PCR анализа кај мачки. Анализа за описторхијаза: општа, ифа, измет, каде и како да се земе, декодирање на резултатите

Коронавирусни инфекции кај мачки и кучиња се предизвикани од членови на родот Coronavirus (семејство Coronaviridae). Главната манифестација на инфекција со коронавирус кај кучињата е дијареа. Кај мачките, коронавирусот предизвикува ентеритис и заразен перитонитис, кои се широко распространети кај дивите и домашните мачки.

Предизвикувачкиот агенс на инфекција со коронавирус кај кучињата е кучешкиот коронавирус, кој предизвикува акутен коронавирус ентеритис. Болеста се пренесува со директен контакт со носителот на вирусот (преку плунка и измет). Кучињата од која било возраст се подложни на оваа инфекција, но најчесто се погодени кученцата и ослабените животни кои веќе претрпеле друга болест, како што е инфекцијата со парвовирус.

Главните симптоми на болеста се повраќање и дијареа, понекогаш помешани со крв, дехидрација, губење на тежината, апатија. Втората болест може да се развие 3-4 недели по закрепнувањето. При дијагностицирање на ентеритис со коронавирус кај кучиња, неопходно е да се разликува од парвовирусен ентеритис, цревна аденовирусна инфекција и темпера од месојади.

Коронавирусите на мачки се претставени со два биотипа: FECV, или коронавирус на ентеритис на мачки, и FIPV, вирус на инфективен перитонитис кај мачки (2, 3). Носачи на FECV се 16-50% од домашните мачки, кај кои вирусот е локализиран во тенкото црево без да предизвика болест или да предизвика блага дијареа. Во исто време, мутација на опортунистичка цревна форма на FECV во патогена (FIPV) може да се забележи кај 5-12% од носителите, што доведува до развој на болеста (2).

Инфективниот перитонитис на мачки (FIP), обично фатален, доаѓа во две форми - влажен и сув. Влажната (ексудативна) форма на ПИ се карактеризира со оштетување на крвните садови на абдоминалните или градните шуплини, придружено со потење на плазмата во овие шуплини (сл. 1). Кај болните животни се развива асцит (сл. 2), а во случај на акумулација на течност, респираторна дисфункција. Фибринозни прекривки се формираат на серозните облоги на абдоминалните органи (сл. 3), подоцна може да се формираат адхезии. Поради дисфункции на црниот дроб, склерата и кожата се ектерични.

Сувата (неексудативна) форма на ПИ продолжува без акумулација на течност во абдоминалните и градните шуплини. Во овој случај, зафатени се внатрешните органи - мозокот (сл. 4), црниот дроб, бубрезите, панкреасот, во 25% од случаите се забележани лезии на очите (сл. 5) (5).

Бидејќи сè уште не е развиен ефикасен режим на третман за PV, превентивните мерки насочени кон рано откривање на преносот на вирусот се од огромно значење (1, 3).

Дијагнозата на заразен перитонитис кај мачки е исто така голем проблем. Традиционалните методи за откривање на патогенот, засновани на откривање на антитела на коронавируси (RNGA и ELISA), даваат до 60% од лажно-позитивни резултати. Ова се должи на присуството на опортунистички патогени соеви во цревата на мачките (2, 3). Во голем број странски лаборатории, се користи сеопфатна техника за дијагностика на IP, вклучувајќи ја и дефиницијата за:
- титар на антитела на коронавирус;
- односот на албумин / глобулин во трансудат или крвна плазма;
- нивото на а-1 киселински гликопротеин (AGP);
- цитолошки и хематолошки параметри (4).

материјали и методи
Во студијата се користеше сојот на коронавирус Bagheera (5 1g TCD50 / ml) во разредување, 8 изолати на коронавирус кај мачки (FCoV), 2 изолати на коронавирус кај кучиња (CCV) и суспензија на вирусот на панлеукопенија на мачки и калицивирус на мачки.
При тестирање на системот за тестирање PCR, користен е биолошки материјал од здрави мачки, животни со клинички знаци на ПИ и мачки со неспецифични симптоми. Меѓу испитуваните животни и двете биле чувани во расадници и чувани поединечно.
Биолошкиот материјал беше истовремено проучуван со PCR и RIGA методи. Со помош на PCR системот се испитуваа измет, крвна плазма, трансудат со специфичен асцит, а со методот RIGA се испитуваше крвниот серум и трансудат.

