Virologiske forskningsmetoder innen infeksjonssykdommer. Virologiske studier Sikkerhetskopiering med Time Machine

Det er tre hovedtilnærminger til laboratoriediagnostikk av virusinfeksjoner.

1) direkte undersøkelse av materialet for tilstedeværelse av et viralt antigen eller nukleinsyrer;

2) isolering og identifikasjon av viruset fra klinisk materiale;

Direkte metoder for diagnostisering av klinisk materiale

Direkte metoder er metoder som tillater påvisning av et virus, viralt antigen eller viral nukleinsyre (NA) direkte i klinisk materiale, det vil si at de er de raskeste (2-24 timer).

Elektronmikroskopi (EM). Ved å bruke denne metoden kan du oppdage det faktiske viruset.

immunelektronmikroskopi (IEM), som bruker spesifikke antistoffer mot virus. Som et resultat av interaksjonen av antistoffer med virus, dannes komplekser, som etter negativ farging lettere oppdages.

Immunfluorescensreaksjon (RIF). Metoden er basert på bruk av fargestoffbundne antistoffer

RIF-metoden er mye brukt for raskt å dechiffrere etiologien til akutte luftveisvirusinfeksjoner i analysen av utstryk-avtrykk fra slimhinnen i øvre luftveier.

Enzymimmunanalyse (ELISA). Enzymimmunoanalysemetoder for bestemmelse av virale antigener ligner i prinsippet på RIF, men er basert på merking av antistoffer med enzymer i stedet for fargestoffer.

Radioimmunoassay (RIA). Metoden er basert på merking av antistoffer med radioisotoper, som sørget for høy sensitivitet ved bestemmelse av virusantigenet.

Molekylære metoder. Opprinnelig ble den svært spesifikke metoden for NA-hybridisering ansett som en klassisk metode for å påvise virusgenomet, men nå brukes isolering av virusgenomer ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen (PCR) i økende grad.

Molekylær hybridisering av nukleinsyrer. Metoden er basert på hybridisering av komplementære tråder av DNA eller RNA med dannelse av dobbelttrådet strukturer og påvisning av disse.

PCR er basert på prinsippet om naturlig DNA-replikasjon. Essensen av metoden er gjentatt repetisjon av sykluser av syntese (amplifikasjon) av en virusspesifikk DNA-sekvens ved bruk av en termostabil Taq DNA-polymerase og to spesifikke primere - de såkalte primere.

Cytologiske metoder er i dag av begrenset diagnostisk verdi, men bør fortsatt brukes ved en rekke infeksjoner. Obduksjonsmaterialer, biopsier, utstryk undersøkes, som etter passende bearbeiding farges og analyseres under et mikroskop.

For vellykket isolering av virus bør klinisk materiale tas i samsvar med patogenesen til den mistenkte sykdommen og så snart som mulig.

Ta som regel:

- ved luftveisinfeksjoner - nasofaryngeal lavage;

- med enterovirusinfeksjoner - rødme og avføring (reo-, enterovirus);

- med lesjoner i hud og slimhinner - utskraping, innholdet i vesiklene (herpes, vannkopper);

- med eksantemiske infeksjoner - vattpinner (meslinger, røde hunder);

- ved arbovirusinfeksjoner - blod, cerebrospinalvæske.

Cellekulturer, laboratoriedyr, kyllingembryoer brukes til å isolere virus. Prosessen er lang, noen ganger krever det flere passasjer, før viruset oppdages og identifiseres ved hjelp av en eller flere metoder - i nøytraliseringstesten (RN), RIF, ELISA eller PCR.

Serodiagnostikk

Serologisk diagnostikk basert på antigen-antistoff-reaksjonen kan brukes til å bestemme begge deler, og spiller en rolle i å bestemme etiologien til en virusinfeksjon selv med negative resultater av virusisolering.

RSK er en av de tradisjonelle serologiske testene og brukes til å diagnostisere mange virusinfeksjoner. To systemer deltar i reaksjonen: antistoffer av pasientens serum + standardvirus og saueerytrocytter + antistoffer mot dem, samt et titrert komplement. Hvis antistoffene og viruset matcher, binder dette komplekset komplement og lysering av sauerytrocytter skjer ikke (positiv reaksjon). Med en negativ RSC fremmer komplement lysis av røde blodceller. Ulempen med metoden er dens utilstrekkelig høye sensitivitet og vanskeligheten med å standardisere reagenser.IF-metoden, som ELISA, brukes til å bestemme antistoffer i serum.

Virologiske forskningsmetoder- metoder for å studere biologien til virus og deres identifikasjon. I virologi er metoder for molekylærbiologi mye brukt, ved hjelp av hvilke det var mulig å etablere den molekylære strukturen til virale partikler, hvordan de trenger inn i cellen og egenskapene til reproduksjonen av virus, den primære strukturen til virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder for å bestemme sekvensen av bestanddeler av virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer er under utvikling. Det blir mulig å koble funksjonene til nukleinsyrer og proteinene de koder med nukleotidsekvensen og å fastslå årsakene til intracellulære prosesser som spiller en viktig rolle ved e-virusinfeksjon.

Virologiske forskningsmetoder er også basert på immunologiske prosesser (interaksjon av antigen med antistoffer), biologiske egenskaper til viruset (evne til hemagglutinering, hemolyse, enzymatisk aktivitet), egenskaper ved interaksjonen mellom viruset og vertscellen (naturen til cytopatiken). effekt, dannelse av intracellulære inneslutninger, etc.).

Ved diagnostisering av virusinfeksjoner, i dyrking, isolering og identifisering av virus, samt ved fremstilling av vaksinepreparater, er metoden for vev og cellekultur mye brukt. Primære, sekundære, stabile kontinuerlige og diploide cellekulturer brukes. Primærkulturer oppnås ved å spre vev med proteolytiske enzymer (trypsin, kollagenase). Kilden til celler kan være vev og organer (oftere nyrer) av embryoer fra mennesker og dyr. En suspensjon av celler i et næringsmedium plasseres i de såkalte madrasser, flasker eller petriskåler, hvor cellene begynner å formere seg etter å ha festet seg til overflaten av karet. For virusinfeksjon brukes vanligvis et cellemonolag. Næringsvæsken dreneres, virussuspensjonen introduseres i visse fortynninger, og etter kontakt med cellene tilsettes friskt næringsmedium, vanligvis uten serum.

Celler fra de fleste primærkulturer kan subkultureres og omtales som sekundære kulturer. Med videre passasje av celler dannes en populasjon av fibroblastlignende celler som er i stand til rask reproduksjon, hvorav de fleste beholder det opprinnelige settet med kromosomer. Dette er de såkalte diploide cellene. Ved seriedyrking av celler oppnås stabile kontinuerlige cellekulturer. Under passasjer vises raskt delende homogene celler med et heteroploid sett av kromosomer. Stabile cellelinjer kan være monolag og suspensjon. Enlagskulturer vokser i form av et sammenhengende lag på glassoverflaten, suspensjonskulturer vokser i form av suspensjoner i ulike kar ved bruk av agitatorer. Det er over 400 cellelinjer avledet fra 40 forskjellige dyrearter (inkludert primater, fugler, krypdyr, amfibier, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker av individuelle organer og vev (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer kulturer bevarer vevsstruktur, noe som er spesielt viktig for isolering og passasje av virus som ikke formerer seg i udifferensierte vevskulturer (for eksempel koronavirus).

I infiserte cellekulturer kan virus påvises ved en endring i cellemorfologi, cytopatisk virkning, som kan være spesifikk, utseende av inneslutninger, ved å bestemme virale antigener i cellen og i kulturvæsken; etablere de biologiske egenskapene til viralt avkom i kulturvæske og titrering av virus i vevskultur, kyllingembryoer eller følsomme dyr; ved å påvise individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller klynger av nukleinsyrer ved cytokjemisk metode ved bruk av fluorescerende mikroskopi.

Isolering av virus er en møysommelig og langvarig prosess. Det utføres for å bestemme typen eller varianten av viruset som sirkulerer blant befolkningen (for eksempel for å identifisere serovarianten til virus a, vill eller vaksinestamme av virus a, etc.); i tilfeller der det er nødvendig å gjennomføre akutte epidemiologiske tiltak; når nye typer eller varianter av virus dukker opp; om nødvendig, bekreft den foreløpige diagnosen; for indikasjon på virus i miljøobjekter. Ved isolering av virus tas det hensyn til muligheten for deres utholdenhet i menneskekroppen, samt forekomsten av en blandet infeksjon forårsaket av to eller flere virus. En genetisk homogen populasjon av et virus oppnådd fra et enkelt virion kalles en viral klon, og prosessen med å oppnå det kalles kloning.

