Het gebruik van de combibest-test bij de diagnose van hiv. Moderne methoden om hiv-infectie te diagnosticeren Video: educatieve film MGMU im.

De eigenaren van het patent RU 2283497:

De uitvinding heeft betrekking op het gebied van biotechnologie en geneeskunde. ELISA-testsysteem voor het identificeren van het spectrum van antilichamen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) van het eerste en tweede type, het eerste type van groep O en detectie van het antigeen tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het eerste type p24 omvat een immunosorbens op basis van humaan immunodeficiëntievirusantigenen die gp41 vertegenwoordigen (env HIV-1 en HIV-2 groep O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antilichamen tegen het HIV-antigeen 1 p24, en detectiereagentia, terwijl de bovengenoemde HIV-antigenen en HIV-antilichamen worden gesorbeerd in verschillende putjes van platen voor enzymimmunoassay, en opvouwbare of niet-opvouwbare platen van polystyreen met 96 putjes worden gebruikt voor sorptie. De uitvinding verschaft verhoogde gevoeligheid, vereenvoudiging, uitsluiting van de subjectiviteit van de evaluatie van de resultaten. 1 z.p. f-ly, 10 tab., 1 afb.

De uitvinding heeft betrekking op het gebied van biotechnologie en geneeskunde. Gebruik: gedifferentieerde detectie van alle klassen van specifieke antilichamen tegen eiwitten van het humaan immunodeficiëntievirus 1 en 2, HIV 1 groep O en HIV 1 p24-antigeen.

Essentie: het verkrijgen van een enzym-immunoassay-testsysteem voor het identificeren van het spectrum van antilichamen van alle klassen tegen individuele eiwitten en HIV 1 en 2, HIV 1 groep O en HIV 1 p24-antigeen in bloedserum (plasma), immunoglobulinen en bloedproducten om te identificeren het spectrum van antilichamen tegen HIV 1 en 2, HIV 1 groep O, detectie van HIV 1 p24-antigeen en bevestiging van positieve of onbepaalde screeningresultaten voor antilichamen tegen HIV 1 en 2, HIV 1 groep O en HIV 1 p24-antigeen.

BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING:

De laboratoriumdiagnose van HIV-infectie is gebaseerd op drie gebieden: a) indicatie van HIV en zijn componenten; b) detectie van antilichamen tegen HIV; c) bepaling van veranderingen in het immuunsysteem. Van de bestaande methoden voor laboratoriumdiagnostiek zijn serologische methoden de meest voorkomende - de detectie van antilichamen tegen virusantigenen.

Om antilichamen bij HIV-infectie te detecteren, worden voornamelijk enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en immunoblotting (IB) gebruikt. De ELISA is gebaseerd op de immobilisatie van virale antigenen op de platen, waaraan de antilichamen van de patiënt binden, en het antigeen-antilichaamcomplex wordt gedetecteerd met behulp van mierikswortelperoxidase-geconjugeerde monoklonale muizenantilichamen tegen humane immunoglobulinen G en M. De methode is vrij specifiek en gevoelig en maakt het mogelijk om bij 95% van de patiënten virusspecifieke antilichamen te detecteren. De overige 5% van de gevallen komt voor in de vroege stadia van infectie, wanneer er nog weinig antilichamen in het bloedserum aanwezig zijn, of in de terminale fasen van de ziekte, wanneer het lichaam niet langer in staat is om antilichamen te synthetiseren als gevolg van een scherpe uitputting van het immuunsysteem. Vals-positieve ELISA-resultaten zijn ook mogelijk, voornamelijk bij patiënten met auto-immuun- en oncologische ziekten, evenals bij infecties veroorzaakt door het Eshptein-Barr-virus. In dit geval reageren antilichamen kruiselings op de reumafactor, het Epstein-Barr-virus of op antigene determinanten die vergelijkbaar zijn met de belangrijkste eiwitten van klasse 1 en 2 van het histocompatibiliteitscomplex (HLA-4 en DQW3) en hebben ze het vermogen om te binden aan HIV-antigenen. Vals-positieve resultaten worden vaak gezien bij zwangere vrouwen en ouderen. Hemolyse, lipemie, bacteriële contaminatie van sera kunnen ook de oorzaak zijn van onbetrouwbare resultaten.

In dit opzicht zijn een aantal methoden voorgesteld en gebruikt om de specificiteit van de resultaten van antilichaamdetectie te testen. Van deze methoden is de meest algemeen gebruikte reactie "immuunblot" bij de modificatie van "Western Blot". De essentie van de methode is als volgt: in de eerste fase worden HIV-eiwitten gescheiden op molecuulgewicht met behulp van polyacrylamidegelelektroforese. Dit wordt gevolgd door elektroforetische overdracht van de polyacrylamidegel naar het oppervlak van het nitrocellulosemembraan. De aldus overgebrachte antigenen worden op het membraan gedetecteerd met behulp van indirecte analyse: het membraan wordt geïncubeerd met het testmateriaal; de aanwezige antilichamen binden aan HIV-antigenen die zijn overgebracht naar een nitrocellulosemembraan, waarna de membraanstrips worden geïncubeerd met het conjugaat; wanneer een antigeen-antilichaamcomplex wordt gevormd, hecht het conjugaat eraan, na wassen van het conjugaat en incubatie met het substraat, vindt de kleuring van die secties van nitrocellulose plaats waar de vorming van het antigeen-antilichaam-conjugaatcomplex plaatsvindt. De tekening toont voorbeelden van positieve, zwak positieve en negatieve immunoblotresultaten.

In het serum van met HIV-1 en HIV-2 geïnfecteerde personen worden antilichamen tegen de volgende eiwitten (p) en glycoproteïnen (gp) gevonden: Tabel A.

Tabel B geeft de criteria weer voor het beoordelen van de resultaten van immuunblotting die worden aanbevolen door de WHO en het Russische centrum voor de preventie en bestrijding van aids.

Op basis van de WHO-criteria worden sera als positief beschouwd als met de IB-methode antilichamen tegen elke twee HIV-1-envelopeiwitten worden gedetecteerd. Als er een reactie is met slechts één van de envelopeiwitten (gp160, gp120, gp41), in combinatie met een reactie met andere eiwitten of zonder, wordt het resultaat als twijfelachtig beschouwd. Volgens het Federaal Wetenschappelijk en Methodologisch Centrum van het Ministerie van Volksgezondheid van de Russische Federatie voor de Preventie en Controle van AIDS kan sera zelfs in aanwezigheid van antilichamen tegen slechts één vachteiwit als positief worden geïnterpreteerd.

De detectie van antilichamen tegen het p24-antigeen kan wijzen op de periode van het begin van seroconversie, aangezien antilichamen tegen dit eiwit het eerst verschijnen. Positieve reacties met gag- en pol-eiwitten zonder een reactie met env-eiwitten kunnen het stadium van vroege seroconversie weerspiegelen, evenals wijzen op de aanwezigheid van HIV-2-infectie of een niet-specifieke reactie.

Het gebruik van immunoblotting als expertmethode voor het diagnosticeren van HIV heeft een aantal belangrijke nadelen:

1. De onmogelijkheid om de detectie van het HIV-p24-antigeen 1 te bevestigen in het geval van tests die gelijktijdig het antigeen en de antilichamen tegen HIV bepalen, waardoor het ongepast (zinloos) is om te gebruiken als screeningtests voor de gelijktijdige detectie van antigeen en antilichamen op HIV (Beschikking van het Ministerie van Volksgezondheid van de Russische Federatie nr. 292 van 30.07. 2001: "om donoren te onderzoeken bij bloedtransfusiestations, is het noodzakelijk om testsystemen te gebruiken die zowel antigeen als antilichamen tegen HIV detecteren").

