytrosyyttejä lisättäessä hemolyysiä ei havaita. Reaktiota käytetään kupan (Wassermann-reaktio), virus- ja bakteeri-infektioiden serodiagnosointiin.

Neutralointireaktio perustuu vasta-aineiden kykyyn neutraloida tiettyjä makromolekyylisten tai liukoisten antigeenien erityistoimintoja, kuten entsyymiaktiivisuutta, bakteerimyrkkyjä ja virusten patogeenisyyttä. Toksiinien neutralointireaktiota voidaan arvioida biologisen vaikutuksen perusteella, esimerkiksi anti-tetanus- ja anti-botuliiniseerumit titrataan. Eläimille annettu toksiinin ja antiseerumin seos ei aiheuta niiden kuolemaa. Virologiassa käytetään erilaisia ​​neutralointireaktion muunnelmia. Kun viruksia sekoitetaan sopivan antiseerumin kanssa ja tätä seosta annetaan eläimille tai soluviljelmille, virusten patogeenisyys neutraloituu ja eläimet eivät sairastu, eivätkä viljelmien solut tuhoudu.

Reaktiot käyttämällä kemiallisia ja fysikaalisia leimoja. Immunofluoresenssi koostuu fluorokromi-leimattujen vasta-aineiden, tarkemmin sanottuna IgG-vasta-aineiden immunoglobuliinifraktion käytöstä. Fluorokromilla leimattu vasta-aine muodostaa antigeenin kanssa antigeeni-vasta-ainekompleksin, joka on käytettävissä mikroskoopilla havainnoitavissa UV-säteissä, jotka virittävät fluorokromin luminesenssia. Suoraa immunofluoresenssireaktiota käytetään solujen antigeenien tutkimiseen, viruksen havaitsemiseen infektoituneista soluista sekä bakteereiden ja riketsian havaitsemiseen sivelemistä.

Epäsuoran immunofluoresenssin menetelmää käytetään laajemmin. perustuu antigeeni-vasta-ainekompleksin havaitsemiseen käyttämällä luminoivia anti-lgG-vasta-aineseerumeja, ja sitä käytetään paitsi antigeenien havaitsemiseen myös vasta-aineiden titraamiseen.

Immunoentsyymi- eli entsyymi-immunologiset menetelmät perustuvat entsyymeihin, pääasiassa piparjuuriperoksidaasiin tai alkaliseen fosfataasiin, konjugoitujen vasta-aineiden käyttöön. Kuten immunofluoresenssi, entsyymi-immunomääritystä käytetään antigeenien havaitsemiseen soluissa tai vasta-aineiden titraamiseen antigeenia sisältävissä soluissa.

Radioimmunologinen menetelmä perustuu antigeenien tai vasta-aineiden radioisotooppileiman käyttöön. Se on herkin menetelmä antigeenien ja vasta-aineiden määrittämiseen, jota käytetään hormonien, lääkkeiden ja antibioottien määrittämiseen, bakteeri-, virus-, riketsiaali-, alkueläintautien diagnosointiin, veren proteiinien, kudosantigeenien tutkimiseen.

Immunoblottausta käytetään yksittäisten antigeenien vasta-aineiden havaitsemiseen tai antigeenien "tunnistamiseen" tunnetuista seerumeista. Menetelmä koostuu 3 vaiheesta: biologisten makromolekyylien (esimerkiksi viruksen) erottaminen yksittäisiksi proteiineiksi käyttämälläesia; siirretään erotetut proteiinit geelistä kiinteälle alustalle (blot) levittämällä polyakryyliamidigeelilevy aktivoidulle paperille tai nitroselluloosalle (sähköblottaus); haluttujen proteiinien havaitseminen substraatilla käyttämällä suoraa tai epäsuoraa entsyymi-immunomääritystä. Diagnostisena menetelmänä HIV-tartunnalle käytetään immunoblottausta. Diagnostinen arvo on vasta-aineiden havaitseminen jollekin viruksen ulkokuoren proteiineista.

22) Symmetriset virustyypit (kuutio-, kierukka-, sekamuotoiset). Proteiinien ja nukleiinihappojen vuorovaikutus virusgenomien pakkauksessa.

Riippuen kapsidin vuorovaikutuksesta nukleiinihapon kanssa, viruspartikkelit voidaan jakaa useisiin symmetriatyyppeihin:

1). Kuutiosymmetrinen tyyppi.