For å isolere virus, infeksjon av mottakelige forsøksdyr, brukes kyllingembryoer, men vevskultur brukes oftest. Tilstedeværelsen av viruset bestemmes vanligvis av spesifikk celledegenerasjon (cytopatisk effekt),

For isolering av en rekke virus, for eksempel virus a, brukes kyllingembryoer, for isolering av noen Coxsackie-virus og en rekke arbovirus - nyfødte mus. Identifikasjon av isolerte virus utføres ved hjelp av serologiske tester og andre metoder.

Når du arbeider med virus, bestemmes deres titer. Titrering av virus utføres vanligvis i vevskultur, og bestemmer den høyeste fortynningen av den virusholdige væsken, ved hvilken vevsdegenerasjon oppstår, inklusjoner og virusspesifikke antigener dannes. Plakkmetoden kan brukes til å titrere en rekke virus. Plakk, eller negative kolonier av virus, er foci av virus-ødelagte celler i en enkeltlags vevskultur under agarbelegg. Kolonitelling tillater en kvantitativ analyse av den smittsomme aktiviteten til virus på grunnlag av at én smittsom viruspartikkel danner én plakk. Plakk identifiseres ved å farge kulturen med livsviktige fargestoffer, vanligvis nøytralrøde; plakk adsorberer ikke fargestoffet og er derfor synlige som lyse flekker mot bakgrunnen av fargede levende celler. Titeren til viruset uttrykkes som antall plakkdannende enheter i 1 ml.

Rensing og konsentrasjon av virus utføres vanligvis ved differensiell ultrasentrifugering etterfulgt av sentrifugering i konsentrasjons- eller tetthetsgradienter. Immunologiske metoder, ionebytterkromatografi, immunosorbenter etc. brukes for å rense virus.

Laboratoriediagnose av virusinfeksjoner inkluderer påvisning av patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; virusisolering fra dette materialet; serodiagnose. Valget av laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfelle avhenger av sykdommens art, sykdomsperioden og laboratoriets evner. Moderne diagnostisering av virusinfeksjoner er basert på ekspressmetoder som lar deg få svar noen timer etter inntak av klinisk materiale i de tidlige stadiene etter sykdommen. Disse inkluderer elektron- og immunelektronmikroskopi,

Elektronmikroskopi av negativt fargede virus tillater differensiering av virus og bestemmelse av deres konsentrasjon. Bruken av elektronmikroskopi ved diagnostisering av virusinfeksjoner er begrenset til de tilfellene hvor konsentrasjonen av viruspartikler i det kliniske materialet er tilstrekkelig høy (10 5 av 1 ml og høyere). Ulempen med metoden er manglende evne til å skille mellom virus som tilhører samme taksonomiske gruppe. Denne ulempen elimineres ved å bruke immunelektronmikroskopi. Metoden er basert på dannelsen av immunkomplekser når spesifikt serum tilsettes viruspartikler, samtidig som den samtidige konsentrasjonen av viruspartikler oppstår, som gjør det mulig å identifisere dem. Metoden brukes også til å påvise antistoffer. For ekspressdiagnostikk utføres en elektronmikroskopisk undersøkelse av vevsekstrakter, avføring, væske fra vesikler og sekret fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er mye brukt for å studere morfogenesen til viruset; dets evner utvides med bruk av merkede antistoffer.

Metoden for molekylær hybridisering, basert på påvisning av virusspesifikke nukleinsyrer, gjør det mulig å oppdage enkeltkopier av gener og har ingen like når det gjelder sensitivitet. Reaksjonen er basert på hybridisering av komplementære tråder av DNA eller RNA (prober) og dannelse av dobbelttrådede strukturer. Den billigste proben er klonet rekombinant DNA. Sonden er merket med radioaktive forløpere (vanligvis radioaktivt fosfor). Bruken av kolorimetriske reaksjoner er lovende. Det finnes flere varianter av molekylær hybridisering: punkthybridisering, blothybridisering, sandwichhybridisering, in situ hybridisering, etc.

Antistoffer av lgM-klassen vises tidligere enn klasse G-antistoffer (på 3-5. sykdomsdagen) og forsvinner etter noen uker, så påvisningen indikerer en nylig infeksjon. IgM-klasse antistoffer påvises ved immunfluorescens eller enzymimmunanalyse ved bruk av anti-m-antisera (anti-IgM tungkjedesera).

Serologiske metoder i virologi er basert på klassiske immunologiske reaksjoner (se. Immunologiske forskningsmetoder ): komplementfikseringsreaksjoner

Immunoblotting brukes til å identifisere individuelle antigener av virus og antistoffer mot dem i komplekse blandinger uten forutgående rensing av proteiner. Metoden kombinerer proteinfraksjonering ved bruk av polyakrylamidgelelektroforese med påfølgende immunanalyse av proteiner ved enzymimmunanalyse. Separasjonen av proteiner reduserer kravene til antigenets kjemiske renhet og gjør det mulig å identifisere individuelle antigen-antistoff-par. Denne oppgaven er relevant, for eksempel ved serodiagnose av HIV-infeksjon, der falske positive enzymimmunoassay-reaksjoner skyldes tilstedeværelsen av antistoffer mot celleantigener, som er tilstede som et resultat av utilstrekkelig rensing av virale proteiner. Identifikasjon av antistoffer i sera til pasienter mot interne og eksterne virale antigener gjør det mulig å bestemme sykdomsstadiet, og i analysen av populasjoner - variasjonen av virale proteiner. Immunblotting ved HIV-infeksjon brukes som en bekreftende test for å oppdage individuelle virale antigener og antistoffer mot dem. Ved analyse av populasjoner brukes metoden for å bestemme variabiliteten til virale proteiner. Den store verdien av metoden ligger i muligheten for å analysere antigener syntetisert ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, bestemme deres størrelse og tilstedeværelsen av antigene determinanter.

Bibliografi: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virologi, Metoder, red. B. Meikhi, trans. fra English, M., 1988; Håndbok i mikrobiologiske og virologiske forskningsmetoder, red. M.O. Birger, M., 1982.

Virologiske forskningsmetoder er mye brukt i medisin for diagnostisering av mange smittsomme og noen onkologiske sykdommer av viral natur.

Virologiske forskningsmetoder brukes også for å identifisere, studere deres biologi og evnen til å påvirke dyre- og menneskeceller, noe som ytterligere bidrar til å forstå patogenesen til virussykdommer og velge de riktige metodene for deres behandling. I tillegg til å etablere etiologien til sykdommen og overvåke effektiviteten av terapi, er virologiske forskningsmetoder av stor betydning for å bestemme og implementere anti-epidemitiltak.

Direkte forskningsmetoder innen virologi

Direkte virologiske forskningsmetoder gjør det mulig å påvise et virus, viral nukleinsyre eller viralt antigen direkte i det kliniske materialet og er dermed de raskeste (ekspressmetoder - opptil 24 timer). Disse metodene er mindre informative og krever laboratoriebekreftelse med indirekte diagnostiske metoder på grunn av hyppig mottak av falske negative eller falske positive resultater. Direkte metoder inkluderer følgende forskningsmetoder:

• elektronmikroskopi med farging av virus ved negativ farging (lar deg bestemme tilstedeværelsen av viruset og dets konsentrasjon i materialet, forutsatt at 1 ml inneholder minst 105 virale partikler);
• immunelektronmikroskopi, basert på interaksjonen av spesifikke antistoffer med virus for å danne komplekser som er lettere å oppdage med negativ kontrast enn virus alene;
• enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) ved bruk av enzymmerkede antistoffer som binder seg til antigener, og danner komplekser som oppdages når substratet for det brukte enzymet tilsettes;
• immunfluorescensreaksjon (RIF) - direkte eller indirekte - basert på bruk av antistoffer assosiert med et fluorescerende fargestoff;
• radioimmunoassay (RIA) er basert på bruk av radioisotopmerkede antistoffer og gammatellere;
• cytologiske metoder er basert på mikroskopisk undersøkelse av fargede utstryk, biopsier, obduksjonsmaterialer;
• molekylære metoder - molekylær hybridisering av nukleinsyrer og polymerasekjedereaksjon (den første er basert på påvisning av komplementære tråder av nukleinsyrer ved hjelp av en etikett, den andre er basert på prinsippet om replikering av en virusspesifikk DNA-sekvens i tre stadier) .

Det er tre alternativer for molekylær hybridisering av nukleinsyrer - punkthybridisering, blot-hybridisering (brukes for å diagnostisere HIV-infeksjon) og in situ hybridisering (direkte i infiserte celler). PCR (polymerasekjedereaksjon) brukes nå i økende grad i overvåking og diagnostisering av virusinfeksjoner på grunn av den høye sensitiviteten og spesifisiteten til denne metoden.