Серолошки тестови беа спроведени со помош на комплет за откривање на антитела на месојадни коронавирус во Рига (TU 9388-025-00494189-01). Биолошкиот материјал на кучињата е испитан со PCR.

Сепак, оваа студија бара значителна инвестиција на време и пари. Во овој поглед, полимеразната верижна реакција (PCR) може да послужи како ефикасен метод за дијагностицирање на ПИ, што овозможува не само откривање на коронавируси на мачки, туку и диференцијација на опортунистички и патогени соеви врз основа на нивната различна локализација во телото. Во исто време, откривањето на вирусот во изметот на мачките укажува на превоз на опортунистички соеви (FECV), а во крвната плазма или течност за асцит - циркулација на патогени соеви во телото на животното (FIPV) и, следствено, болеста.

Целта на оваа студија е да се тестира систем за тестирање базиран на PCR за дијагноза на инфекција со коронавирус кај мачки и кучиња.

Изолацијата на РНК беше извршена со помош на комплетот РНК-сорб (TsNIIE), кој се базира на методот на нејзина сорпција на силика гел. PCR беше спроведена на засилувач TERTSIK („ДНК технологија“) според стандардниот метод. Добиените PCR производи беа визуелизирани со електрофореза во 1,5% агарозен гел кој содржи етидиум бромид.

Резултати и дискусија
Во текот на студијата, ги анализиравме информациите за нуклеотидните секвенци на претставниците на семејството Coronaviridae, особено различните изолати на коронавируси од мачки и кучиња објавени во базите на податоци Entrez, GeneBank, EMBL и DDBJ. Дополнително, беше проучувана литература која ја карактеризира структурата на геномите на FCoV, CCV и нивната генетска врска со другите членови на семејството.

Две конзервирани секвенци во генот на протеинот на нуклеокапсид беа избрани како цели за специфични прајмери. Специфичноста на предложените прајмери ​​беше проучувана со користење на компјутерските програми FASTA и BLASTA. Како резултат на оваа работа, хомологијата на избраните олигонуклеотиди беше откриена само со гените на нуклеокапсидниот протеин FCoV и CCV, и нивната значајна хомологија со нуклеотидните секвенци на другите видови од семејството Coronaviridae, како и сите други вируси, бактерии или еукариоти, не беше пронајден. Така, предложените прајмери, врз основа на теоретски пресметки, треба да имаат 100% специфичност.

Во следната фаза од студијата беа оптимизирани условите за изолирање на РНК на вирусот и спроведување на реакцијата на обратна транскрипција и PCR, а беа утврдени специфичноста и чувствителноста на PCR анализата. Големината на PCR производот беше 350 базни парови. Методот покажа 100% специфичност и висока чувствителност. Откривањето на коронавирус во изметот на мачките укажа на пренесување на неговите опортунистички соеви во цревата, откривање на FECV во трансудатот и крвната плазма - развој на болеста.

Во студијата со методот RNGA, позитивен резултат се сметаше за откривање на титар на антитела> 1: 128 кај животно. Сепак, ова може да укаже и на носител на вирус и на манифестирана форма на инфекција. Дополнително, позитивниот титар може да се должи на претходна изложеност на коронавирус. Изметот бил испитуван како материјал од кучиња, а откривањето на РНК на коронавирус кај нив укажувало на болест предизвикана од CCV.

За време на експериментот, бил проучуван биолошки материјал земен од 193 мачки (табела). Користејќи го методот RNGA, позитивен резултат е забележан кај 131 животно (титри на антитела> 1: 128). При тестирање на „серопозитивни“ мачки со ПЦР, РНК на коронавирус беше откриена во плазмата и асцитната течност кај 12 животни (9%), само во измет - кај 68 (52%) и 51 (39%) - воопшто не беше откриена. Така, 52% од мачките со серопозитивен резултат биле носители на опортунистички соеви на коронавирус, а 39% биле здрави. Очигледно, студијата со методот RNGA даде 63% лажно-позитивни резултати (во однос на вкупниот број на проучувани животни).