2. Detectie van alleen antilichamen van de IgG-klasse. Het is onmogelijk om de positieve resultaten die zijn verkregen met tests van de 3e en 4e generatie (detectie van IgG- en IgM-antilichamen) volledig te bevestigen.

3. De subjectiviteit van de interpretatie van de testscore, vooral in gevallen van "twijfelachtige" en "onzekere" resultaten en in de beginfasen van seroconversie (de detecteerbare banden op nitrocellulosemembranen zijn in deze gevallen wazig, nauwelijks zichtbaar voor het blote oog , en er zijn vaak meningsverschillen wanneer deze door verschillende personen worden beoordeeld).

4. De onmogelijkheid van geautomatiseerde kwantitatieve evaluatie van de resultaten van de analyse.

5. Lagere gevoeligheid vergeleken met ELISA.

6. Breekbaarheid van opslag (tijdens opslag vervagen stroken nitrocellulosemembraan en kunnen geen objectieve bevestiging zijn van het al dan niet detecteren van HIV in controversiële gevallen).

7. Moeilijkheden bij het opzetten van de reactie en opslag (nitrocellulosemembraanstrips zijn erg kwetsbaar en breken vaak).

8. Hoge kosten van IS-kits.

Bekend reagens, een kit voor de gelijktijdige bepaling van antigenen en antilichamen tegen hetzelfde pathogeen, inclusief HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Er wordt echter geen testsysteem onthuld waarmee een hiv-infectie in verschillende stadia kan worden vastgesteld.

Het doel van de onderhavige uitvinding is het verkrijgen van een testsysteem waarmee positieve of twijfelachtige resultaten van screeningtests op antilichamen tegen HIV 1 en 2, HIV 1 groep O en HIV 1 p24-antigeen kunnen worden bevestigd met behulp van tests voor de gelijktijdige detectie van antigenen en antilichamen.

De voorgestelde technische oplossing wordt bereikt door een enzym-immunoassay-testsysteem voor het identificeren van het spectrum van antilichamen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) van het eerste en tweede type, het eerste type van groep O en de detectie van p24-antigeen tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het eerste type p24, met het kenmerk dat het een immunosorbens omvat op basis van antigenen humaan immunodeficiëntievirus, namelijk gp41 (env HIV-1 en HIV-2 groep O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) gp36 (env HIV-2), antilichamen tegen HIV-antigeen 1 p24 en detectiereagentia, waarbij de bovengenoemde HIV-antigenen en HIV-antilichamen worden geadsorbeerd in verschillende putjes van platen voor enzymimmunoassay.

Bovendien worden 96-well polystyreen inklapbare of niet-inklapbare platen voor enzymimmunoassay gebruikt voor sorptie.

Het technische resultaat dat door de onderhavige uitvinding wordt bereikt, bestaat uit de mogelijkheid om positieve resultaten te bevestigen voor antilichamen tegen HIV 1 en 2, HIV 1 groep O en HIV 1 p24-antigeen, hoge gevoeligheid, de mogelijkheid van geautomatiseerde interpretatie van de resultaten, waardoor de subjectiviteit wordt geëlimineerd van de beoordeling, het gemak van het uitvoeren van de test, minder dan bij bestaande IS-sets met kosten.

Deze technische oplossing wijkt af van de bekende:

1. Gebruik als vaste fase dragerplaat voor immunologische reacties.

2. Gelijktijdig gebruik van antilichamen tegen p 24 HIV en een set HIV-antigenen als sorptiemiddel.

De uitvinding wordt geïllustreerd door het volgende voorbeeld.

De actieve principes van het ontwikkelde testsysteem "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" zijn:

Immunosorbent - recombinante antigenen vergelijkbaar met structurele eiwitten van HIV-1: gp41 (env HIV-1 en HIV 1 groep O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) en monoklonaal muizenantilichamen tegen het HIV 1(p24)-antigeen afzonderlijk geadsorbeerd op stroken van een opvouwbare plaat van polystyreen.

Voor de bereiding van immunosorbens gebruik:

1. HIV-1 gp41 is een eiwit geproduceerd door E. Coli stam nr. AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 is een eiwit geproduceerd door E. Coli stam nr. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 - eiwit geproduceerd door E. Coli stam nr. AHIV 105.

4. HIV-1 p31 - eiwit geproduceerd door E. Coli stam nr. AHIV 108.

5. HIV-2 p36 - eiwit geproduceerd door E. Coli stam nr. AHIV 106.

Conjugaat 1, gevriesdroogde of vloeibare, monoklonale muizenantilichamen tegen HIV1 p24-antigeen, geconjugeerd met biotine.

1. Conjugaat 2, gevriesdroogd of vloeibaar, een mengsel van recombinante antigenen vergelijkbaar met de structurele eiwitten van HIV-1: gp41 (env HIV-1 en HIV 1 groep O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (po1 ); HIV-2: gp36 (env) geconjugeerd met biotine;

2. Conjugaten 3, 4 - gevriesdroogd of vloeibaar - streptavidine gelabeld met mierikswortelperoxidase;

In de loop van voorstudies werd het ontwerp van het testsysteem gekozen, de technologie voor het bereiden van de componenten uitgewerkt en werden de omstandigheden voor het uitvoeren van de enzymimmunoassay geoptimaliseerd.

Bij het opzetten van ELISA in het testsysteem "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", wordt 25 l conjugaat-1 toegevoegd aan de putjes van de plaat met geadsorbeerde antilichamen tegen p24, en in de putjes met geadsorbeerde antigenen - 25 µl conjugaat-2. Het reactieschema is hieronder weergegeven. Vervolgens wordt aan elk putje 25 l van het testmonster toegevoegd. Tegelijkertijd verandert de kleur in de putjes met antigenen van oranje naar roze en in de put met antistoffen van groen naar grijs. Het mengsel wordt gedurende 45 minuten bij 37°C op een schudder geïncubeerd (of 1 uur bij 37°C in een thermostaat). Vervolgens wordt, zonder wassen, 50 l conjugaat-3 toegevoegd aan de putjes van de tablet voor het bepalen van het p24-antigeen en 50 l conjugaat-4 wordt aan de putjes toegevoegd voor het bepalen van antilichamen. Na incubatie gedurende 20 min bij 37°C op een schudder (of 30 min bij 37°C in een thermostaat), wordt de plaat gewassen en ontwikkeld met het substraatmengsel. Totale reactietijd 1 uur 25 minuten (of 1 uur 50 minuten). Het p24-antigeen dat in het testmonster aanwezig is, bindt aan monoklonale antilichamen tegen p24 en specifieke antilichamen vormen een complex met recombinante antigenen op de plaat. Het resulterende immuuncomplex anti-p24 met p24 wordt gedetecteerd met anti-p24-biotine-conjugaten, vervolgens met streptavidine-peroxidase, en de immuuncomplexen van Ag-HIV met At-HIV worden gedetecteerd met Ag-biotine-conjugaat en vervolgens met streptavidine-peroxidase .

Schema voor het opzetten van de reactie.

De verwerking van de resultaten gebeurt spectrofotometrisch bij twee golflengten: 450 /620-680 nm met het instrument ingesteld op "lucht". Laten we rekening houden met de resultaten bij één golflengte van 450 nm.