Indirekte virologiske forskningsmetoder

Disse metodene er basert på isolering og identifikasjon av viruset. Dette er mer tidkrevende og tidkrevende metoder, men mer nøyaktige. Materialet for slike studier kan være innhold av vesikler, utskraping (med vannkopper, herpetiske lesjoner i hud og slimhinner), nasofaryngeal lavage (med luftveisinfeksjoner), blod og cerebrospinalvæske (med arbovirusinfeksjoner), avføring (med enterovirus). infeksjoner), vattpinner (med meslinger, røde hunder, etc.). På grunn av det faktum at virus bare kan formere seg i levende celler, utføres dyrkingen av viruset i vevskultur, kyllingembryo eller i kroppen til et dyr (hamster, hvit mus, hund, katt, noen arter av aper). Indikasjonen av viruset utføres ved cytopatisk virkning, i hemadsorpsjonsreaksjonen, i en fargetest, i henhold til resultatene avnen, i henhold til endringer eller deres fravær i kyllingembryoer eller vevskulturer, i henhold til overlevelsen av sensitive dyr.

Serologiske diagnostiske metoder brukt i virologi

Serologisk betyr virologiske forskningsmetoder basert på antigen-antistoff-reaksjonen. I dette tilfellet brukes oftest parede blodsera, som tas med flere ukers mellomrom. Med en økning i antistofftiter med 4 eller flere ganger, anses reaksjonen som positiv. For å bestemme typespesifisiteten til virus brukes en virusnøytraliseringsreaksjon, for å bestemme gruppespesifisitet brukes en komplementfikseringsreaksjon. Reaksjonene av passiv hemagglutinasjon, hemming av hemagglutinasjon, revers passiv hemagglutinering, RIF og ulike varianter av enzymimmunoassay er også mye brukt.

Relativt nylig, i løpet av genteknologisk forskning, er det utviklet en metode for å oppnå monoklonale antistoffer. Den smale spesifisiteten til monokloner overvinnes ved bruk av flere monoklonale antistoffer mot forskjellige virale determinanter. Dette økte sensitiviteten og spesifisiteten til virologiske forskningsmetoder med bestemmelse av virale antigener. For tiden er det laget mange forskjellige testsystemer for immunologisk diagnose av virusinfeksjoner.

metoder for å studere biologien til virus og deres identifikasjon. I virologi er metoder for molekylærbiologi mye brukt, ved hjelp av hvilke det var mulig å etablere den molekylære strukturen til virale partikler, hvordan de trenger inn i cellen og egenskapene til reproduksjonen av virus, den primære strukturen til virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder for å bestemme sekvensen av bestanddeler av virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer er under utvikling. Det blir mulig å koble funksjonene til nukleinsyrer og proteinene kodet av dem med nukleotidsekvensen og å etablere årsakene til intracellulære prosesser som spiller en viktig rolle i patogenesen av en virusinfeksjon.

Virologiske forskningsmetoder er også basert på immunologiske prosesser (interaksjon av et antigen med antistoffer), de biologiske egenskapene til viruset (evnen til hemagglutinering, hemolyse, enzymatisk aktivitet), egenskapene til interaksjonen mellom viruset og vertscellen (den arten av den cytopatiske effekten, dannelsen av intracellulære inneslutninger, etc.).

Ved diagnostisering av virusinfeksjoner, i dyrking, isolering og identifisering av virus, samt ved fremstilling av vaksinepreparater, er metoden for vev og cellekultur mye brukt. Primære, sekundære, stabile kontinuerlige og diploide cellekulturer brukes. Primærkulturer oppnås ved å spre vev med proteolytiske enzymer (trypsin, kollagenase). Kilden til celler kan være vev og organer (oftere nyrer) av embryoer fra mennesker og dyr. En suspensjon av celler i et næringsmedium plasseres i de såkalte madrasser, flasker eller petriskåler, hvor cellene begynner å formere seg etter å ha festet seg til overflaten av karet. For virusinfeksjon brukes vanligvis et cellemonolag. Næringsvæsken dreneres, virussuspensjonen introduseres i visse fortynninger, og etter kontakt med cellene tilsettes friskt næringsmedium, vanligvis uten serum.

Celler fra de fleste primærkulturer kan subkultureres og omtales som sekundære kulturer. Med videre passasje av celler dannes en populasjon av fibroblastlignende celler som er i stand til rask reproduksjon, hvorav de fleste beholder det opprinnelige settet med kromosomer. Dette er de såkalte diploide cellene. Ved seriedyrking av celler oppnås stabile kontinuerlige cellekulturer. Under passasjer vises raskt delende homogene celler med et heteroploid sett av kromosomer. Stabile cellelinjer kan være monolag og suspensjon. Enlagskulturer vokser i form av et sammenhengende lag på glassoverflaten, suspensjonskulturer vokser i form av suspensjoner i ulike kar ved bruk av agitatorer. Det er over 400 cellelinjer avledet fra 40 forskjellige dyrearter (inkludert primater, fugler, krypdyr, amfibier, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker av individuelle organer og vev (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer kulturer bevarer vevsstruktur, noe som er spesielt viktig for isolering og passasje av virus som ikke formerer seg i udifferensierte vevskulturer (for eksempel koronavirus).

I infiserte cellekulturer kan virus påvises ved en endring i cellemorfologi, cytopatisk virkning, som kan være spesifikk, utseende av inneslutninger, ved å bestemme virale antigener i cellen og i kulturvæsken; etablere de biologiske egenskapene til viralt avkom i kulturvæske og titrering av virus i vevskultur, kyllingembryoer eller følsomme dyr; ved å påvise individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller klynger av nukleinsyrer ved cytokjemisk metode ved bruk av fluorescerende mikroskopi.

Isolering av virus er en møysommelig og langvarig prosess. Det utføres for å bestemme typen eller varianten av viruset som sirkulerer blant befolkningen (for eksempel for å identifisere serovarianten til influensaviruset, vill- eller vaksinestammen av polioviruset, etc.); i tilfeller der det er nødvendig å gjennomføre akutte epidemiologiske tiltak; når nye typer eller varianter av virus dukker opp; om nødvendig, bekreft den foreløpige diagnosen; for indikasjon på virus i miljøobjekter. Ved isolering av virus tas det hensyn til muligheten for deres utholdenhet i menneskekroppen, samt forekomsten av en blandet infeksjon forårsaket av to eller flere virus. En genetisk homogen populasjon av et virus oppnådd fra et enkelt virion kalles en viral klon, og prosessen med å oppnå det kalles kloning.

For å isolere virus, infeksjon av mottakelige forsøksdyr, brukes kyllingembryoer, men vevskultur brukes oftest. Tilstedeværelsen av et virus bestemmes vanligvis av spesifikk celledegenerasjon (cytopatisk effekt), dannelse av symplaster og syncytier, påvisning av intracellulære inneslutninger, samt et spesifikt antigen påvist ved bruk av immunfluorescens, hemadsorpsjon, hemagglutinasjon (i hemagglutinerende virus), etc. . Disse tegnene kan bare oppdages etter 2-3 passasjer av viruset.

For isolering av en rekke virus, som for eksempel influensavirus, brukes kyllingembryoer, for isolering av noen Coxsackie-virus og en rekke arbovirus brukes nyfødte mus. Identifikasjon av isolerte virus utføres ved hjelp av serologiske tester og andre metoder.

Når du arbeider med virus, bestemmes deres titer. Titrering av virus utføres vanligvis i vevskultur, og bestemmer den høyeste fortynningen av den virusholdige væsken, ved hvilken vevsdegenerasjon oppstår, inklusjoner og virusspesifikke antigener dannes. Plakkmetoden kan brukes til å titrere en rekke virus. Plakk, eller negative kolonier av virus, er foci av virus-ødelagte celler i en enkeltlags vevskultur under agarbelegg. Kolonitelling tillater en kvantitativ analyse av den smittsomme aktiviteten til virus på grunnlag av at én smittsom viruspartikkel danner én plakk. Plakk identifiseres ved å farge kulturen med livsviktige fargestoffer, vanligvis nøytralrøde; plakk adsorberer ikke fargestoffet og er derfor synlige som lyse flekker mot bakgrunnen av fargede levende celler. Titeren til viruset uttrykkes som antall plakkdannende enheter i 1 ml.

Rensing og konsentrasjon av virus utføres vanligvis ved differensiell ultrasentrifugering etterfulgt av sentrifugering i konsentrasjons- eller tetthetsgradienter. Immunologiske metoder, ionebytterkromatografi, immunosorbenter etc. brukes for å rense virus.

Laboratoriediagnose av virusinfeksjoner inkluderer påvisning av patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; virusisolering fra dette materialet; serodiagnose. Valget av laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfelle avhenger av sykdommens art, sykdomsperioden og laboratoriets evner. Moderne diagnostikk av virusinfeksjoner er basert på ekspressmetoder som lar deg få respons noen timer etter inntak av klinisk materiale i de tidlige stadiene etter sykdommen. Disse inkluderer elektron- og immunelektronmikroskopi, samt immunfluorescens, metoden for molekylær hybridisering , påvisning av antistoffer av IgM-klassen, etc.