Заклучок
Добиените резултати покажуваат дека дијагнозата на инфекција со коронавирус кај мачки со традиционалниот серолошки метод (RNGA) дава повеќе од 60% од лажно-позитивните резултати, бидејќи не дозволува разликување на состојбата на носител од вистинската болест. Дополнително, животните кои имале претходен контакт со коронавирусот се сметале за „серопозитивни“.

Употребата на методот PCR овозможи да се разликуваат опортунистичките и патогените соеви во врска со нивната различна локализација во телото и да се разликува државата носител од болеста. Така, податоците од студијата укажуваат на изводливоста за користење на методот PCR за откривање на коронавирус кај мачки и кучиња и поставување конечна дијагноза.

Во согласност со наредбата бр. 45 на Одделот за ветеринарство на Министерството за земјоделство на Руската Федерација, во периодот од 03.08.2004 до 08.06.2004 година, нарачани тестови на системот за тестирање за дијагноза на заразен перитонитис кај мачки беа спроведени со PCR. Системот за тестирање успешно го помина комисиското тестирање, покажувајќи 100% специфичност и висока чувствителност во предложениот панел. Во моментов, тест системот „Coronavir“ за откривање и идентификација на коронавирус кај мачки и кучиња, врз основа на PCR, успешно се користи во ветеринарната пракса (TU 9388-142-00494189-05; RU No. P077-1-3.5-0813 регистриран во Руската Федерација за бр. PVR-1-3.5 / 01556 од 30 јуни 2006 година за период од 5 години).

ЛИТЕРАТУРА
1, Addie, D, D „Jarrett, 0. Употреба на верижна реакција на полимераза на реверзна транскриптаза за следење на пролевањето на коронавирус кај мачки од страна на здрави мачки, ветеринар. Rec, 2001, 26 мај; 148 (21): 649-53,
2, Vennema, H, атал. Вирусите на инфективниот перитонитис на мачките произлегуваат од мутација од ендемични ентерични коронавируси на мачки, Вирологија, 1998: 150-157.
3, Херевег, АА, Малер, М „Хедрих, Х.Ј., Хагманс, Б.Л. 4 август 1997 година; 234 (2): 349-363,
4, Споредба на различни тестови за дијагностицирање на инфективен перитонитис кај мачки; Катрин Хартман на Ал „2003.
5, инфективен перитонитис на мачки; Стејси Е, Ендрју, ветеринарни клиники на Северна Америка: мало животно; кн. 30, број 5, септември 2000 г

Е.А. ЈАРАЛОВА, И.Л. ОБУХОВ, М.М. РАХМАНИН, Е.И. ЕЛИЗБАРАШВИЛИ, В. И. УЛАСОВ,
Серуски државен центар за квалитет и стандардизација на лекови за животни и добиточна храна, Москва

PCR е полимеразна верижна реакција заснована на принципот на копирање на специфичен дел од ДНК влакно. Поради повеќекратното зголемување на волуменот на ДНК материјалот, станува возможно да се детектираат саканите бактерии во микроскопот. Предноста на PCR е:

• висока чувствителност;
• висока специфичност;
• идентификација на акутни и латентни инфекции;
• способноста да се идентификува кој било од моментално познатите патогени.

PCR во ветеринарната медицина

Во моментов, дијагностичкиот метод на PCR најде широка примена во ветеринарната медицина. Овој метод на истражување ви овозможува да добиете сигурен одговор за кратко време. Покрај тоа, потребна е многу мала количина на биолошки материјал, за разлика од, на пример, општ тест на крвта, што во голема мера ја поедноставува работата на ветеринарите. И кај луѓето и кај животните, материјалот за поставување на PCR може да биде:

• крв и неговите компоненти;
• урина;
• биопсија на желудникот;
• плунка;
• стружење на епителните клетки.