Kuutiokapsidit ovat ikosidereita, joissa on noin 20 kolmiomaista pintaa ja 12 kärkeä. Ne muodostavat rakenteen, joka muistuttaa pallomaista muodostumaa, mutta itse asiassa se on monitahoinen. Joissakin tapauksissa erityisiä lipoproteiinimuodostelmia, joita kutsutaan piikkeiksi, on kiinnitetty tällaisten ikosaedristen monitahojen kärkiin. Näiden piikkien rooli oletettavasti rajoittuu virionien tai viruspartikkelien vuorovaikutukseen vastaavien isäntäsolujen alueiden kanssa, jotka ovat herkkiä niille. Kuutiosymmetrialla virusnukleiinihappo pakataan tiukasti (rullataan palloksi), ja proteiinimolekyylit ympäröivät sitä muodostaen monitahoisen (ikosaedrin). Ikosaedri on monitahoinen, jossa on kaksikymmentä kolmion muotoista pintaa, jolla on kuutiosymmetria ja suunnilleen pallomainen muoto. Icosahedral viruksia ovat herpes simplex -virus, reovirukset jne.

2). Spiraalisymmetrinen tyyppi. Spiraalikapsidit ovat hieman yksinkertaisempia. Nuo. Kapsidin muodostavat kapsomeerit peittävät kierteisen NK:n ja muodostavat myös näiden virusten melko vakaan proteiinikuoren. Ja kun käytetään korkearesoluutioisia elektronimikroskooppeja ja sopivia valmistusmenetelmiä, voidaan nähdä viruksissa spiraalirakenteita. Kapsidin kierteisellä symmetrialla virusnukleiinihappo muodostaa kierteisen (tai kierteisen) muodon, joka on sisällä ontto, ja proteiinin alayksiköt (kapsomeerit) ovat myös pinottu sen ympärille spiraaliksi (putkimainen kapsidi). Esimerkki viruksesta, jolla on kapsidin kierteinen symmetria, on tupakan mosaiikkivirus, joka on sauvan muotoinen ja sen pituus on 300 nm ja halkaisija 15 nm. Viruspartikkelin koostumus sisältää yhden RNA-molekyylin, jonka koko on noin 6000 nukleotidia. Kapsidi koostuu 2000 identtisestä proteiinialayksiköstä, jotka on järjestetty heliksiin.

3). Sekoitettu tai monimutkainen symmetriatyyppi. Yleensä tämän tyyppinen symmetria löytyy pääasiassa bakteeriviruksista. Ja klassisia esimerkkejä ovat ne faagit, E. coli tai lauhkeat faagit. Nämä ovat monimutkaisia ​​muodostelmia, joissa on pää, jossa on sisäinen nukleiinisisältö, erilaisia ​​​​lisäkkeitä, häntäprosessi ja monimutkainen laite. Ja jokaisella tällaisten hiukkasten komponentilla on tietty toiminto, joka toteutuu viruksen ja solun välisessä vuorovaikutuksessa. Toisin sanoen monimutkainen symmetriatyyppi on yhdistelmä kuutiosymmetriaa, pää on ikosider-polyhedron ja sauvamaiset muodostelmat ovat häntäprosesseja. Vaikka bakteerivirusten joukossa on myös yksinkertaisesti järjestäytyneitä virioneja, jotka ovat primitiivisiä nukleokapsideja, muodoltaan pallomaisia ​​tai kuutioisia. Bakteerivirukset ovat monimutkaisempia kuin kasvi- ja eläinvirukset.

24) Faagin vuorovaikutus solun kanssa. Virulentit ja lauhkeat faagit.

Adsorptio.

Vuorovaikutus alkaa viruspartikkelien kiinnittymisestä solun pintaan. Prosessi tulee mahdolliseksi sopivien reseptorien läsnä ollessa solun pinnalla ja antireseptoreiden läsnä ollessa viruspartikkelin pinnalla.

Virukset käyttävät solureseptoreita, jotka on suunniteltu kuljettamaan välttämättömiä aineita: ravintoainehiukkasia, hormoneja, kasvutekijöitä jne.

Reseptorit: proteiinit, proteiinien ja lipidien hiilihydraattikomponentti, lipidit. Spesifiset reseptorit määräävät viruspartikkelin jatkokohtalon (kuljetus, kuljetus sytoplasman tai tuman alueille). Virus voi kiinnittyä epäspesifisiin reseptoreihin ja jopa tunkeutua soluun. Tämä prosessi ei kuitenkaan aiheuta infektiota.