Elektronmikroskopi av negativt fargede virus tillater differensiering av virus og bestemmelse av deres konsentrasjon. Bruken av elektronmikroskopi ved diagnostisering av virusinfeksjoner er begrenset til de tilfellene hvor konsentrasjonen av viruspartikler i det kliniske materialet er tilstrekkelig høy (10 5 av 1 ml og høyere). Ulempen med metoden er manglende evne til å skille mellom virus som tilhører samme taksonomiske gruppe. Denne ulempen elimineres ved å bruke immunelektronmikroskopi. Metoden er basert på dannelsen av immunkomplekser når spesifikt serum tilsettes viruspartikler, samtidig som den samtidige konsentrasjonen av viruspartikler oppstår, som gjør det mulig å identifisere dem. Metoden brukes også til å påvise antistoffer. For ekspressdiagnostikk utføres en elektronmikroskopisk undersøkelse av vevsekstrakter, avføring, væske fra vesikler og sekret fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er mye brukt for å studere morfogenesen til viruset; dets evner utvides med bruk av merkede antistoffer.

Metoden for molekylær hybridisering, basert på påvisning av virusspesifikke nukleinsyrer, gjør det mulig å oppdage enkeltkopier av gener og har ingen like når det gjelder sensitivitet. Reaksjonen er basert på hybridisering av komplementære tråder av DNA eller RNA (prober) og dannelse av dobbelttrådede strukturer. Den billigste proben er klonet rekombinant DNA. Sonden er merket med radioaktive forløpere (vanligvis radioaktivt fosfor). Bruken av kolorimetriske reaksjoner er lovende. Det finnes flere varianter av molekylær hybridisering: punkthybridisering, blothybridisering, sandwichhybridisering, in situ hybridisering, etc.

Antistoffer av lgM-klassen vises tidligere enn klasse G-antistoffer (på 3-5. sykdomsdagen) og forsvinner etter noen uker, så påvisningen indikerer en nylig infeksjon. IgM-klasse antistoffer påvises ved immunfluorescens eller enzymimmunoassay ved bruk av anti-μ antisera (anti-IgM tungkjedesera).

Serologiske metoder i virologi er basert på klassiske immunologiske reaksjoner (se Immunologiske forskningsmetoder) : komplementfikseringsreaksjoner, hemagglutinasjonshemming, biologisk nøytralisering, immundiffusjon, indirekte hemagglutinasjon, radiell hemolyse, immunfluorescens, enzymimmunoassay, radioimmunoassay. Mikrometoder for mange reaksjoner er utviklet, og deres teknikker blir kontinuerlig forbedret. Disse metodene brukes til å identifisere virus ved bruk av et sett med kjente sera og for serodiagnose for å bestemme økningen i antistoffer i det andre serumet sammenlignet med det første (det første serumet tas de første dagene etter sykdommen, det andre - etter 2-3 uker). Diagnostisk verdi er ikke mindre enn en firedobling av antistoffer i det andre serumet. Hvis påvisningen av antistoffer i lgM-klassen indikerer en nylig infeksjon, vedvarer antistoffene i lgC-klassen i flere år, og noen ganger livet ut.

Immunoblotting brukes til å identifisere individuelle antigener av virus og antistoffer mot dem i komplekse blandinger uten forutgående rensing av proteiner. Metoden kombinerer proteinfraksjonering ved bruk av polyakrylamidgelelektroforese med påfølgende immunanalyse av proteiner ved enzymimmunanalyse. Separasjonen av proteiner reduserer kravene til antigenets kjemiske renhet og gjør det mulig å identifisere individuelle antigen-antistoff-par. Denne oppgaven er relevant, for eksempel ved serodiagnose av HIV-infeksjon, der falske positive enzymimmunoassay-reaksjoner skyldes tilstedeværelsen av antistoffer mot celleantigener, som er tilstede som et resultat av utilstrekkelig rensing av virale proteiner. Identifikasjon av antistoffer i sera til pasienter mot interne og eksterne virale antigener gjør det mulig å bestemme sykdomsstadiet, og i analysen av populasjoner - variasjonen av virale proteiner. Immunblotting ved HIV-infeksjon brukes som en bekreftende test for å oppdage individuelle virale antigener og antistoffer mot dem. Ved analyse av populasjoner brukes metoden for å bestemme variabiliteten til virale proteiner. Den store verdien av metoden ligger i muligheten for å analysere antigener syntetisert ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, bestemme deres størrelse og tilstedeværelsen av antigene determinanter.

20) Den viktigste strukturelle komponenten i virioner (komplette virale partikler) er et nukleokapsid, dvs. proteinkappen (kapsiden) som omslutter det virale genomet (DNA eller RNA). Nukleokapsiden til de fleste virusfamilier er omgitt av en lipoproteinkonvolutt. Mellom konvolutten og nukleokapsidet i noen virus (orto-, paramyxo-, rhabdo-, filo- og retrovirus) er det et ikke-glykosylert matriksprotein, som gir ekstra stivhet til virionene. Virus i de fleste familier har en konvolutt som spiller en viktig rolle for smitte. Virioner får det ytre laget av konvolutten når nukleokapsidet trenger inn i cellemembranen ved å spire. Envelopeproteiner er kodet av viruset, og lipider lånes fra cellemembranen. Glykoproteiner vanligvis i form av dimerer og trimerer danner peplomerer (fremspring) på overflaten av virioner (orto-, paramyxovirus, rhabdo-, filo-, korona-, bunya-, arena-, retrovirus). Glykosylerte fusjonsproteiner er assosiert med peplomerer og spiller en nøkkelrolle i virusets inntreden i cellen. Kapsider og konvolutter av virioner dannes av mange kopier av en eller flere typer proteinunderenheter som et resultat av en selvmonteringsprosess. Interaksjon i protein-proteinsystemet, på grunn av svake kjemiske bindinger, fører til forening av symmetriske kapsider. Forskjeller i virus i form og størrelse på virioner avhenger av formen, størrelsen og antallet strukturelle proteinunderenheter og arten av interaksjonen mellom dem. Kapsidet består av mange morfologisk uttrykte underenheter (kapsomerer) satt sammen fra virale polypeptider på en strengt definert måte, i samsvar med relativt enkle geometriske prinsipper. Proteinunderenheter, som forbindes med hverandre, danner kapsider av to typer symmetri: isometrisk og spiralformet. Strukturen til nukleokapsiden til innkapslede virus er lik strukturen til nukleokapsiden til ikke-innkapslede virus. På overflaten av konvolutten av virus skilles morfologisk uttrykte glykoproteinstrukturer - peplomerer. Sammensetningen av superkapsidmembranen inkluderer lipider (opptil 20-35%) og karbohydrater (opptil 7-8%), som er av cellulær opprinnelse. Den består av et dobbelt lag av cellulære lipider og virusspesifikke proteiner plassert utenfor og inne i lipidbiolaget. Det ytre laget av superkapsidskallet er representert av peplomerer (fremspring) av en eller flere typer, bestående av ett eller flere molekyler av glykoproteiner. Nukleokapsiden til innkapslede virus kalles ofte kjernen, og den sentrale delen av virionene som inneholder nukleinsyren kalles nukleoiden. Kapsomerer (peplomerer) består av strukturelle enheter bygget av en eller flere homologe eller heterologe polypeptidkjeder (proteinunderenheter). klassifisering av virus Isometriske kapsider er ikke kuler, men vanlige polyedre (ikosaeder). Deres lineære dimensjoner er identiske langs symmetriaksene. I følge Kaspar og Klug (1962) er kapsomerer i kapsider ordnet i henhold til ikosaedrisk symmetri. Slike kapsider består av identiske underenheter som danner et ikosaeder. De har 12 hjørner (hjørner), 30 flater og 20 flater i form av likebenede trekanter. I samsvar med denne regelen dannes kapsiden til poliovirus og munn- og klovsykevirus av 60 proteinstrukturenheter, som hver består av fire polypeptidkjeder. Ikosaederet løser optimalt problemet med å pakke repeterende underenheter inn i en streng kompakt struktur med et minimumsvolum. Bare noen konfigurasjoner av strukturelle underenheter kan danne overflatene, toppene og ansiktene til det virale ikosaederet. For eksempel danner de strukturelle underenhetene til adenovirus sekskantede kapsomerer (heksoner) på overflater og ansikter, og femkantede kapsomerer (peptoner) på toppene. I noen virus dannes begge typer kapsomerer av de samme polypeptidene, i andre av forskjellige polypeptider. Siden de strukturelle underenhetene til forskjellige virus er forskjellige fra hverandre, ser noen virus ut til å være mer sekskantede, andre mer sfæriske. Alle kjente DNA-holdige virveldyrvirus, med unntak av koppevirus, samt mange RNA-holdige virus (7 familier) har en kubisk kapsidsymmetritype. Reovirus, i motsetning til andre virveldyrvirus, har en dobbel kapsid (ytre og indre), hver bestående av morfologiske enheter. Virus med en spiralformet symmetri har form av en sylindrisk filamentøs struktur, deres genomiske RNA har form av en spiral og er plassert inne i kapsiden. Alle dyrevirus med spiralformet symmetri er omgitt av en lipoproteinkonvolutt. Helix-nukleokapsider er karakterisert ved lengde, diameter, helix-pitch og antall kapsomerer per omdreining av helixen. Så, i Sendai-viruset (paramyxovirus), er nukleokapsiden en helix omtrent 1 μm lang, 20 nm i diameter og en helix pitch på 5 nm. Kapsidet består av omtrent 2400 strukturelle enheter, som hver er et protein med en molekylvekt på 60 kD. Det er 11-13 underenheter per omdreining av helixen. I virus med spiral nukleokapsidsymmetri sikrer foldingen av proteinmolekyler til en helix maksimal interaksjon mellom nukleinsyre- og proteinunderenheter. I icosahedriske virus er nukleinsyren kveilet inne i virionene og interagerer med ett eller flere polypeptider som ligger inne i kapsiden.