PCR дијагностика за мачки

Кога мачката е прегледана од ветеринар, може да биде неопходно да се изврши PCR тест на мачката за да се потврди или негира сомнителната дијагноза. Причината за назначување на таква студија може да биде најчестата и во исто време тешко дијагностицирана болест, како што се перитонитис, ринотрахеит, коронавирус, токсоплазмоза итн.

Вирусната имунодефициенција на мачки е особено сериозна болест која бара метод на PCR. Овој вирус влијае не само на имунолошкиот систем, туку и на нервниот систем на животното. Телото на мачката станува ослабено и незаштитено од бактерии и вируси, како резултат на што животното умира од секундарни инфекции. И за да се исклучи присуството на овој вирус, ветеринарот препорачува да се спроведе полимеразна верижна реакција за мачката.

Овој метод, покрај разновидноста на предностите, има и голем број на недостатоци. Сите машини за PCR дијагностика се многу чувствителни и затоа најмала контаминација може да даде лажно позитивен одговор. Високата цена на опремата и реагенсите исто така не е неважна, така што не секоја ветеринарна клиника во Москва може да ја купи. Сепак, дијагнозата на болести без овој метод станува сè потешка, затоа, PCR анализата кај мачките во Москва може да се направи во нашата клиника со контактирање на броевите за контакт или со оставање барање на веб-страницата.

Ветеринарен терапевт IVC МБА

Во современиот свет, многу луѓе им даваат предност на мачките заради нивната поголема независност од луѓето, за разлика од кучињата на кои треба да им се даде време; адаптација на осамен начин на живот, благодат и способност да го загрее својот сопственик во студените зимски денови. Вљубениот и грижлив сопственик се обидува да го заштити своето милениче од неволји во форма на разни болести од кои страдаат мачките.

Оваа загриженост се манифестира во висококвалитетна исхрана и навремено спречување на вирусни заболувања. За жал, постојат голем број на видови неизлечиви вирусни инфекции на кои мачките се подложни. Во отсуство на симптоми на болеста и специфична дијагностика, можете да живеете со животното долго време, несвесно за присуството на хронична вирусна инфекција (во натамошниот текст CVI) кај домашно милениче. Во оваа статија би сакал детално да ја откријам опасноста од CVI, да се обидам да го избегнат овој проблем при купувањето на посакуваното маче.

Значи, што се хронични вирусни инфекции и каква опасност претставуваат за нашите миленици. CVI се вирусни заболувања со долг период на инкубација, кој може да трае од неколку недели до неколку години. Инфекцијата може да се појави и во матката и преку контакт на здрави мачки со болни животни, како и со носители.

Коронавируси -етоРНК - кои содржат вируси . Овие вируси го добиле ова име поради сличноста на процесите во форма на клубени со корона спинарум. Инфекцијата е предизвикана од вирус од семејството Коронавириди. Постојат 2 патогени соеви - најблиските роднини на истиот микроорганизам. Едниот предизвикува перитонитис, другиот - ентеритис.

Коронавирусите се поделени во 3 форми:

Асимптоматска форма - животното може да биде носител на вирусот и може да зарази други мачки, додека ништо не му се заканува на животот.

Блага форма, не е опасен и е способен да предизвикува прилично лесно тегоби - ентеритис (интестинални мачки коронавируси - FECV).

Високо патогена форма е вирусот на инфективен перитонитис кај мачки (FIPV). Во телото се случуваат деструктивни промени во сите системи и органи, што доведува до смрт.

Коронавирусниот ентеритис (FECV) е релативно безбеден и се јавува кај животните на млада возраст, а симптомите се базираат на течна столица, што ретко доведува до смрт; Но, вирусниот перитонитис кај мачките е исклучително опасен, бидејќи има висока стапка на смртност. FIPV и FECV се доста меѓусебно поврзани, овие микроорганизми се сметаат за единствена популација на вируси, но со различни степени на патогени промени. Истражувањата покажаа дека корона ентеритисот во процесот на мутација се претвора во вирусен перитонитис.