Aluksi muodostuu yksittäinen sidos antireseptorin ja reseptorin välille. Tämä side on hauras ja voi katketa. Peruuttamattoman adsorption muodostumiseen tarvitaan moniarvoinen kiinnitys. Stabiili sitoutuminen tapahtuu reseptorimolekyylien vapaan liikkeen ansiosta kalvossa. Viruksen vuorovaikutuksen aikana solun kanssa havaitaan lipidien juoksevuuden lisääntymistä ja reseptorikenttien muodostumista viruksen ja solun välisen vuorovaikutuksen alueella. Useiden virusten reseptorit voivat olla läsnä vain rajoitetussa isäntäsolujoukossa. Tämä määrittää organismin herkkyyden tälle virukselle. Siten viruksen DNA:lla ja RNA:lla on kyky infektoida laajempi valikoima isäntäsoluja.

Antireseptoreita löytyy ainutlaatuisista virusorganelleista: uloskasvurakenteet T-bakteriofageissa, kuidut adenoviruksissa, piikit viruskalvojen pinnalla, korona koronaviruksissa.

Läpäisy.

2 mekanismia - reseptorin endosytoosi ja kalvofuusio.

Reseptorin endosytoosi:

Tavallinen mekanismi ravinteiden ja säätelyaineiden pääsylle soluun. Esiintyy erikoisalueilla - missä on erityisiä klatriinilla peitettyjä kuoppia, erityiset reseptorit sijaitsevat kuopan pohjalla. Kuopat mahdollistavat nopean tunkeutumisen ja klatriinilla peitettyjen tyhjien muodostumisen (adsorptiohetkestä ei kulu yli 10 minuuttia, minuutissa voi muodostua jopa 2000 vakuolia). Vakuolit fuusioituvat suurempien sytoplasmisten vakuolien kanssa muodostaen reseptorosomeja (jotka eivät enää sisällä klatriinia), jotka puolestaan ​​sulautuvat lysosomien kanssa.

Viruksen ja solukalvojen fuusio:

Vaipallisissa viruksissa fuusiota välittävät virusproteiinin pistevuorovaikutukset solukalvon lipidien kanssa, mikä johtaa viruksen lipoproteiinikuoren integroitumiseen solukalvon kanssa. Vaipattomissa viruksissa yksi pintaproteiineista on myös vuorovaikutuksessa solukalvon lipidien kanssa ja sisäinen komponentti kulkee kalvon läpi (paramyksoviruksissa F-proteiini; ortomyksoviruksissa hemagglutinoiva HA2-alayksikkö). Pintaproteiinien konformaatioon vaikuttaa pH.

Strip.

Tässä prosessissa tarttuva aktiivisuus häviää, herkkyys nukleaaseille ilmaantuu usein ja syntyy vastustuskykyä vasta-aineille. Riisumisen lopputuote on sisäiseen virusproteiiniin sitoutuneet nukleiinihapot. Riisuutumisvaihe rajoittaa myös tartunnan mahdollisuutta (virukset eivät pysty riisuutumaan joka solussa). Riisuminen tapahtuu solun erityisalueilla: lysosomeissa, Golgi-laitteistossa ja perinukleaarisessa tilassa.

Riisuminen tapahtuu useiden reaktioiden seurauksena. Esimerkiksi pikornaviruksissa riisuminen etenee siten, että muodostuu subviraalisia välihiukkasia, joiden koko on 156-12S. Adenoviruksissa sytoplasmassa ja tumahuokosissa ja sillä on vähintään 3 vaihetta:

Subviraalisten hiukkasten muodostuminen, joiden tiheys on suurempi kuin virionit;

Sellaisten ytimien muodostuminen, joista puuttuu 3 virusproteiinia;

DNA-proteiinikompleksin muodostuminen, jossa DNA on kovalenttisesti kytketty terminaaliseen proteiiniin.

Virulenttien ja lauhkeiden faagien karakterisointi.

Kun bakteeri infektoidaan faagilla, tapahtuu ns. lyyttinen infektio, eli infektio päättyy isäntäsolun hajoamiseen, mutta tämä on ominaista vain ns. virulenteille faageille, joiden vuorovaikutus solun kanssa on johtaa solukuolemaan ja faagijälkeläisten muodostumiseen.