Antireseptorer (reseptorer) Viral- overflatevirionproteiner, for eksempel hemagglutinin, som binder seg på en komplementær måte til den tilsvarende reseptoren til en mottakelig celle.

21) Immunologiske metoder i virologisk forskning.

Serologiske tester varierer i deres evne til å oppdage individuelle klasser av antistoffer. Agglutinasjonstesten er for eksempel god til å påvise IgM-antistoffer, men er mindre følsom for å påvise IgG-antistoffer. Komplementfiksering og hemolysetester, som krever komplement, påviser ikke ikke-komplementfestende antistoffer, som IgA-antistoffer og IgE-antistoffer. Bare antistoffer rettet mot antigene determinanter på virionoverflaten assosiert med patogenisitet deltar i virusnøytraliseringsreaksjonen. Følsomhet I. m. og. overgår alle andre metoder for studiet av antigener og antistoffer, spesielt radioimmunoassay og enzymimmunoassay gjør det mulig å fange tilstedeværelsen av protein i mengder målt i nanogram og til og med i pikogram. Med hjelp av I. m. og. Bestem gruppen og kontroller blodets sikkerhet (hepatitt B og HIV-infeksjon). Ved transplantasjon av tekstiler og kropper And. m. tillate bestemmelse av vevskompatibilitet og testing avmetoder. I rettsmedisin brukes Castellani-reaksjonen til å bestemme artsspesifisiteten til et protein og agglutinasjonsreaksjonen for å bestemme blodtypen.

Immunologiske metoder er mye brukt i laboratoriediagnostikk av infeksjonssykdommer. Sykdommens etiologi er også etablert på grunnlag av økningen i antistoffer mot patogenet i blodserumet til rekonvalesenten sammenlignet med prøven tatt i de første dagene av sykdommen. Basert på I. m. og. studere immuniteten til befolkningen i forhold til masseinfeksjoner, slik som influensa, og også evaluere effektiviteten av forebyggende vaksinasjoner.

Avhengig av deres mekanisme og regnskapet for resultater I. m. og. kan deles inn i reaksjoner basert på fenomenet agglutinasjon; reaksjoner basert på fenomenet nedbør; reaksjoner som involverer komplement; nøytraliseringsreaksjon; reaksjoner ved hjelp av kjemiske og fysiske metoder.

Reaksjoner basert på agglutinasjonsfenomenet. Agglutinasjon er liming av celler eller individuelle partikler - bærere av et antigen ved hjelp av immunserum til dette antigenet.

Den bakterielle agglutinasjonstesten med et passende antibakterielt serum er en av de enkleste serologiske testene. En suspensjon av bakterier tilsettes forskjellige fortynninger av det testede blodserumet, og etter en viss kontakttid ved t ° 37 ° registreres det ved hvilken høyeste fortynning av blodserumagglutinasjon. Agglutinasjonsreaksjonen til bakterier brukes til å diagnostisere mange infeksjonssykdommer: brucellose, tularemi, tyfoidfeber og paratyfusfeber, basillær dysenteri og tyfus.

Reaksjonen av passiv eller indirekte hemagglutinasjon (RPGA, RNGA). Den bruker erytrocytter eller nøytrale syntetiske materialer (for eksempel latexpartikler), på overflaten av hvilke antigener (bakterier, virale, vev) eller antistoffer adsorberes. Deres agglutinering oppstår når passende sera eller antigener tilsettes.

Den passive hemagglutinasjonsreaksjonen brukes til å diagnostisere sykdommer forårsaket av bakterier (tyfus og paratyfus, dysenteri, brucellose, pest, kolera, etc.), protozoer (malaria) og virus (influensa, adenovirusinfeksjoner, viral hepatitt B, meslinger, flåttbårne encefalitt, Krim hemorragisk feber, etc.), samt å bestemme visse hormoner, for å identifisere pasientens overfølsomhet for medikamenter og hormoner, som penicillin og insulin.

Hemagglutinasjonshemmingstesten (HITA) er basert på fenomenet forebygging (inhibering) av immunserumet av hemagglutinering av erytrocytter av virus, og brukes til å oppdage og titrere antivirale antistoffer. Det fungerer som hovedmetoden for serodiagnose av influensa, meslinger, røde hunder, kusma, flått-encefalitt og andre virusinfeksjoner, hvis utløsende midler har hemagglutinerende egenskaper. for eksempel, for serodiagnose av flått-encefalitt, helles to ganger fortynninger av pasientens serum i en alkalisk boratbufferløsning i brønnene på panelet. Deretter tilsettes en viss mengde, vanligvis 8 AU (agglutinerende enheter), av flått-encefalitt-antigen, og etter 18 timers eksponering ved t ° 4 ° tilsettes en suspensjon av gåseerytrocytter fremstilt i en sur fosfatbufferløsning. Hvis det er antistoffer mot det flåttbårne encefalittviruset i pasientens blodserum, nøytraliseres antigenet og erytrocyttagglutinasjon oppstår ikke.

Reaksjoner basert på fenomenet nedbør. Utfelling skjer som et resultat av interaksjonen av antistoffer med løselige antigener. Det enkleste eksemplet på en utfellingsreaksjon er dannelsen av et ugjennomsiktig utfellingsbånd i et reagensrør ved grensen til antigenlag på et antistoff. Mye brukt er ulike typer utfellingsreaksjoner i halvflytende agar eller agarosegeler (Ouchterlon dobbel immundiffusjonsmetode, radiell immundiffusjonsmetode, immunelektroforese), som er både kvalitative og kvantitative. Som et resultat av fri diffusjon i gelen av antigener og antistoffer i sonen med deres optimale forhold, dannes spesifikke komplekser - utfellingsbånd, som oppdages visuelt eller ved farging. Et trekk ved metoden er at hvert antigen-antistoff-par danner et individuelt utfellingsbånd, og reaksjonen er ikke avhengig av tilstedeværelsen av andre antigener og antistoffer i systemet som studeres.

Reaksjoner som involverer komplement, som brukes som fersk marsvinserum, er basert på evnen til Clq-komplement-subkomponenten og deretter andre komplementkomponenter til å feste seg til immunkomplekser.

Komplementfikseringsreaksjon (RSC) lar deg titrere antigener eller antistoffer i henhold til graden av komplementfiksering av antigen-antistoffkomplekset. Denne reaksjonen består av to faser: interaksjonen av antigenet med testblodserumet (testsystemet) og interaksjonen av hemolytisk serum med sauerytrocytter (indikatorsystem). Med en positiv reaksjon oppstår komplementfiksering i systemet som studeres, og deretter, med tillegg av erytrocytter sensibilisert med antistoffer, observeres ikke hemolyse. Reaksjonen brukes til serodiagnose av syfilis (Wasserman-reaksjon), virus- og bakterieinfeksjoner.

Nøytraliseringsreaksjonen er basert på antistoffers evne til å nøytralisere visse spesifikke funksjoner til makromolekylære eller løselige antigener, slik som enzymaktivitet, bakterielle toksiner og patogenisiteten til virus. Reaksjonen av nøytralisering av toksiner kan vurderes av den biologiske effekten, for eksempel titreres anti-tetanus og anti-botulinumsera. En blanding av toksin og antiserum administrert til dyr forårsaker ikke deres død. Ulike varianter av nøytraliseringsreaksjonen brukes i virologi. Når virus blandes med et passende antiserum og denne blandingen administreres til dyr eller cellekulturer, nøytraliseres virusenes patogenisitet og dyrene blir ikke syke, og cellene i kulturene blir ikke ødelagt.

Reaksjoner ved hjelp av kjemiske og fysiske merker. Immunfluorescens består i bruk av fluorokrom-merkede antistoffer, mer presist, immunglobulinfraksjonen av IgG-antistoffer. Det fluorokrommerkede antistoffet danner et antigen-antistoffkompleks med antigenet, som blir tilgjengelig for observasjon under et mikroskop i UV-stråler som eksiterer luminescensen til fluorokromet. Den direkte immunfluorescensreaksjonen brukes til å studere cellulære antigener, oppdage virus i infiserte celler og oppdage bakterier og rickettsia i utstryk.