De resultaten van de analyse worden in aanmerking genomen als de gemiddelde waarden van optische dichtheid (OD) in putten met K- niet meer dan 0,2 zijn, in putten met K+ - niet minder dan 1,0. OP kritiek. berekend met de formule:

OP kritiek. gp41 = vgl. waarde OP K-(gp41)+0.15

OP kritiek. gp120 = vgl. waarde OP K-(gp120)+0.15

OP kritiek. p24 = vgl. waarde OP K-(р24)+0.15

OP kritiek. p31 = vgl. waarde OP K-(р31)+0.15

OP kritiek. gp36 = vgl. waarde OP K-(gp36)+0.15

OP kritiek. Ag p24 = vgl. waarde OD naar- (Ag p24)+0.04

waarbij 0,15 en 0,04 coëfficiënten zijn die zijn vastgesteld door de statistische verwerkingsmethode bij de fabrikant. Bij het ontwikkelen van het testsysteem is gebruik gemaakt van:

1. Bloedserummonsters van gezonde donoren (n=610).

2. Bloedserummonsters van patiënten met verschillende infectieziekten die niet geassocieerd zijn met HIV (ARI, pneumonie, tonsillitis, herpes- en cytomegalovirusinfecties, syfilis, chlamydia, virale hepatitis A, B en C (n=224)).

3. Bloedserummonsters van patiënten met verschillende niet-overdraagbare ziekten - verwondingen, ziekten van het cardiovasculaire systeem, oncologie (n=35).

4. Bloedserummonsters van zwangere vrouwen (n=40).

5. Bloedserummonsters, seropositief in ELISA en bevestigd in immunoblot (n=428).

6. Serummonsters met een positief resultaat verkregen in enzym-immunoassay-testsystemen voor de gelijktijdige bepaling van HIV 1,2-antilichamen en p24-antigeen, en een onbepaald immunoblotresultaat (n=123).

7. Intern panel van sera die wel en geen antilichamen tegen HIV 1.2 bevatten, getest op enzymimmunoassays geregistreerd door het Ministerie van Volksgezondheid van de Russische Federatie en immunoblot (n=21).

8. Standaard "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Frankrijk, cat. nr. 72217, dat een antigeen is dat is verkregen uit een viraal lysaat.

9. De interne standaard van de onderneming. Een monster dat p24-antigeen bevat in een concentratie van 200 pg/ml, verkregen uit een viraal lysaat en getitreerd volgens de "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" firma "BIO RAD", Frankrijk, cat. nr. 72217.

10. Standaard panel van sera die antilichamen bevatten tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het eerste type (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

11. Standaard panel van sera die antilichamen bevatten tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het tweede type (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

12. Standaard panel van sera die geen antilichamen bevatten tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het eerste type en het tweede type (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, Medico-Biological Union, Novosibirsk.

De evaluatie van de gevoeligheid van het testsysteem voor de detectie van het p24-antigeen werd uitgevoerd met behulp van de standaard "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", de interne standaard van de onderneming. Met behulp van de interne standaard werden 4 opeenvolgende 2-voudige verdunningen van 40 pg/ml tot 5 pg/ml bereid met normaal donorplasma dat vrij was van antilichamen tegen HIV 1, 2 als verdunningsmiddel. De kleinste hoeveelheid detecteerbaar antigeen werd als gevoeligheidscriterium genomen. De verkregen gegevens zijn weergegeven in tabel 1.

Om de gevoeligheid van het testsysteem voor de detectie van specifieke antilichamen te beoordelen, werden standaardpanels van monsters gebruikt die antilichamen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (HIV 1, 2) bevatten (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-28-216-02P (HIV 2) p.003).

De verkregen gegevens zijn weergegeven in tabellen 3, 4.

De diagnostische efficiëntie van het testsysteem "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" werd vergeleken met de testsystemen "Jenscrin-HIV-Ag/Am" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostics of HIV Uniform II Ag/Am" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1.2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1.2 K" (Amercard) , " HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Voor dit doel werden serummonsters van het binnenpaneel getest in alle aangegeven tests. De resultaten gepresenteerd in Tabel 5 geven de hoge diagnostische efficiëntie van "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" aan.

Gevoeligheidsonderzoeken van het testsysteem "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" werden ook uitgevoerd met bloedsera van patiënten die in de immunoblot als HIV-positief werden bevestigd. Van deze sera werden in totaal 428 monsters getest. Er zijn verschillende opties verkregen voor het detecteren van antilichamen tegen verschillende HIV-eiwitten en p24-antigeen. De resultaten zijn weergegeven in tabel 6.

Bij het testen van HIV 1-positieve monsters vertoonde 3% van de sera een positieve reactie met gp36 (env HIV 2). MP/OPcrit in deze monsters niet hoger was dan 2,0. Onze gegevens over de kruisreactiviteit van de buitenste envelopeiwitten van HIV 1 (gp41) en HIV 2 (gp36) komen overeen met de literatuurgegevens.

interpretatie van resultaten

Analyse van testen van HIV-positieve sera en monsters van standaard- en interne panels in "DS-IFA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" maakte het mogelijk criteria te ontwikkelen voor de interpretatie van de resultaten van deze test. Aanbevolen criteria worden weergegeven in tabel 7.

Op basis van deze criteria werden alle HIV-positieve seramonsters (n=428) als positief geïdentificeerd in "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1". Van de 16 monsters van het standaardpanel die antilichamen tegen HIV bevatten, werden er 14 als positief en 2 als onbepaald bepaald. Van alle 8 monsters van het standaardpanel die antilichamen tegen HIV 2 bevatten, werd vastgesteld dat ze positief waren. Van de 10 monsters van het binnenpaneel die antilichamen tegen HIV bevatten, werden er 7 geïdentificeerd als positief en 3 als onbepaald.

Gevoeligheidsonderzoeken van het testsysteem "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" werden ook uitgevoerd met bloedsera van patiënten met een positief resultaat in enzymimmunoassaysystemen die gelijktijdig antilichamen en p24-antigeen detecteren, en onbepaald in de immunoblot. In totaal werden 123 van dergelijke monsters getest. De gegevens zijn weergegeven in tabel 8.

Bij het testen van sera met een onbepaald immunoblotresultaat (n=123) in "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1", lieten 72 monsters (58,5%) een positief resultaat zien. Hiervan zijn 26 sera (21,1%) alleen positief voor p24, 20 (16,3%) - alleen voor antilichamen, 16 (13%) - voor p24 met antilichamen tegen een van de eiwitten, 10 (8,1%) - op p24 met antilichamen tegen twee of meer van de eiwitten. Testen op alleen antilichamen (geen detectie van p24) zou er dus toe leiden dat 30 monsters (24,4%) positief zijn. De detectie van het p24-antigeen in de test maakte het mogelijk om nog eens 42 monsters (34,1%) als positief te bepalen.

Om de specificiteit van het testsysteem te beoordelen, werd een standaard panel van sera gebruikt die geen antilichamen tegen HIV 1, 2 (n=20) bevatte; bloedserummonsters van gezonde donoren (n=610), bloedserummonsters van patiënten met verschillende infectieziekten (n=224) die niet geassocieerd zijn met hiv; bloedserummonsters van patiënten met verschillende niet-overdraagbare ziekten - verwondingen, ziekten van het cardiovasculaire systeem, oncologie (n=35); bloedserummonsters van zwangere vrouwen (n=40). In totaal werden 929 monsters getest. Eén monster uit de bloedsera van gezonde donoren vertoonde een vals-positief resultaat - antilichamen tegen gp41 en p24 werden gedetecteerd. 7 monsters van bloedsera van gezonde donoren en 2 monsters van bloedsera van patiënten met infectieziekten die niet geassocieerd zijn met HIV, vertoonden een vals-positief resultaat voor p24.