Samanaikaisesti faagin ja solun vuorovaikutusten mukaan erotetaan seuraavat vaiheet: faagin sekoittaminen soluviljelmään (infektion moninkertaisuus on 1 faagi 10 solua kohti), ja pitoisuuden tulee olla riittävän korkea, jotta faagit voivat koskettaa soluja. Uudelleentartunnan välttämiseksi - enintään 5 minuutin infektion jälkeen, kun faagit ovat adsorboituneet - tämä soluseos faagin kanssa laimennetaan. On piilevä ajanjakso, jonka aikana faagien määrä ei kasva, sitten hyvin lyhyt poistumisjakso, jolloin faagipartikkelien määrä kasvaa jyrkästi, jolloin solu hajoaa ja faagien jälkeläisiä vapautuu, ja sitten faagien lukumäärä pysyy samalla tasolla, koska uudelleentartuntaa ei tapahdu. Tämän käyrän perusteella nämä vaiheet voidaan erottaa: "kasvun" vegetatiivinen jakso (latentti jakso), poistumisjakso ja laskea faagisaanto yhtä infektoitunutta solua kohti. Latenttijakson aikana bakteereista ei löydy mitään faagipartikkeleita muistuttavaa, eikä piilevänä aikana ole mahdollista eristää tarttuvaa periaatetta tällaisista soluista. Vain kypsät faagihiukkaset voivat tartuttaa bakteereja. Siten virulentit faagit aiheuttavat aina bakteerien kuoleman ja aiheuttavat infektion, joka paljastuu uusien viruspartikkelien tuotannossa, jotka kykenevät infektoimaan seuraavat ja muut herkät solut.

Toisin kuin virulentit, lauhkeiden faagien infektio ei johda bakteerisolujen hajoamiseen, vaan faagin ja bakteerisolun erityinen rinnakkaiselon tilan muodostuminen toteutuu. Tämä rinnakkaiselo ilmenee siinä, että faagin tietty alku on läsnä bakteerisolussa ilman sille epäsuotuisia olosuhteita ja säilyy sukupolvelta toiselle. Tällaisen rinnakkaiselon tietyissä vaiheissa faagi aktivoituu solussa ja siirtyy lyyttisen kehityssyklin tilaan aiheuttaen solujen hajoamista ja faagin jälkeläisten vapautumista. Tällaisia ​​faageja kutsutaan lysogeenisiksi tai lauhkeiksi faageiksi, ja kohtalaisen olemassaolon tila faagin kanssa on lysogenia, ja bakteereja, jotka sisältävät tällaisen piilevän faagin, kutsutaan lysogeenisiksi bakteereiksi. Termi lysogeeniset bakteerit tuli siitä tosiasiasta, että kerran löydettiin viljelmiä, joissa faagi ilmestyi spontaanisti, ja tätä bakteriofagia alettiin pitää viljelmän kontaminaationa, eli bakteerivirus tulee viljelmään, ja tällaisia ​​viljelmiä kutsuttiin lysogeenisiksi, eli ne tuottavat hajoamista.

menetelmät virusten biologian tutkimiseksi ja niiden tunnistamiseksi. Virologiassa käytetään laajalti molekyylibiologian menetelmiä, joiden avulla pystyttiin selvittämään viruspartikkelien molekyylirakenne, kuinka ne tunkeutuvat soluun ja virusten lisääntymisen ominaisuudet, virusnukleiinihappojen primäärirakenne ja proteiineja. Menetelmiä viruksen nukleiinihappojen ja proteiinien aminohappojen ainesosien sekvenssin määrittämiseksi kehitetään. On mahdollista yhdistää nukleiinihappojen ja niiden koodaamien proteiinien toiminnot nukleotidisekvenssiin ja selvittää solunsisäisten prosessien syyt, joilla on tärkeä rooli virusinfektion patogeneesissä.

Virologiset tutkimusmenetelmät perustuvat myös immunologisiin prosesseihin (antigeenin vuorovaikutus vasta-aineiden kanssa), viruksen biologisiin ominaisuuksiin (hemagglutinaatiokyky, hemolyysi, entsymaattinen aktiivisuus), viruksen vuorovaikutuksen ominaisuuksiin isäntäsolun kanssa (sytopaattisen solun luonne). vaikutus, solunsisäisten sulkeumien muodostuminen jne.).