Metoden for indirekte immunfluorescens er mer utbredt. basert på påvisning av et antigen-antistoffkompleks ved bruk av et selvlysende anti-lgG-antistoffsera og brukes til å påvise ikke bare antigener, men også titrere antistoffer.

Immunoenzym, eller enzymimmunologiske, metoder er basert på bruk av antistoffer konjugert med enzymer, hovedsakelig pepperrotperoksidase eller alkalisk fosfatase. I likhet med immunfluorescens brukes enzymimmunoassay til å oppdage antigener i celler eller titrere antistoffer på antigenholdige celler.

Den radioimmunologiske metoden er basert på bruk av en radioisotopmerking av antigener eller antistoffer. Det er den mest sensitive metoden for å bestemme antigener og antistoffer, brukt til å bestemme hormoner, medisiner og antibiotika, for å diagnostisere bakterielle, virale, rickettsiale, protozoale sykdommer, for å studere blodproteiner, vevsantigener.

Immunoblotting brukes til å påvise antistoffer mot individuelle antigener eller "gjenkjenne" antigener fra kjente sera. Metoden består av 3 trinn: separasjon av biologiske makromolekyler (for eksempel et virus) til individuelle proteiner ved bruk av polyakrylamidgelelektroforese; overføring av de separerte proteinene fra gelen til en fast bærer (blot) ved å påføre en polyakrylamidgelplate på aktivert papir eller nitrocellulose (elektroblotting); påvisning av de ønskede proteinene på substratet ved bruk av direkte eller indirekte enzymimmunoassay. Som diagnostisk metode brukes immunblotting ved HIV-infeksjon. Diagnostisk verdi er påvisning av antistoffer mot et av proteinene i virusets ytre skall.

22) Symmetrityper av virus (kubisk, spiralformet, blandet). Interaksjon av proteiner og nukleinsyrer i pakking av virusgenomer.

Avhengig av interaksjonen mellom kapsiden og nukleinsyren, kan viruspartikler deles inn i flere typer symmetri:

1). Kubisk symmetri type.

Kubiske kapsider er icosidere med omtrent 20 trekantede overflater og 12 hjørner. De danner en struktur som ligner en sfærisk formasjon, men faktisk er det et polyeder. I noen tilfeller er spesielle lipoproteinformasjoner kalt pigger festet til toppunktene til slike ikosaedriske polyedre. Rollen til disse piggene er antagelig redusert til interaksjonen av virioner eller virale partikler med de tilsvarende områdene av vertsceller som er følsomme for dem. Med kubisk symmetri pakkes den virale nukleinsyren tett (rullet til en ball), og proteinmolekylene omgir den, og danner et polyeder (ikosaeder). Et icosahedron er et polyeder med tjue trekantede flater som har kubisk symmetri og en tilnærmet sfærisk form. Ikosaedriske virus inkluderer herpes simplex-virus, reovirus, etc.

2). Spiral symmetri type. Spiralkapsider er noe enklere. De. Kapsomerene som utgjør kapsiden dekker det spiralformede NK og danner også et ganske stabilt proteinskall av disse virusene. Og ved bruk av høyoppløselige elektronmikroskoper og passende forberedelsesmetoder kan man se spiralstrukturer på virus. Med spiralformet symmetri av kapsiden, danner den virale nukleinsyren en spiralformet (eller spiralformet) figur, hul inni, og proteinunderenhetene (kapsomerene) er også stablet rundt den i en spiral (rørformet kapsid). Et eksempel på et virus med en spiralformet symmetri av kapsiden er tobakksmosaikkviruset, som er stavformet, og dets lengde er 300 nm med en diameter på 15 nm. Sammensetningen av en viral partikkel inkluderer ett RNA-molekyl på omtrent 6000 nukleotider i størrelse. Kapsiden består av 2000 identiske proteinunderenheter arrangert i en helix.

3). Blandet eller kompleks type symmetri. Som regel finnes denne typen symmetri hovedsakelig blant bakterielle virus. Og klassiske eksempler er disse fagene, E. coli eller tempererte fager. Dette er komplekse formasjoner som har et hode med indre nukleinhold, ulike typer vedheng, en haleprosess og en enhet med varierende grad av kompleksitet. Og hver komponent av slike partikler er utstyrt med en spesifikk funksjon som realiseres i prosessen med interaksjon mellom viruset og cellen. Med andre ord er en kompleks type symmetri en kombinasjon av kubisk symmetri, hodet er et icosider polyhedron, og de stavformede formasjonene er de kaudale prosessene. Selv om det blant bakterievirus også er ganske enkelt organiserte virioner, som er primitive nukleokapsider, sfæriske eller kubiske i form. Bakterievirus er mer komplekse enn plante- og dyrevirus.

24) Interaksjon av en fag med en celle. Virulente og tempererte fager.

Adsorpsjon.

Interaksjonen begynner med at viruspartikler festes til celleoverflaten. Prosessen blir mulig i nærvær av passende reseptorer på overflaten av cellen og antireseptorer på overflaten av viruspartikkelen.

Virus bruker cellereseptorer designet for å transportere essensielle stoffer: næringspartikler, hormoner, vekstfaktorer, etc.

Reseptorer: proteiner, karbohydratkomponent i proteiner og lipider, lipider. Spesifikke reseptorer bestemmer den videre skjebnen til den virale partikkelen (transport, levering til områder av cytoplasma eller kjerne). Viruset kan feste seg til uspesifikke reseptorer og til og med penetrere cellen. Denne prosessen forårsaker imidlertid ikke infeksjon.

Til å begynne med dannes en enkelt binding mellom antireseptoren og reseptoren. Dette båndet er skjørt og kan brytes. For dannelse av irreversibel adsorpsjon er multivalent binding nødvendig. Stabil binding oppstår på grunn av fri bevegelse av reseptormolekyler i membranen. Når et virus interagerer med en celle, observeres en økning i fluiditeten til lipider, og dannelsen av reseptorfelt i interaksjonsområdet mellom viruset og cellen. Reseptorene til en rekke virus kan bare være tilstede i et begrenset sett med vertsceller. Dette bestemmer organismens følsomhet for dette viruset. Dermed har viralt DNA og RNA evnen til å infisere et bredere spekter av vertsceller.

Antireseptorer kan finnes i unike virale organeller: utvekststrukturer i T-bakteriofager, fibre i adenovirus, pigger på overflaten av virale membraner, korona i koronavirus.

Penetrasjon.

2 mekanismer - reseptorendocytose og membranfusjon.

Reseptorendocytose:

Den vanlige mekanismen for innføring av næringsstoffer og regulerende stoffer i cellen. Forekommer i spesialiserte områder - der det er spesielle groper dekket med clathrin, er spesifikke reseptorer plassert i bunnen av gropen. Gropene gir rask invaginasjon og dannelse av vakuoler dekket med clathrin (det går ikke mer enn 10 minutter fra adsorpsjonsøyeblikket, opptil 2000 vakuoler kan dannes på ett minutt). Vakuoler smelter sammen med større cytoplasmatiske vakuoler for å danne reseptorosomer (som ikke lenger inneholder clathrin), som igjen smelter sammen med lysosomer.

Fusjon av virus- og cellemembraner:

I innkapslede virus medieres fusjon av punktinteraksjoner mellom virusproteinet og cellemembranlipider, noe som resulterer i integrering av den virale lipoproteinkappen med cellemembranen. I ikke-innkapslede virus interagerer et av overflateproteinene også med cellemembranlipider og den indre komponenten passerer gjennom membranen (i paramyxovirus, F-proteinet; i ortomyxovirus, den hemagglutinerende underenheten HA2). Konformasjonen av overflateproteiner påvirkes av pH.

Strip.

I denne prosessen forsvinner smittsom aktivitet, følsomhet for nukleaser oppstår ofte og motstand mot antistoffer oppstår. Sluttproduktet av avkledning er nukleinsyrer bundet til et internt viralt protein. Avkledningsstadiet begrenser også muligheten for infeksjon (virus er ikke i stand til å kle av seg i hver celle). Avkledning skjer i spesialiserte områder av cellen: lysosomer, Golgi-apparatet og det perinukleære rommet.

Avkledning skjer som følge av en rekke reaksjoner. For eksempel, i picornavirus, fortsetter avkledning med dannelse av mellomliggende subvirale partikler med størrelser fra 156 til 12S. I adenovirus i cytoplasma og nukleære porer og har minst 3 stadier:

Dannelse av subvirale partikler med høyere tetthet enn virioner;

Dannelse av kjerner der 3 virale proteiner mangler;

Dannelse av et DNA-proteinkompleks hvor DNA er kovalent koblet til et terminalt protein.

Karakterisering av virulente og tempererte fager.