Om de specificiteit van het testsysteem te beoordelen, werd een standaardpanel van negatieve monsters gebruikt (OSO 42-28-214-94-02p, p. 009). De specificiteit was 100%.

Zo hebben de uitgevoerde onderzoeken aangetoond dat de specificiteit van het testsysteem "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" 99% is in de studie van bloedserummonsters van normale donoren en patiënten met verschillende infectieuze en somatische ziekten.

De verkregen gegevens tonen de hoge diagnostische efficiëntie van het ontwikkelde testsysteem "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1". Het testsysteem kan worden gebruikt om antilichamen tegen individuele eiwitten van HIV-type 1 en 2 en het HIV1 p24-antigeen te detecteren om een ​​positief screeningsresultaat te bevestigen met testsystemen die antilichamen detecteren, of testsystemen die gelijktijdig antilichamen en HIV1 p24-antigeen detecteren. Het testsysteem kan worden gebruikt als een alternatieve immunoblottest om positieve resultaten te bevestigen en om de dynamiek van antilichamen tegen HIV en p24-antigeen in verschillende stadia van infectie te bestuderen.

VOORDELEN VAN DE TEST

1. Bevestigend enzym-immunoassay-plaatformaat:

2. Bevestigende test die HIV 1, 2 antilichaamspectrum en HIV 1 p24-antigeen combineert

3. Detectie van antilichamen van alle Ig-klassen

4. Gevoeligheid voor detectie van p24 is niet minder dan 5 pg/ml

5. Vermindert onbepaalde resultaten in vergelijking met immunoblot

6. Analysetijd - 1 uur 25 minuten (immunoblot - van 3 tot 20 uur)

7. Visuele beoordeling van de introductie van alle componenten en monsters.

1. ELISA-testsysteem voor het identificeren van het spectrum van antilichamen tegen het humaan immunodeficiëntievirus (hiv) van het eerste en tweede type, het eerste type van groep O en de detectie van het p24-antigeen tegen het humaan immunodeficiëntievirus van het eerste type p24, met het kenmerk dat het een immunosorbens omvat op basis van immunodeficiëntievirusantigenen gp41 (env HIV-1 en HIV-2 groep O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), antilichamen aan het HIV 1-antigeen p24, en het detecteren van reagentia, terwijl de bovengenoemde HIV-antigenen en HIV-antilichamen worden geadsorbeerd in verschillende putjes van platen voor enzymimmunoassay.

2. Enzym-immunoassay-testsysteem volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat voor de sorptie 96-well polystyreen opvouwbare of niet-inklapbare platen voor enzym-immunoassay worden gebruikt.

Tijdige diagnose van HIV-infectie wordt een uiterst belangrijke maatregel, aangezien vroege behandeling grotendeels de verdere ontwikkeling van de ziekte kan bepalen en het leven van de patiënt kan verlengen. De afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt op het gebied van het opsporen van deze vreselijke ziekte: de oude testsystemen worden vervangen door geavanceerdere, onderzoeksmethoden worden toegankelijker en de nauwkeurigheid ervan neemt aanzienlijk toe.

In dit artikel zullen we het hebben over moderne methoden voor het diagnosticeren van HIV-infectie, die nuttig zijn om te weten voor de tijdige behandeling van dit probleem en het handhaven van de normale kwaliteit van leven van de patiënt.

Methoden voor het diagnosticeren van HIV

In Rusland wordt voor de diagnose van HIV-infectie een standaardprocedure uitgevoerd, die twee niveaus omvat:

• ELISA-testsysteem (screeninganalyse);
• immuunblotting (IB).

Andere diagnostische methoden kunnen ook worden gebruikt:

• uitdrukkelijke testen.

ELISA-testsystemen

In de eerste fase van de diagnose wordt een screeningstest (ELISA) gebruikt om een ​​hiv-infectie op te sporen, die is gebaseerd op hiv-eiwitten die zijn gemaakt in laboratoria die specifieke antilichamen opvangen die in het lichaam worden geproduceerd als reactie op een infectie. Na hun interactie met de reagentia (enzymen) van het testsysteem verandert de kleur van de indicator. Verder worden deze kleurveranderingen verwerkt op speciale apparatuur, die het resultaat van de uitgevoerde analyse bepaalt.

Dergelijke ELISA-tests kunnen binnen enkele weken na de introductie van een hiv-infectie resultaten opleveren. Deze analyse stelt niet de aanwezigheid van het virus vast, maar detecteert de productie van antilichamen ertegen. Soms begint in het menselijk lichaam de aanmaak van antilichamen tegen hiv na 2 weken na infectie, maar bij de meeste mensen worden ze op een later tijdstip geproduceerd, na 3-6 weken.

Er zijn vier generaties ELISA-tests met verschillende gevoeligheden. In de afgelopen jaren zijn testsystemen voor de III en IV generatie vaker gebruikt, die zijn gebaseerd op synthetische peptiden of recombinante eiwitten en die een grotere specificiteit en nauwkeurigheid hebben. Ze kunnen worden gebruikt om een ​​hiv-infectie te diagnosticeren, de hiv-prevalentie te controleren en de veiligheid te garanderen bij het testen van gedoneerd bloed. De nauwkeurigheid van ELISA-testsystemen van de III- en IV-generatie is 93-99% (gevoeliger zijn de tests die in West-Europa worden geproduceerd - 99%).

Om een ​​ELISA-test uit te voeren, wordt 5 ml bloed afgenomen uit de ader van de patiënt. Tussen de laatste maaltijd en de analyse moet minimaal 8 uur zitten (in de regel wordt deze 's morgens op een lege maag uitgevoerd). Een dergelijke test wordt aanbevolen om niet eerder dan 3 weken na de vermeende infectie te worden gedaan (bijvoorbeeld na onbeschermde geslachtsgemeenschap met een nieuwe seksuele partner).

De resultaten van de ELISA-test worden verkregen na 2-10 dagen:

• negatief resultaat: geeft de afwezigheid van hiv-infectie aan en vereist geen verwijzing naar een specialist;
• vals-negatief resultaat: kan worden waargenomen in de vroege stadia van infectie (tot 3 weken), in de late stadia van AIDS met ernstige immuunsuppressie en met onjuiste bloedbereiding;
• vals positief resultaat: het kan worden waargenomen bij sommige ziekten en in geval van onjuiste bloedbereiding;
• positief resultaat: wijst op infectie met hiv-infectie, vereist een IB en verwijzing van de patiënt naar een specialist in een aidscentrum.

Waarom kan een ELISA-test vals-positieve resultaten geven?

Fout-positieve resultaten van een ELISA-test voor HIV kunnen worden waargenomen bij onjuiste verwerking van bloed of bij patiënten met dergelijke aandoeningen en ziekten:

• multipel myeloom;
• infectieziekten veroorzaakt door het Epstein-Barr-virus;
• staat na;
• auto-immuunziekten;
• tegen de achtergrond van zwangerschap;
• toestand na vaccinatie.

Om de hierboven beschreven redenen kunnen niet-specifieke kruisreagerende antilichamen in het bloed aanwezig zijn, waarvan de productie niet werd veroorzaakt door een HIV-infectie.