Virusinfektioiden diagnosoinnissa, virusten viljelyssä, eristämisessä ja tunnistamisessa sekä rokotevalmisteiden valmistuksessa käytetään laajasti kudos- ja soluviljelymenetelmää. Käytetään primaarisia, sekundaarisia, stabiileja jatkuvia ja diploidisia soluviljelmiä. Primääriviljelmät saadaan dispergoimalla kudosta proteolyyttisillä entsyymeillä (trypsiini, kollagenaasi). Solujen lähde voivat olla ihmisten ja eläinten alkioiden kudokset ja elimet (useammin munuaiset). Solususpensio ravintoalustassa asetetaan ns. patjoihin, pulloihin tai petrimaljoihin, joissa suonen pintaan kiinnittymisen jälkeen solut alkavat lisääntyä. Virusinfektioon käytetään yleensä yksisolukerrosta. Ravinneneste valutetaan, virussuspensio lisätään tietyissä laimennoksissa ja solujen kanssa kosketuksen jälkeen lisätään tuoretta ravintoalustaa, yleensä ilman seerumia.

Useimmista primääriviljelmistä peräisin olevia soluja voidaan jatkoviljellä, ja niitä kutsutaan sekundaariviljelmiksi. Kun solut kulkevat edelleen, muodostuu fibroblastin kaltaisten solujen populaatio, joka kykenee lisääntymään nopeasti ja joista suurin osa säilyttää alkuperäisen kromosomijoukon. Nämä ovat niin sanottuja diploidisia soluja. Solujen sarjaviljelyssä saadaan stabiileja jatkuvia soluviljelmiä. Siirtojen aikana ilmaantuu nopeasti jakautuvia homogeenisia soluja, joissa on heteroploidinen kromosomisarja. Stabiilit solulinjat voivat olla yksikerroksisia ja suspensioita. Yksikerroksiset viljelmät kasvavat jatkuvan kerroksen muodossa lasin pinnalla, suspensioviljelmät kasvavat suspensioina erilaisissa astioissa sekoittimia käyttäen. Siellä on yli 400 solulinjaa, jotka on peräisin 40 eri eläinlajista (mukaan lukien kädelliset, linnut, matelijat, sammakkoeläimet, kalat, hyönteiset) ja ihmisistä.

Yksittäisten elinten ja kudosten paloja (elinviljelmiä) voidaan viljellä keinotekoisissa ravintoaineissa. Tämäntyyppiset viljelmät säilyttävät kudosrakenteen, mikä on erityisen tärkeää erilaistumattomissa kudosviljelmissä lisääntymättömien virusten (esimerkiksi koronavirukset) eristämisessä ja siirrossa.

Infektoituneissa soluviljelmissä virukset voidaan havaita solun morfologian muutoksella, sytopaattisella vaikutuksella, joka voi olla spesifinen, inkluusioiden esiintymisellä, määrittämällä virusantigeenit solussa ja viljelynesteessä; viruksen jälkeläisten biologisten ominaisuuksien määrittäminen viljelynesteessä ja virusten titraus kudosviljelmässä, kananpoikien alkioissa tai herkissä eläimissä; havaitsemalla yksittäisiä virusnukleiinihappoja soluissa molekyylihybridisaatiolla tai nukleiinihappoklustereita sytokemiallisella menetelmällä käyttäen fluoresenssimikroskopiaa.

Virusten eristäminen on työläs ja pitkä prosessi. Se suoritetaan väestön keskuudessa kiertävän viruksen tyypin tai muunnelman määrittämiseksi (esimerkiksi influenssaviruksen serovariantin, polioviruksen villi- tai rokotekannan tunnistamiseksi jne.); tapauksissa, joissa on tarpeen toteuttaa kiireellisiä epidemiologisia toimenpiteitä; kun uusia virustyyppejä tai muunnelmia ilmaantuu; tarvittaessa vahvista alustava diagnoosi; virusten osoittamiseen ympäristön kohteissa. Viruksia eristettäessä otetaan huomioon mahdollisuus niiden säilymiseen ihmiskehossa sekä kahden tai useamman viruksen aiheuttaman sekainfektion esiintyminen. Yhdestä virionista saatua geneettisesti homogeenista viruspopulaatiota kutsutaan virusklooniksi ja sen hankintaprosessia kloonaukseksi.