Når en bakterie er infisert med en fag, oppstår den såkalte lytiske infeksjonen, det vil si at infeksjonen ender med lysering av vertscellen, men dette er kun karakteristisk for de såkalte virulente fagene, hvis interaksjon med cellen fører til celledød og dannelse av fagavkom.

Samtidig skilles følgende stadier i henhold til interaksjonene mellom fagen og cellen: blanding av fagen med cellekulturen (infeksjonsmangfoldet er 1 fag per 10 celler), og konsentrasjonen må være høy nok slik at fagene kan komme i kontakt med cellene. For å unngå re-infeksjon - etter infeksjon i maksimalt 5 minutter, når fagene er adsorbert - fortynnes denne blandingen av celler med fag. Det er en latent periode hvor antallet fager ikke øker, deretter en veldig kort utgangsperiode, når antallet fagpartikler øker kraftig, når cellen lyserer og fagavkom frigjøres, og deretter forblir antallet fag ved samme nivå, fordi re-infeksjon ikke forekommer. Basert på denne kurven kan disse fasene skilles: den vegetative perioden med "vekst" (latent periode), utgangsperioden og beregne fagutbyttet per 1 infisert celle. I løpet av den latente perioden kan det ikke finnes noe som ligner fagpartikler i bakterier, og det er ikke mulig å isolere smitteprinsippet fra slike celler i den latente perioden. Bare modne fagpartikler kan infisere bakterier. Dermed forårsaker virulente fager alltid bakteriedød og produserer infeksjon, som avsløres i produksjonen av nye virale partikler som er i stand til å infisere de neste og andre sensitive celler.

I motsetning til virulente, fører infeksjon med tempererte fager ikke til lysis av bakterieceller, men dannelsen av en spesiell tilstand av sameksistens av en fag med en bakteriecelle realiseres. Denne sameksistensen kommer til uttrykk i det faktum at en viss begynnelse av fagen er tilstede i bakteriecellen uten noen ugunstige forhold for det og bevares fra generasjon til generasjon. På visse stadier av slik sameksistens aktiveres fagen i cellen og går inn i tilstanden til den lytiske utviklingssyklusen, noe som forårsaker cellelyse og frigjøring av fagavkom. Slike fager kalles lysogene eller tempererte fager, og tilstanden til moderat eksistens med fagen er lysogeni, og bakteriene som inneholder en slik latent fag kalles lysogene bakterier. Begrepet lysogene bakterier kom fra det faktum at det en gang ble oppdaget kulturer der en fag spontant dukket opp, og denne bakteriofagen begynte å bli betraktet som forurensning av kulturen, det vil si at et bakterievirus kommer inn i kulturen, og slike kulturer ble kalt lysogene, det vil si at de genererer lysis .

metoder for å studere biologien til virus og deres identifikasjon. I virologi er metoder for molekylærbiologi mye brukt, ved hjelp av hvilke det var mulig å etablere den molekylære strukturen til virale partikler, hvordan de trenger inn i cellen og egenskapene til reproduksjonen av virus, den primære strukturen til virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder for å bestemme sekvensen av bestanddeler av virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer er under utvikling. Det blir mulig å koble funksjonene til nukleinsyrer og proteinene kodet av dem med nukleotidsekvensen og å etablere årsakene til intracellulære prosesser som spiller en viktig rolle i patogenesen av en virusinfeksjon.

Virologiske forskningsmetoder er også basert på immunologiske prosesser (interaksjon av antigen med antistoffer), biologiske egenskaper til viruset (evne til hemagglutinering, hemolyse, enzymatisk aktivitet), egenskaper ved interaksjonen mellom viruset og vertscellen (naturen til cytopatiken). effekt, dannelse av intracellulære inneslutninger, etc.).

Ved diagnostisering av virusinfeksjoner, i dyrking, isolering og identifisering av virus, samt ved fremstilling av vaksinepreparater, er metoden for vev og cellekultur mye brukt. Primære, sekundære, stabile kontinuerlige og diploide cellekulturer brukes. Primærkulturer oppnås ved å spre vev med proteolytiske enzymer (trypsin, kollagenase). Kilden til celler kan være vev og organer (oftere nyrer) av embryoer fra mennesker og dyr. En suspensjon av celler i et næringsmedium plasseres i de såkalte madrasser, flasker eller petriskåler, hvor cellene begynner å formere seg etter å ha festet seg til overflaten av karet. For virusinfeksjon brukes vanligvis et cellemonolag. Næringsvæsken dreneres, virussuspensjonen introduseres i visse fortynninger, og etter kontakt med cellene tilsettes friskt næringsmedium, vanligvis uten serum.

Celler fra de fleste primærkulturer kan subkultureres og omtales som sekundære kulturer. Med videre passasje av celler dannes en populasjon av fibroblastlignende celler som er i stand til rask reproduksjon, hvorav de fleste beholder det opprinnelige settet med kromosomer. Dette er de såkalte diploide cellene. Ved seriedyrking av celler oppnås stabile kontinuerlige cellekulturer. Under passasjer vises raskt delende homogene celler med et heteroploid sett av kromosomer. Stabile cellelinjer kan være monolag og suspensjon. Enlagskulturer vokser i form av et sammenhengende lag på glassoverflaten, suspensjonskulturer vokser i form av suspensjoner i ulike kar ved bruk av agitatorer. Det er over 400 cellelinjer avledet fra 40 forskjellige dyrearter (inkludert primater, fugler, krypdyr, amfibier, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker av individuelle organer og vev (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer kulturer bevarer vevsstruktur, noe som er spesielt viktig for isolering og passasje av virus som ikke formerer seg i udifferensierte vevskulturer (for eksempel koronavirus).

I infiserte cellekulturer kan virus påvises ved en endring i cellemorfologi, cytopatisk virkning, som kan være spesifikk, utseende av inneslutninger, ved å bestemme virale antigener i cellen og i kulturvæsken; etablere de biologiske egenskapene til viralt avkom i kulturvæske og titrering av virus i vevskultur, kyllingembryoer eller følsomme dyr; ved å påvise individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller klynger av nukleinsyrer ved cytokjemisk metode ved bruk av fluorescerende mikroskopi.

Isolering av virus er en møysommelig og langvarig prosess. Det utføres for å bestemme typen eller varianten av viruset som sirkulerer blant befolkningen (for eksempel for å identifisere serovarianten til influensaviruset, vill- eller vaksinestammen av polioviruset, etc.); i tilfeller der det er nødvendig å gjennomføre akutte epidemiologiske tiltak; når nye typer eller varianter av virus dukker opp; om nødvendig, bekreft den foreløpige diagnosen; for indikasjon på virus i miljøobjekter. Ved isolering av virus tas det hensyn til muligheten for deres utholdenhet i menneskekroppen, samt forekomsten av en blandet infeksjon forårsaket av to eller flere virus. En genetisk homogen populasjon av et virus oppnådd fra et enkelt virion kalles en viral klon, og prosessen med å oppnå det kalles kloning.

For å isolere virus, infeksjon av mottakelige forsøksdyr, brukes kyllingembryoer, men vevskultur brukes oftest. Tilstedeværelsen av et virus bestemmes vanligvis av spesifikk celledegenerasjon (cytopatisk effekt), dannelse av symplaster og syncytier, påvisning av intracellulære inneslutninger, samt et spesifikt antigen påvist ved bruk av immunfluorescens, hemadsorpsjon, hemagglutinasjon (i hemagglutinerende virus), etc. . Disse tegnene kan bare oppdages etter 2-3 passasjer av viruset.

For isolering av en rekke virus, som for eksempel influensavirus, brukes kyllingembryoer, for isolering av noen Coxsackie-virus og en rekke arbovirus brukes nyfødte mus. Identifikasjon av isolerte virus utføres ved hjelp av serologiske tester og andre metoder.

Når du arbeider med virus, bestemmes deres titer. Titrering av virus utføres vanligvis i vevskultur, og bestemmer den høyeste fortynningen av den virusholdige væsken, ved hvilken vevsdegenerasjon oppstår, inklusjoner og virusspesifikke antigener dannes. Plakkmetoden kan brukes til å titrere en rekke virus. Plakk, eller negative kolonier av virus, er foci av virus-ødelagte celler i en enkeltlags vevskultur under agarbelegg. Kolonitelling tillater en kvantitativ analyse av den smittsomme aktiviteten til virus på grunnlag av at én smittsom viruspartikkel danner én plakk. Plakk identifiseres ved å farge kulturen med livsviktige fargestoffer, vanligvis nøytralrøde; plakk adsorberer ikke fargestoffet og er derfor synlige som lyse flekker mot bakgrunnen av fargede levende celler. Titeren til viruset uttrykkes som antall plakkdannende enheter i 1 ml.

Rensing og konsentrasjon av virus utføres vanligvis ved differensiell ultrasentrifugering etterfulgt av sentrifugering i konsentrasjons- eller tetthetsgradienter. Immunologiske metoder, ionebytterkromatografi, immunosorbenter etc. brukes for å rense virus.