In de afgelopen jaren is de frequentie van vals-positieve resultaten aanzienlijk afgenomen door het gebruik van testsystemen voor de III- en IV-generatie, die gevoeligere peptiden en recombinante eiwitten bevatten (ze worden gesynthetiseerd met behulp van in vitro genetische manipulatie). Na het gebruik van dergelijke ELISA-tests is de frequentie van fout-positieve resultaten aanzienlijk afgenomen en bedraagt ​​ongeveer 0,02-0,5%.

Een vals-positief resultaat betekent niet dat een persoon besmet is met hiv. In dergelijke gevallen beveelt de WHO een andere ELISA-test aan (verplichte IV-generatie).

Het bloed van de patiënt wordt naar een referentie- of arbitragelaboratorium gestuurd met de vermelding "herhalen" en getest op een ELISA-testsysteem van de IV-generatie. Als het resultaat van de nieuwe analyse negatief is, wordt het eerste resultaat als foutief (false positive) herkend en wordt IB niet uitgevoerd. Als het resultaat positief of twijfelachtig is tijdens de tweede test, moet de patiënt binnen 4-6 weken IB ondergaan om de HIV-infectie te bevestigen of te weerleggen.

immuun blotting

Een definitieve diagnose van hiv-infectie kan pas worden gesteld nadat een positieve immuunblotting (IB) is verkregen. Voor de uitvoering wordt een nitrocellulosestrip gebruikt, waarop virale eiwitten worden aangebracht.

Bloedafname voor IB wordt uitgevoerd vanuit een ader. Vervolgens ondergaat het een speciale behandeling en worden de eiwitten in het serum gescheiden in een speciale gel op basis van hun lading en molecuulgewicht (de manipulatie wordt uitgevoerd op speciale apparatuur onder invloed van een elektrisch veld). Een nitrocellulosestrip wordt op de bloedserumgel aangebracht en blotting ("blotting") wordt uitgevoerd in een speciale kamer. De strip wordt verwerkt en als de gebruikte materialen antilichamen tegen HIV bevatten, binden ze aan de antigene banden op IB en verschijnen als lijnen.

IB wordt als positief beschouwd als:

• volgens Amerikaanse CDC-criteria - er zijn twee of drie regels gp41, p24, gp120 / gp160 op de strip;
• volgens Amerikaanse FDA-criteria - er zijn twee lijnen p24, p31 en een lijn gp41 of gp120 / gp160 op de strip.

In 99,9% van de gevallen wijst een positief IB-resultaat op een hiv-infectie.

Bij afwezigheid van lijnen - IB is negatief.

Bij het identificeren van lijnen met gp160, gp120 en gp41 is IB twijfelachtig. Een dergelijk resultaat kan worden gedetecteerd wanneer:

• oncologische ziekten;
• zwangerschap;
• frequente bloedtransfusies.

In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om een ​​tweede onderzoek uit te voeren met een kit van een ander bedrijf. Blijft het resultaat na aanvullende IB twijfelachtig, dan is een follow-up van zes maanden nodig (IB wordt elke 3 maanden uitgevoerd).

polymerasekettingreactie

De PCR-test kan het RNA van het virus detecteren. De gevoeligheid ervan is vrij hoog en het maakt het mogelijk HIV-infectie al 10 dagen na infectie te detecteren. In sommige gevallen kan PCR vals-positieve resultaten geven, omdat de hoge gevoeligheid ervan ook kan reageren op antilichamen tegen andere infecties.

Deze diagnostische techniek is duur, vereist speciale apparatuur en hooggekwalificeerde specialisten. Om deze redenen kan het niet worden uitgevoerd tijdens massale testen van de populatie.

PCR wordt in dergelijke gevallen gebruikt:

• hiv opsporen bij pasgeborenen die zijn geboren uit met hiv geïnfecteerde moeders;
• om hiv op te sporen in de "window period" of bij twijfelachtige IB;
• om de concentratie van HIV in het bloed te beheersen;
• voor de studie van donorbloed.

Alleen door de PCR-test wordt de hiv-diagnose niet gesteld, maar uitgevoerd als een aanvullende diagnostische methode om geschillen op te lossen.

Express-methoden

Een van de innovaties in de hiv-diagnostiek zijn sneltesten, waarvan de resultaten in 10-15 minuten kunnen worden beoordeeld. De meest efficiënte en nauwkeurige resultaten worden verkregen met immunochromatografische tests op basis van het principe van capillaire stroming. Het zijn speciale strips waarop bloed of andere testvloeistoffen (speeksel, urine) worden aangebracht. In aanwezigheid van antilichamen tegen HIV verschijnt na 10-15 minuten een gekleurde en controlestrip op de test - een positief resultaat. Als het resultaat negatief is, verschijnt alleen de controlelijn.

Net als bij ELISA-tests moeten snelle testresultaten worden bevestigd door IB-analyse. Alleen dan kan de diagnose hiv-infectie worden gesteld.

Er zijn express kits voor thuistesten. De test van OraSure Technologies1 (VS) is door de FDA goedgekeurd, is zonder recept verkrijgbaar en kan worden gebruikt om hiv op te sporen. Na de test, in geval van een positief resultaat, wordt de patiënt aanbevolen om een ​​onderzoek te ondergaan in een gespecialiseerd centrum om de diagnose te bevestigen.

De overige tests voor thuisgebruik zijn nog niet goedgekeurd door de FDA en hun resultaten kunnen zeer twijfelachtig zijn.

Ondanks het feit dat snelle tests minder nauwkeurig zijn dan ELISA-tests van de IV-generatie, worden ze veel gebruikt voor aanvullende tests van de populatie.

U kunt zich laten testen op hiv-infectie bij elke polikliniek, het Centraal Regionaal Ziekenhuis of in gespecialiseerde aidscentra. Op het grondgebied van Rusland worden ze absoluut vertrouwelijk of anoniem bewaard. Elke patiënt kan voor of na de analyse medisch of psychologisch advies verwachten. U hoeft alleen te betalen voor hiv-tests in commerciële medische instellingen, en in openbare klinieken en ziekenhuizen worden ze gratis uitgevoerd.

Voor informatie over hoe je besmet kunt raken met hiv en welke mythes er bestaan ​​over de mogelijkheden om besmet te raken, lees

Beschrijving

Opleiding

Indicaties

interpretatie van resultaten

Beschrijving

Wijze van bepaling Enzym-immunoassay (ELISA).

Materiaal in studie Serum

Huisbezoek mogelijk

Gecombineerde detectie van antilichamen tegen hiv-type 1 en 2 en hiv-p24-antigeen, een kwalitatieve test.

Aandacht. Bij positieve en twijfelachtige reacties kan de termijn voor het uitbrengen van de uitslag worden verlengd tot maximaal 10 werkdagen. HIV (humaan immunodeficiëntievirus), dat AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) veroorzaakt, behoort tot de familie van retrovirussen. Het wordt van persoon op persoon overgedragen door het gebruik van besmette naalden en spuiten voor intraveneus drugsgebruik of therapeutische procedures, door geslachtsgemeenschap, zowel heteroseksueel als homoseksueel. Overdracht van het virus kan plaatsvinden door de transfusie van geïnfecteerd bloed en zijn producten, donatie van organen of zaadvloeistof, bij gezondheidswerkers - wanneer ze gewond zijn geraakt door geïnfecteerde naalden of instrumenten. HIV-infectie is mogelijk door overdracht van een geïnfecteerde moeder op een kind (verticale route), hoewel moderne preventiemethoden met behulp van antiretrovirale therapie, als alle aanbevelingen worden opgevolgd, dit risico tot een minimum kunnen beperken.