Virusten eristämiseen käytetään herkkien laboratorioeläinten infektioita, kanan alkioita, mutta useimmiten käytetään kudosviljelmää. Viruksen esiintyminen määräytyy yleensä spesifisen solun rappeutumisen (sytopaattisen vaikutuksen), symplastien ja synsytian muodostumisen, solunsisäisten sulkeumien havaitsemisen sekä immunofluoresenssin, hemadsorption, hemagglutinaation (hemagglutinaatioviruksissa) jne. avulla. . Nämä merkit voidaan havaita vasta 2-3 viruksen läpikulkukerran jälkeen.

Useiden virusten, kuten influenssavirusten, eristämiseen käytetään kanan alkioita, joidenkin Coxsackie-virusten ja useiden arbovirusten eristämiseen käytetään vastasyntyneitä hiiriä. Eristettyjen virusten tunnistaminen suoritetaan serologisilla testeillä ja muilla menetelmillä.

Kun työskentelet virusten kanssa, niiden tiitteri määritetään. Virusten titraus suoritetaan yleensä kudosviljelmässä määrittämällä virusta sisältävän nesteen suurin laimennus, jossa tapahtuu kudosten rappeutumista, muodostuu sulkeumia ja virusspesifisiä antigeenejä. Plakkimenetelmää voidaan käyttää useiden virusten titraamiseen. Plakit tai negatiiviset viruspesäkkeet ovat yksikerroksisen kudosviljelmän viruksen tuhoamien solujen pesäkkeitä agar-päällysteen alla. Pesäkkeiden laskenta mahdollistaa virusten tarttuvan aktiivisuuden kvantitatiivisen analyysin sen perusteella, että yksi tarttuva viruspartikkeli muodostaa yhden plakin. Plakit tunnistetaan värjäämällä viljelmä elintärkeillä väriaineilla, yleensä neutraalilla punaisella; plakit eivät adsorboi väriainetta ja ovat siksi näkyvissä vaaleina täplinä värjäytyneiden elävien solujen taustalla. Viruksen tiitteri ilmaistaan ​​plakkia muodostavien yksiköiden lukumääränä 1:ssä ml.

Virusten puhdistus ja väkevöinti suoritetaan tavallisesti differentiaalisella ultrasentrifugoinnilla, jota seuraa sentrifugointi konsentraatio- tai tiheysgradienteissa. Virusten puhdistamiseen käytetään immunologisia menetelmiä, ioninvaihtokromatografiaa, immunosorbentteja jne.

Virusinfektioiden laboratoriodiagnostiikka sisältää taudinaiheuttajan tai sen komponenttien havaitsemisen kliinisestä materiaalista; viruseristys tästä materiaalista; serodiagnoosi. Laboratoriodiagnostiikkamenetelmän valinta kussakin yksittäistapauksessa riippuu taudin luonteesta, taudin ajanjaksosta ja laboratorion kyvyistä. Nykyaikainen virusinfektioiden diagnostiikka perustuu express-menetelmiin, joiden avulla saat vasteen muutaman tunnin kuluttua kliinisen materiaalin ottamisesta taudin varhaisessa vaiheessa. Näitä ovat elektroni- ja immuunielektronimikroskooppi sekä immunofluoresenssi, molekyylihybridisaatiomenetelmä. , IgM-luokan vasta-aineiden havaitseminen jne.

Negatiivisti värjäytyneiden virusten elektronimikroskopia mahdollistaa virusten erottamisen ja niiden pitoisuuden määrittämisen. Elektronimikroskopian käyttö virusinfektioiden diagnosoinnissa rajoittuu tapauksiin, joissa viruspartikkelien pitoisuus kliinisessä materiaalissa on riittävän korkea (10 5/1 ml ja korkeampi). Menetelmän haittana on kyvyttömyys erottaa samaan taksonomiseen ryhmään kuuluvia viruksia. Tämä haitta poistetaan käyttämällä immuunielektronimikroskooppia. Menetelmä perustuu immuunikompleksien muodostumiseen, kun viruspartikkeleihin lisätään spesifistä seerumia, samalla kun viruspartikkeleita konsentroidaan samanaikaisesti, mikä mahdollistaa niiden tunnistamisen. Menetelmää käytetään myös vasta-aineiden havaitsemiseen. Expressdiagnostiikasta varten suoritetaan elektronimikroskooppitutkimus kudosuutteista, ulosteista, vesikkeleistä ja nenänielun eritteistä. Elektronimikroskopiaa käytetään laajalti viruksen morfogeneesin tutkimiseen, sen ominaisuuksia laajennetaan käyttämällä leimattuja vasta-aineita.