Laboratoriediagnose av virusinfeksjoner inkluderer påvisning av patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; virusisolering fra dette materialet; serodiagnose. Valget av laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfelle avhenger av sykdommens art, sykdomsperioden og laboratoriets evner. Moderne diagnostikk av virusinfeksjoner er basert på ekspressmetoder som lar deg få respons noen timer etter inntak av klinisk materiale i de tidlige stadiene etter sykdommen. Disse inkluderer elektron- og immunelektronmikroskopi, samt immunfluorescens, metoden for molekylær hybridisering , påvisning av antistoffer av IgM-klassen, etc.

Elektronmikroskopi av negativt fargede virus tillater differensiering av virus og bestemmelse av deres konsentrasjon. Bruken av elektronmikroskopi ved diagnostisering av virusinfeksjoner er begrenset til de tilfellene hvor konsentrasjonen av viruspartikler i det kliniske materialet er tilstrekkelig høy (10 5 av 1 ml og høyere). Ulempen med metoden er manglende evne til å skille mellom virus som tilhører samme taksonomiske gruppe. Denne ulempen elimineres ved å bruke immunelektronmikroskopi. Metoden er basert på dannelsen av immunkomplekser når spesifikt serum tilsettes viruspartikler, samtidig som den samtidige konsentrasjonen av viruspartikler oppstår, som gjør det mulig å identifisere dem. Metoden brukes også til å påvise antistoffer. For ekspressdiagnostikk utføres en elektronmikroskopisk undersøkelse av vevsekstrakter, avføring, væske fra vesikler og sekret fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er mye brukt for å studere morfogenesen til viruset; dets evner utvides med bruk av merkede antistoffer.

Metoden for molekylær hybridisering, basert på påvisning av virusspesifikke nukleinsyrer, gjør det mulig å oppdage enkeltkopier av gener og har ingen like når det gjelder sensitivitet. Reaksjonen er basert på hybridisering av komplementære tråder av DNA eller RNA (prober) og dannelse av dobbelttrådede strukturer. Den billigste proben er klonet rekombinant DNA. Sonden er merket med radioaktive forløpere (vanligvis radioaktivt fosfor). Bruken av kolorimetriske reaksjoner er lovende. Det finnes flere varianter av molekylær hybridisering: punkthybridisering, blothybridisering, sandwichhybridisering, in situ hybridisering, etc.

Antistoffer av lgM-klassen vises tidligere enn klasse G-antistoffer (på 3-5. sykdomsdagen) og forsvinner etter noen uker, så påvisningen indikerer en nylig infeksjon. IgM-klasse antistoffer påvises ved immunfluorescens eller enzymimmunoassay ved bruk av anti-μ antisera (anti-IgM tungkjedesera).

Serologiske metoder i virologi er basert på klassiske immunologiske reaksjoner (se Immunologiske forskningsmetoder) : komplementfikseringsreaksjoner, hemagglutinasjonshemming, biologisk nøytralisering, immundiffusjon, indirekte hemagglutinasjon, radiell hemolyse, immunfluorescens, enzymimmunoassay, radioimmunoassay. Mikrometoder for mange reaksjoner er utviklet, og deres teknikker blir kontinuerlig forbedret. Disse metodene brukes til å identifisere virus ved bruk av et sett med kjente sera og for serodiagnose for å bestemme økningen i antistoffer i det andre serumet sammenlignet med det første (det første serumet tas de første dagene etter sykdommen, det andre - etter 2-3 uker). Diagnostisk verdi er ikke mindre enn en firedobling av antistoffer i det andre serumet. Hvis påvisningen av antistoffer i lgM-klassen indikerer en nylig infeksjon, vedvarer antistoffene i lgC-klassen i flere år, og noen ganger livet ut.

Immunoblotting brukes til å identifisere individuelle antigener av virus og antistoffer mot dem i komplekse blandinger uten forutgående rensing av proteiner. Metoden kombinerer proteinfraksjonering ved bruk av polyakrylamidgelelektroforese med påfølgende immunanalyse av proteiner ved enzymimmunanalyse. Separasjonen av proteiner reduserer kravene til antigenets kjemiske renhet og gjør det mulig å identifisere individuelle antigen-antistoff-par. Denne oppgaven er relevant, for eksempel ved serodiagnose av HIV-infeksjon, der falske positive enzymimmunoassay-reaksjoner skyldes tilstedeværelsen av antistoffer mot celleantigener, som er tilstede som et resultat av utilstrekkelig rensing av virale proteiner. Identifikasjon av antistoffer i sera til pasienter mot interne og eksterne virale antigener gjør det mulig å bestemme sykdomsstadiet, og i analysen av populasjoner - variasjonen av virale proteiner. Immunblotting ved HIV-infeksjon brukes som en bekreftende test for å oppdage individuelle virale antigener og antistoffer mot dem. Ved analyse av populasjoner brukes metoden for å bestemme variabiliteten til virale proteiner. Den store verdien av metoden ligger i muligheten for å analysere antigener syntetisert ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, bestemme deres størrelse og tilstedeværelsen av antigene determinanter.

Bibliografi: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virologi, Metoder, red. B. Meikhi, trans. fra English, M., 1988; Håndbok i mikrobiologiske og virologiske forskningsmetoder, red. M.O. Birger, M., 1982.

• - metoder for å nøytralisere avfall som inneholder organiske stoffer, basert på deres oppvarming som et resultat av den vitale aktiviteten til termofile aerobe mikroorganismer ...

  Medisinsk leksikon

• - histokjemiske metoder for påvisning av enzymer, basert på reaksjonen av dannelsen av kalsium- eller magnesiumfosfatutfellinger ved lokalisering av enzymatisk aktivitet under inkubasjon av vevsseksjoner med organisk ...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for å påvise histiocytter i preparater av nervevev og forskjellige organer ved bruk av ammoniakksølv eller pyridin-sodaløsninger av sølv ...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for å vurdere antagelser om arvens natur, basert på en sammenligning av de observerte og forventede forholdstallene mellom syke og friske mennesker i familier belastet med arvelige sykdommer, under hensyntagen til metoden ...

  Medisinsk leksikon

• - brukes til å studere strukturen og funksjonen til celler og vev hos mennesker, dyr og planter under normale, patologiske og eksperimentelle forhold...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for å identifisere kjemikalier i histologiske snitt. En integrert del av G. m. er cytokjemiske metoder som oppdager kjemikalier i cellene til forberedte utstryk og utskrifter ...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for kvantitativ og kvalitativ bestemmelse av glukose i blod og urin, basert på oksidasjon av glukose med atmosfærisk oksygen i nærvær av enzymet glukoseoksidase ...

  Medisinsk leksikon

• - diagnostiske forskningsmetoder basert på den spesifikke interaksjonen mellom antigener og antistoffer ...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for å oppdage fibrøse strukturer av bindevev og neuroglia i histologiske preparater, basert på deres flerfargefarging...

  Medisinsk leksikon

• - 1) metode for farging av histologiske preparater av dermis ved å bruke Mayers hemalun, en løsning av kaliumalun og rhodamin; cellekjerner flekker blå, eleidine flekker rød...

  Medisinsk leksikon

• - i medisin - et sett med metoder for kvantitativ studie og analyse av tilstanden og oppførselen til gjenstander og systemer relatert til medisin og helsevesen ...

  Medisinsk leksikon

• - måter å studere ulike objekter ved hjelp av et mikroskop ...

  Medisinsk leksikon

• - basert på bruken av optikkens lover knyttet til naturen, forplantningen og interaksjonen med materie av elektromagnetisk stråling i det optiske området ...

  Medisinsk leksikon

• - metoder for forskning og evaluering av kvaliteten på gjenstander i miljøet ved hjelp av sanseorganer ...

  Medisinsk leksikon

• - det generelle navnet på en rekke metoder for å impregnere histologiske preparater med sølv for å oppdage glia og andre argyrofile fibre ...

  Medisinsk leksikon

• - er oppnevnt av etterforskeren og retten til å løse spesielle spørsmål som oppstår i etterforskning av forbrytelser og behandling av sivile saker. De er også holdt etter forslag fra rettsmedisinsk...

  Medisinsk leksikon

"Virologiske forskningsmetoder" i bøker

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Det første albumet til Los Angeles-bandet Rage Against The Machine kombinerte hiphop og hardrock, og strø dem med aktuelle politiske manifester og, hyggelig, en betydelig dose tett funkrytme. I sangen "Killing in the name", inkludert i den første singelen,

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970)

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) Mot slutten av 1960-tallet begynte James Brown å eksperimentere. Hjerteskjærende soul fra The Famous Flames ga plass for sydende funk fra The J.B.'s. En av de viktigste milepælene i den forestående funk-æraen var «Sex Machine», som i en ti-minutters versjon

Rage Against The Machine