Het proces van interactie van een virus met een cel omvat een aantal stadia: de binding van het virus aan de cel, het vrijkomen uit de schaal, penetratie in het cytoplasma, DNA-synthese uit viraal RNA en integratie van viraal DNA in het genoom van de gastheercel. Hierna begint het latente stadium van infectie. In deze toestand kan proviraal DNA enige tijd bestaan ​​zonder activiteit te vertonen en zonder de vitale activiteit van de gastheercel te beïnvloeden. Zolang er geen expressie van virale eiwitten is, is er geen immuunrespons op het virus. Antilichamen tegen HIV, die kenmerkend zijn voor de immuunrespons van het lichaam, verschijnen na de activering van viraal DNA en het begin van actieve reproductie van het virus. De duur van de latente periode hangt af van een aantal factoren, waaronder de individuele genetische kenmerken van het organisme.

Antilichamen tegen HIV kunnen verschijnen vanaf de tweede week na infectie; hun inhoud neemt binnen 2-4 weken toe en houdt vele jaren aan. Bij 90-95% van de geïnfecteerden verschijnen ze in de eerste drie maanden na infectie, bij 5-9% - in de periode van drie tot zes maanden, bij 0,5-1% - op een later tijdstip.

In de eerste weken van infectie, zelfs vóór het verschijnen van antilichamen tegen het virus (d.w.z. vóór seroconversie), kan de aanwezigheid van HIV-antigenen, inclusief het p24-capside-eiwit, worden gedetecteerd in serum- of plasmamonsters. Later, na seroconversie, wordt het meestal ondetecteerbaar.

Combinatieassays van de vierde generatie, zoals de HIV Ag/Ab Combo-test (Architect, Abbott), detecteren zowel HIV-type 1- als 2-antilichamen en het HIV-p24-antigeen, waardoor een vroege detectie van een infectie mogelijk is. De bijzondere kenmerken van de screeningstest die in het INVITRO-laboratorium wordt gebruikt om hiv-infectie op te sporen, zijn onder meer de hoge specificiteit van het onderzoek (> 99,5%); 100% gevoeligheid van de test voor antilichamen die kenmerkend zijn voor de periode van seroconversie, en de gevoeligheid van de test voor het p24-antigeen is ongeveer 18 pg/ml.

De procedure voor laboratoriumtests op HIV wordt strikt gereguleerd door de bevelen van het ministerie van Volksgezondheid van de Russische Federatie en omvat de fase van een screening (screening) studie van de aanwezigheid van antilichamen tegen HIV door middel van enzymimmunoassay (ELISA)-methoden die zijn goedgekeurd voor gebruik , en het stadium van een verificatie (bevestigend) meer gedetailleerd onderzoek in het laboratorium van het AIDS-centrum van de stad. Opgemerkt moet worden dat zelfs de beste screening-ELISA-systemen geen 100% specificiteit garanderen, dat wil zeggen dat er enige mogelijkheid is om niet-specifieke, fout-positieve resultaten te verkrijgen die verband houden met de kenmerken van het bloedserum van de patiënt. Daarom kan het zijn dat een positief screenings-ELISA-resultaat niet wordt bevestigd in bevestigende tests, waarna de patiënt een negatief of onbepaald resultaat krijgt. Als het resultaat van het bevestigende onderzoek onbepaald is, moeten de tests binnen 2-3 weken in dynamiek worden herhaald.

Laboratoriumdiagnose van hiv-infectie bij kinderen van hiv-geïnfecteerde moeders heeft zijn eigen kenmerken. Maternale antistoffen tegen hiv (IgG-klasse) kunnen tot 18 maanden vanaf de geboorte in hun bloed circuleren. De afwezigheid van antilichamen tegen HIV bij pasgeborenen betekent niet dat het virus de placentabarrière niet is gepasseerd. Kinderen van met hiv geïnfecteerde moeders worden binnen 36 maanden na de geboorte onderworpen aan diagnostisch laboratoriumonderzoek.

Opleiding

Speciale voorbereiding is niet vereist. Bloedafname wordt aanbevolen niet eerder dan 4 uur na de laatste maaltijd. Algemene aanbevelingen voor de voorbereiding op onderzoek zijn te vinden. Het is raadzaam om niet eerder dan twee weken na een eventuele infectie een onderzoek uit te voeren naar de detectie van antigeen en antistoffen tegen hiv, bij een negatieve uitslag na drie en zes weken te herhalen. Registratie van aanvragen voor onderzoek bij INVITRO LLC wordt uitgevoerd volgens een paspoort of een document dat dit vervangt (migratiekaart, tijdelijke registratie op de woonplaats, militair certificaat, certificaat van het paspoortkantoor in geval van verlies van een paspoort, registratiekaart van een hotel). Het ingediende document moet informatie bevatten over tijdelijke of permanente registratie op het grondgebied van de Russische Federatie en een foto. Bij het ontbreken van een paspoort (een document dat dit vervangt), heeft de patiënt het recht om anoniem een ​​aanvraag in te dienen voor de afgifte van biomateriaal. Bij een anoniem onderzoek krijgen de aanvraag en het van de klant ontvangen biomateriaalmonster een nummer toegewezen dat alleen bekend is bij de patiënt en het medisch personeel dat de bestelling heeft geplaatst. ! De resultaten van anoniem uitgevoerd onderzoek kunnen niet worden ingediend voor ziekenhuisopname, professionele onderzoeken en zijn niet onderworpen aan registratie bij de ORUIB.

Indicaties voor afspraak

• Uitbreiding van lymfeklieren in meer dan twee gebieden.
• Leukopenie met lymfopenie.
• Nacht zweet.
• Plotseling gewichtsverlies met onbekende oorzaak.
• Diarree gedurende meer dan drie weken met onbekende oorzaak.
• Koorts met onbekende oorzaak.
• Plannen voor zwangerschap.
• Preoperatieve voorbereiding, ziekenhuisopname.
• Identificatie van de volgende infecties of hun combinaties: tuberculose, manifeste toxoplasmose, vaak terugkerende herpesvirusinfectie, candidiasis van inwendige organen, herhaalde herpes-zoster-neuralgie, veroorzaakt door mycoplasma's, pneumocysten of legionellapneumonie.
• Kaposi-sarcoom op jonge leeftijd.
• Casual seks.

interpretatie van resultaten

De interpretatie van testresultaten bevat informatie voor de behandelend arts en is geen diagnose. De informatie in deze rubriek mag niet worden gebruikt voor zelfdiagnose of zelfbehandeling. Een nauwkeurige diagnose wordt gesteld door de arts, gebruikmakend van zowel de resultaten van dit onderzoek als de nodige informatie uit andere bronnen: geschiedenis, resultaten van andere onderzoeken, enz.

Meeteenheden in het onafhankelijke laboratorium INVITRO: kwalitatieve test. De vorm van presentatie van de resultaten: bij afwezigheid van antilichamen tegen HIV 1 en 2 en p24-antigeen is het antwoord "negatief". In het geval van detectie van antilichamen tegen HIV of antigeen in de screening-ELISA-test, wordt het serummonster voor analyse door een bevestigende immunoblot-methode naar het AIDS-centrum van de stad gestuurd, dat positieve en onbepaalde resultaten verifieert.

Positief resultaat:

1. HIV-infectie;
2. vals-positief resultaat waarvoor herhaald of aanvullend onderzoek nodig is*);
3. de studie is niet informatief bij kinderen jonger dan 18 maanden van met hiv geïnfecteerde moeders.