Virusspesifisten nukleiinihappojen havaitsemiseen perustuva molekyylihybridisaatiomenetelmä mahdollistaa yksittäisten geenikopioiden havaitsemisen, eikä sille ole herkkyydeltään vertaista. Reaktio perustuu DNA:n tai RNA:n komplementaaristen juosteiden (koettimien) hybridisaatioon ja kaksijuosteisten rakenteiden muodostumiseen. Halvin koetin on kloonattu yhdistelmä-DNA. Koetin on leimattu radioaktiivisilla esiasteilla (yleensä radioaktiivisella fosforilla). Kolorimetristen reaktioiden käyttö on lupaavaa. Molekyylihybridisaatiosta on useita muunnelmia: pistehybridisaatio, blot-hybridisaatio, sandwich-hybridisaatio, in situ -hybridisaatio jne.

LgM-luokan vasta-aineet ilmaantuvat aikaisemmin kuin luokan G vasta-aineet (3-5. sairauspäivänä) ja häviävät muutaman viikon kuluttua, joten niiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon. IgM-luokan vasta-aineet havaitaan immunofluoresenssi- tai entsyymi-immunomäärityksellä käyttämällä anti-μ-antiseerumia (anti-IgM-raskasketjuseerumia).

Virologian serologiset menetelmät perustuvat klassisiin immunologisiin reaktioihin (ks. Immunologiset tutkimusmenetelmät) : komplementin kiinnitysreaktiot, hemagglutinaation esto, biologinen neutralointi, immunodiffuusio, epäsuora hemagglutinaatio, radiaalinen hemolyysi, immunofluoresenssi, entsyymi-immunomääritys, radioimmunomääritys. Moniin reaktioihin on kehitetty mikromenetelmiä, ja niiden tekniikoita kehitetään jatkuvasti. Näitä menetelmiä käytetään virusten tunnistamiseen tunnettujen seerumeiden avulla ja serodiagnosointiin, jotta voidaan määrittää vasta-aineiden lisääntyminen toisessa seerumissa ensimmäiseen verrattuna (ensimmäinen seerumi otetaan ensimmäisinä päivinä taudin jälkeen, toinen - sen jälkeen 2-3 viikkoa). Diagnostinen arvo on vähintään nelinkertainen vasta-aineiden lisääntyminen toisessa seerumissa. Jos lgM-luokan vasta-aineiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon, lgC-luokan vasta-aineet säilyvät useita vuosia ja joskus koko elämän.

Virusten yksittäisten antigeenien ja niiden vasta-aineiden tunnistamiseksi monimutkaisissa seoksissa ilman edeltävää proteiinipuhdistusta käytetään immunoblottausta. Menetelmässä yhdistetään proteiinifraktiointi käyttäen polyja sitä seuraava proteiinien immunomääritys entsyymi-immunomäärityksellä. Proteiinien erottelu vähentää antigeenin kemiallisen puhtauden vaatimuksia ja mahdollistaa yksittäisten antigeeni-vasta-aine-parien tunnistamisen. Tämä tehtävä on olennainen esimerkiksi HIV-infektion serodiagnosissa, jossa väärät positiiviset entsyymi-immunomääritysreaktiot johtuvat vasta-aineiden läsnäolosta soluantigeeneille, joita esiintyy virusproteiinien riittämättömän puhdistuksen seurauksena. Vasta-aineiden tunnistaminen potilaiden seerumeista sisäisille ja ulkoisille virusantigeeneille mahdollistaa taudin vaiheen määrittämisen ja populaatioiden analysoinnissa virusproteiinien vaihtelun. HIV-infektion immunoblottausta käytetään varmistustestinä yksittäisten virusantigeenien ja niiden vasta-aineiden havaitsemiseksi. Populaatioita analysoitaessa menetelmällä määritetään virusproteiinien vaihtelu. Menetelmän suuri arvo on mahdollisuudessa analysoida yhdistelmä-DNA-tekniikalla syntetisoituja antigeenejä, selvittää niiden koko ja antigeenideterminanttien läsnäolo.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virology, Methods, toim. B. Meikhi, käänn. Englannista, M., 1988; Mikrobiologisten ja virologisten tutkimusmenetelmien käsikirja, toim. M.O. Birger, M., 1982.