*De specificiteit van het screeningtestsysteem HIV 1 en 2 antilichamen en HIV 1 en 2 antigeen (HIV Ag/Ab Combo, Abbott) wordt door de fabrikant van het reagens geschat op ongeveer 99,6% in zowel de algemene populatie als in de groep patiënten met mogelijke interferenties (infecties HBV, HCV, Rubella, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach., enz., auto-immuunpathologieën (inclusief reumatoïde artritis, aanwezigheid van antinucleaire antilichamen), zwangerschap, verhoogde niveaus van IgG, IgM, monoklonale gammopathie, hemodialyse, meervoudige bloedtransfusies).

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA - English) kwam ergens anders in de jaren 60 van de vorige eeuw in de praktijk van de geneeskunde. Zijn eerste taak was histologisch onderzoek voor wetenschappelijke doeleinden, wat neerkwam op het zoeken en identificeren van de antigene structuur van de cellen van een levend organisme.

De ELISA-methode is gebaseerd op de interactie van specifieke (AT) en verwante antigenen (AG) met de vorming van een antigeen-antilichaamcomplex, dat wordt gedetecteerd met behulp van een enzym. Dit feit bracht wetenschappers op het idee dat de methode kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden om specifieke immunoglobulinen van verschillende klassen te identificeren die betrokken zijn bij de immuunrespons op een bepaalde infectie. En het was een doorbraak in klinische laboratoriumdiagnostiek!

De methode begon pas in de vroege jaren 80 actief te worden gebruikt, en daarna voornamelijk in gespecialiseerde instellingen. De eerste enzymgekoppelde immunosorbentanalysers werden geleverd aan bloedtransfusiecentra en -stations, infectieuze en geslachtsziekenhuizen, aangezien de formidabele aids, geboren op het Afrikaanse continent, met ons aan de horizon verscheen en zich onmiddellijk aansloot bij de "oude" infecties, vereiste onmiddellijke maatregelen voor het diagnosticeren en zoeken naar therapeutische medicijnen die hem beïnvloeden.

Reikwijdte van de ELISA-methode

De mogelijkheden van enzymimmunoassay zijn werkelijk zeer uitgebreid. Nu is het moeilijk voor te stellen hoe men zonder dergelijke studies kan, die letterlijk in alle takken van de geneeskunde worden gebruikt. Het lijkt erop dat ELISA kan doen in de oncologie? Het blijkt dat het kan. En veel. Het vermogen van de analyse om markers te vinden die kenmerkend zijn voor bepaalde soorten kwaadaardige neoplasmata, ligt ten grondslag aan de vroege detectie van een tumor, wanneer deze vanwege zijn kleine omvang nog niet met andere methoden wordt gedetecteerd.

Moderne klinische laboratoriumdiagnostiek (CDL), naast tumormarkers, heeft een aanzienlijk arsenaal aan panels voor ELISA en gebruikt deze om verschillende pathologische aandoeningen (infectieprocessen, hormonale stoornissen) te diagnosticeren en farmaceutische geneesmiddelen te controleren om hun effect op de patiënt te identificeren lichaam en trouwens niet alleen de mens. Momenteel wordt enzymimmunoassay veel gebruikt in de veterinaire dienst, omdat "onze kleinere broers" ook vatbaar zijn voor veel ziekten, waar ze soms erg veel last van hebben.

Op deze manier, Door zijn gevoeligheid en specificiteit kan ELISA aan de hand van een bloedmonster uit een ader bepalen:

• Hormonale status (schildklier- en bijnierhormonen, geslachtshormonen);
• De aanwezigheid van een virale en bacteriële infectie (HIV, B en C, chlamydia, syfilis en, en, evenals vele andere ziekten veroorzaakt door pathogene micro-organismen);
• Sporen van vitale activiteit van micro-organismen die het infectieuze proces op gang brachten, dat met succes eindigde en naar het stadium van vorming van een immuunrespons op deze ziekteverwekker ging. Dergelijke sporen, dat wil zeggen antilichamen, blijven in veel gevallen levenslang in het bloed circuleren, wat een persoon beschermt tegen herinfectie.

Wat is de essentie van IF?

De enzym-immunoassay-methode maakt het mogelijk om niet alleen de aanwezigheid van de ziekteverwekker zelf (kwalitatieve analyse), maar ook het kwantitatieve gehalte in het bloedserum van de patiënt te bepalen.

Een virale of bacteriële dosis heeft een significante invloed op het verloop van het infectieuze proces en de uitkomst ervan. Daarom speelt kwantitatieve analyse een belangrijke rol bij de diagnose en behandeling van ziekten in verschillende vormen en stadia.

Als we de enzymimmunoassay echter kennen als een ELISA-methode, denken we er niet eens over na hoe het erin slaagt om zo'n breed scala aan micro-organismen die onze planeet bewonen, te dekken, waarvan er vele een directe bedreiging vormen voor de gezondheid en het leven van mens en dier. Feit is dat de ELISA veel opties heeft (niet-concurrerend en competitief - direct en indirect), die elk hun eigen probleem oplossen en dus gericht zoeken mogelijk maken.

Om immunoglobulinen van een of andere klasse te detecteren, wordt een traditioneel polystyreenpaneel (tablet) met 96 putjes gebruikt, in de putjes waarvan geadsorbeerde recombinante eiwitten zijn geconcentreerd in de vaste fase. De antilichamen of antigenen die met bloedserum in het putje zijn gekomen, vinden een "vertrouwd" object en vormen er een complex mee (AG - AT), dat, gefixeerd door het enzymconjugaat, zich zal manifesteren als een verandering in de kleur van het putje bij het lezen van de resultaten.

Enzym-immunoassay wordt uitgevoerd op testsystemen met een bepaalde specificiteit, gemaakt in speciale laboratoria en uitgerust met alle noodzakelijke reagerende componenten. Studies kunnen worden uitgevoerd met behulp van wasmachines ("washers") en afleesspectrofotometers, waarbij de meeste handmatige arbeid betrokken is. Op volautomatische machines, waardoor de laboratoriumassistent wordt bevrijd van monotone instillatie, wassen en andere routinetaken, is het natuurlijk sneller en handiger om te werken, maar niet alle laboratoria kunnen zich zo'n luxe veroorloven en op de ouderwetse manier blijven werken - op halfautomatische apparaten.

Interpretatie van de resultaten van ELISA valt onder de bevoegdheid van de arts van laboratoriumdiagnostiek, terwijl noodzakelijkerwijs rekening wordt gehouden met de eigenschap die inherent is aan bijna alle immunochemische reacties om vals-positieve of vals-negatieve antwoorden te geven.

Video: moderne enzym-immunoassay

ELISA-resultaten op het voorbeeld van syfilis

ELISA is geschikt voor detectie van alle vormen, en bovendien wordt het gebruikt in screeningstudies. Voor analyse wordt het veneuze bloed van de patiënt gebruikt dat op een lege maag is afgenomen. In het werk worden platen met een bepaalde specificiteit (AT-klassen A, M, G) of totale antilichamen gebruikt.

Aangezien antilichamen bij syfilis in een specifieke volgorde worden geproduceerd, kan ELISA gemakkelijk de vraag beantwoorden wanneer de infectie plaatsvond en in welk stadium het proces zich bevindt, en de decodering van de verkregen resultaten kan in de volgende vorm worden weergegeven:

• IgM geeft de duur van het infectieuze proces aan (kan optreden tijdens exacerbatie van chronische ontstekingsziekten);
• IgA stelt dat de infectie meer dan een maand geleden heeft plaatsgevonden;
• IgG geeft aan dat de infectie in volle gang is of recent is behandeld, wat gemakkelijk te achterhalen is bij het verzamelen van anamnese.

Bij het testen op syfilis blijven de negatieve putjes (en de negatieve controle) kleurloos, terwijl de positieve (zoals de positieve controle) een heldere gele kleur zal vertonen vanwege de kleurverandering van het chromogeen dat tijdens de test is toegevoegd. De intensiteit van de kleur komt echter niet altijd overeen met de controle, dat wil zeggen, deze kan iets bleker of enigszins gelig zijn. Dit zijn twijfelachtige resultaten, die in de regel opnieuw moeten worden onderzocht met de verplichte overweging van de kwantitatieve indicatoren die op de spectrofotometer worden verkregen, maar in het algemeen is de kleur recht evenredig met het aantal immuuncomplexen (antigenen en antilichamen gekoppeld naar elkaar).

De meest opwindende enzymimmunoassays - ELISA voor HIV

Analyse over, misschien meer dan andere, is voor een brede groep van de bevolking van belang, omdat nog niet met zekerheid kan worden gezegd dat veel maatschappelijke problemen (prostitutie, drugsverslaving, etc.) zijn verdwenen. Helaas treft HIV niet alleen deze delen van de menselijke samenleving, je kunt besmet raken onder verschillende omstandigheden die geen verband houden met seksuele promiscuïteit of drugsgebruik. Maar als er een hiv-test nodig is, moet je niet bang zijn dat iedereen in de buurt te weten komt over een bezoek aan zo'n laboratorium. Nu zijn hiv-geïnfecteerde mensen wettelijk beschermd, en degenen die twijfels hebben, kunnen zich wenden tot anonieme kantoren waar ze het probleem kunnen oplossen zonder angst voor publiciteit en veroordeling.

De enzymimmunoassay die wordt gebruikt om hiv-infectie te diagnosticeren, is een van de primaire standaardonderzoeken, die echter speciale voorwaarden vereisen, omdat het onderwerp erg gevoelig is.

Het is zinvol om ELISA voor HIV uit te voeren na seksueel contact, bloedtransfusie, andere medische procedures waarbij infectie betrokken is en aan het einde van de incubatieperiode (“seronegatief venster”), maar er moet rekening mee worden gehouden dat deze periode is niet constant. Het kan over 14-30 dagen eindigen, of het kan tot zes maanden duren, dus de gemiddelde waarde wordt beschouwd als een interval van 45 tot 90 dagen. Bloed wordt voor HIV op dezelfde manier gedoneerd als voor andere infecties - uit een ader op een lege maag. De resultaten zullen klaar zijn afhankelijk van de ophoping van materiaal in het laboratorium en de werklast (van 2 tot 10 dagen), hoewel de meeste laboratoria dezelfde of de volgende dag een reactie geven.

Wat kan worden verwacht van hiv-resultaten?

ELISA voor HIV-infectie detecteert antilichamen tegen twee soorten virussen: HIV-1 (vaker in Rusland en andere Europese en Aziatische landen) en HIV-2 (vaker in West-Afrika).

De taak van HIV ELISA is om te zoeken naar klasse G-antilichamen die op alle testsystemen worden gedetecteerd, maar in een latere periode, en klasse A- en M-antilichamen die worden gedetecteerd op nieuwe generatie recombinante testkits, die het mogelijk maken om antistoffen op zijn vroegst te detecteren stadia (de incubatietijd is seronegatief venster). Van de ELISA kunnen de volgende antwoorden worden verwacht:

1. Primair positief resultaat: bloed wordt opnieuw gecontroleerd op een testsysteem van hetzelfde type, maar indien mogelijk van een andere serie en door een andere persoon (laboratoriumassistent);
2. Herhaald (+) omvat een nieuwe bloedafname van een patiënt met een onderzoek dat vergelijkbaar is met de primaire analyse;
3. Het volgende positieve resultaat wordt onderworpen aan een referentieanalyse, waarbij gebruik wordt gemaakt van zeer specifieke testkits (2-3 stuks);
4. Een positief resultaat in beide (of drie) systemen wordt verzonden voor immunoblotting (dezelfde ELISA, maar afzonderlijk uitgevoerd op testkits met een bijzonder hoge specificiteit).

De conclusie over HIV-infectie wordt alleen gemaakt op basis van immunoblotting. Met de besmette persoon wordt in alle vertrouwelijkheid een gesprek gevoerd. Openbaarmaking van medische geheimen in Rusland, evenals in andere landen, is onderworpen aan strafrechtelijke sancties.

Tests voor chlamydia en cytomegalovirus door enzymimmunoassay zijn ook bijzonder populair geworden, omdat ze u in staat stellen het tijdstip van infectie, het stadium van de ziekte en de effectiviteit van therapeutische maatregelen te bepalen.

Tijdens de introductie is het ook mogelijk om het verschijnen van antilichamen van verschillende klassen te observeren. in verschillende fasen van een pathologische aandoening veroorzaakt door een infectieus agens:

• IgM kan al zeven dagen na infectie worden gedetecteerd;
• IgA geeft aan dat de infectie al meer dan een maand in het lichaam leeft;
• IgG bevestigt de diagnose van chlamydia, helpt de behandeling te volgen en de effectiviteit ervan te bepalen. Opgemerkt moet worden dat klasse G-antilichamen in het lichaam blijven en circuleren, ongeacht de duur van de ziekte, daarom moet voor de juiste interpretatie van de analyse rekening worden gehouden met referentiewaarden (normen), die, door de manier waarop, verschilt voor elke CDL: rekening houdend met het merk van het testsysteem en de specificiteit van de reagentia in de set. De normwaarden worden in het formulier naast de ELISA-uitslag ingevuld.

Wat betreft, hier is het een beetje anders: klasse M-antilichamen verschijnen in ongeveer anderhalve maand, dat wil zeggen, een positief resultaat (IgM +) wordt in de fase van primaire infectie of tijdens reactivering van een latente infectie en blijft zo van 4 maanden tot zes maanden.

De aanwezigheid van klasse G-antilichamen is kenmerkend voor het ontstaan ​​van een primaire acute infectie of herinfectie. De analyse stelt dat het virus aanwezig is, maar geeft geen informatie over het stadium van het infectieproces. Ondertussen levert het bepalen van de IgG-titernorm ook problemen op, omdat het volledig afhangt van de immuunstatus van een bepaalde persoon, die echter wordt vastgesteld door de detectie van immunoglobulinen van klasse G. Gezien dit gedrag van antilichamen wordt het bij de diagnose van CMVI nodig om het vermogen van klasse G-antilichamen om te interageren met CMV te beoordelen, om het later te "neutraliseren" (AT aviditeit). In het beginstadium van de ziekte bindt IgG zeer slecht aan de antigenen van het virus (lage aviditeit) en pas dan beginnen ze activiteit te vertonen, daarom kunnen we praten over een toename van de aviditeit van antilichamen.

We kunnen lang praten over de voordelen van enzymimmunoassay, omdat deze methode erin is geslaagd om veel diagnostische problemen op te lossen met alleen veneus bloed. Geen lange wachttijden, zorgen en problemen bij het inzamelen van onderzoeksmateriaal. Bovendien worden de testsystemen voor ELISA steeds beter en de dag is niet ver meer dat de test een 100% betrouwbaarheid van het resultaat zal geven.

Video: educatieve film van de Moscow State Medical University. Sechenov over de basis van ELISA