• - menetelmät orgaanisia aineita sisältävien jätteiden neutraloimiseksi, jotka perustuvat niiden kuumentamiseen termofiilisten aerobisten mikro-organismien elintärkeän toiminnan seurauksena ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - histokemialliset menetelmät entsyymien havaitsemiseksi, jotka perustuvat kalsium- tai magnesiumfosfaattisaostumien muodostumisen reaktioon entsymaattisen aktiivisuuden paikallistamisessa inkuboitaessa kudosleikkeitä orgaanisen ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - menetelmät histiosyyttien havaitsemiseksi hermokudoksen ja eri elinten valmisteissa käyttämällä ammoniakkihopeaa tai hopeapyridiini-soodaliuoksia ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - menetelmät perinnöllisyyden luonteeseen liittyvien oletusten arvioimiseksi, jotka perustuvat perinnöllisistä sairauksista kärsivien perheiden sairaiden ja terveiden ihmisten havaittujen ja odotettujen suhteiden vertailuun ottaen huomioon menetelmän ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - käytetään ihmisten, eläinten ja kasvien solujen ja kudosten rakenteen ja toiminnan tutkimiseen normaaleissa, patologisissa ja kokeellisissa olosuhteissa...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - menetelmät kemikaalien tunnistamiseksi histologisista leikkeistä. Olennainen osa G. m. ovat sytokemiallisia menetelmiä, jotka havaitsevat kemikaaleja valmistettujen sivelysolujen ja tulosteiden soluista ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - menetelmät veren ja virtsan glukoosin kvantitatiiviseksi ja laadulliseksi määrittämiseksi, jotka perustuvat glukoosin hapetukseen ilmakehän hapella glukoosioksidaasientsyymin läsnä ollessa ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - diagnostiset tutkimusmenetelmät, jotka perustuvat antigeenien ja vasta-aineiden spesifiseen vuorovaikutukseen ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - menetelmät sidekudoksen ja neuroglian kuiturakenteiden havaitsemiseksi histologisista valmisteista, jotka perustuvat niiden moniväriseen värjäytymiseen...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - 1) menetelmä dermiksen histologisten valmisteiden värjäämiseksi käyttäen Mayerin hemalunia, kaliumalunaa ja rodamiiniliuosta; soluytimet värjäytyvät siniseksi, eleidiini värjäytyvät punaiseksi...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - lääketieteessä - joukko menetelmiä lääketieteeseen ja terveydenhuoltoon liittyvien esineiden ja järjestelmien tilan ja käyttäytymisen kvantitatiiviseen tutkimukseen ja analysointiin ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - tapoja tutkia erilaisia ​​esineitä mikroskoopilla ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - perustuu optisten lakien käyttöön, jotka liittyvät sähkömagneettisen säteilyn luonteeseen, etenemiseen ja vuorovaikutukseen aineen kanssa optisella alueella ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - ympäristön esineiden laadun tutkimus- ja arviointimenetelmät aistielinten avulla ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - yleisnimi useille menetelmille histologisten valmisteiden kyllästämiseksi hopealla glia- ja muiden argyrofiilisten kuitujen havaitsemiseksi ...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

• - ovat tutkijan ja tuomioistuimen määräämiä ratkaisemaan rikosten tutkinnassa ja siviiliasioiden käsittelyssä ilmeneviä erityiskysymyksiä. Niitä pidetään myös oikeuslääketieteen ehdotuksesta...

  Lääketieteellinen tietosanakirja

"Virologiset tutkimusmenetelmät" kirjoissa

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Los Angeles -yhtyeen Rage Against The Machinen ensimmäinen albumi yhdisti hiphopin ja hard rockin, sirotellen niihin ajankohtaisia ​​poliittisia manifesteja ja miellyttävän annoksen tiivistä funk-rytmiä. Ensimmäiseen singleän sisältyvässä kappaleessa "Killing in the name"

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Seksikone (1970)

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) 1960-luvun lopulla James Brown aloitti kokeiluja. The Famous Flamesin sydäntä särkevä soul väistyi The J.B.:n kiertelevän funkin kanssa. Yksi lähestyvän funk-aikakauden tärkeimmistä virstanpylväistä oli "Sex Machine", joka kymmenen minuutin versiossa

Raivo konetta kohtaan