Преносот на инфекцијата е орназален, т.е. инфекција се јавува преку респираторниот тракт со капки во воздухот, преку измет, хранење мачиња, за време на парењето. Кај мачките кои живеат сами, оваа болест е поретка, поголем процент од оваа болест се јавува кај мачки на изложба, како и кај мачки кои живеат во големи групи.

Симптоми

Постојат 2 форми на VIPK:

1. Ексудативен (со „излив“)

„Влажниот“ перитонитис е придружен со јасен знак за присуство на течност во градите или абдоминалната празнина. Течноста генерално има светло жолта нијанса, има одредена вискозност.

Со акумулација на биолошка течност во градната празнина, животното доживува респираторно оштетување како резултат на излив, додека мачката зема присилна поза. Дишењето е почесто од градно-абдоминален тип.

Кога течноста се акумулира во абдоминалната празнина, сопствениците често обрнуваат внимание на зголемениот стомак на миленичето.

Може да се забележи и:

• треска (не секогаш);
• губење на тежина;
• општа слабост, депресија;
• зголемени лимфни јазли;
• намален или губење на апетит.

2. Неексудативен („сув“)

Симптомите често се благи во оваа форма. Оваа форма е тешко да се дијагностицира. Нејзини карактеристични карактеристики се губење на тежината и недостаток на апетит.

Дијагностика.Тоа се случува на сложен начин. За почеток, од животното се земаат клинички и биохемиски тестови на крвта; изврши ултразвук на абдоминалната празнина; серолошки методи на истражување (ELISA - определување на количината на антитела на дадена болест; или ICA - експрес тест), исто така ја испитуваат изливната течност.

Прогноза... Несакани. Понекогаш, со ексудативната форма на ВИП, по отстранувањето на течноста и спроведениот симптоматски третман, се развива „сув“ облик на болеста. Мачките со „сув“ VIPK можат да живеат до една година.

Третман... За жал, не постои лек за оваа болест, се спроведува само симптоматска терапија, насочена кон подобрување на квалитетот на животот на миленикот.

Профилакса... Наменето е да се намали бројот на мачки кои се чуваат во една просторија (максимум 6-10 мачки). Чистота и навремена дезинфекција на искористените тацни и нивниот доволен број, честа промена на филерот.

Ова е хронична вирусна болест која се карактеризира со слабеење на имунолошкиот систем, развој на анемија и лимфосарком. Младите животни се многу подложни на оваа инфекција. FeLV се дијагностицира во сите земји во светот, болеста влијае на мачките од различни возрасни групи и раси.

Патеки Преносливост... Фекално-орален (плунка, измет, назален исцедок), преку млеко на заразени мачки, каснувања, контакт со болно животно од мачка на мачка, можен е пренос од болви, како и ако не се почитуваат правилата за асепса и антисептици при инјекции, собирање крв.

Патогенеза... FeLV се должи на генетска предиспозиција, како и на имунолошки недостатоци кај животните. Болните мачки со титар на антитела од 1:32 можеби немаат клиничка слика за болеста, но таквите животни се сметаат за носители на вируси. Антителата исто така може да бидат незабележливи кај клинички болни мачки. FeLV ја инхибира активноста на црвената коскена срцевина, што доведува до анемија, го намалува имунитетот и придонесува за развој на други болести.

Клиничка сликаПостојат три форми на болеста:

1. Стабилна или упорна. Имунитетот на такво животно е значително ослабен, болеста напредува прилично брзо и третманот е најчесто неефикасен.
2. Латентна или латентна. Животното има нарушување на циркулацијата. Вирусот навлегува во лимфниот систем и во црвената коскена срцевина. Животното почнува да боли почесто, се појавуваат тумори.
3. Преодни или минливи. Поради силниот имунитет, животното се опоравува 3 месеци по инфекцијата.

Почесто отколку не, сите такви животни имаат тешка анемија, имуносупресија (предиспозиција за други инфекции или нејзино присуство), лимфосарком - повеќекратен или атипичен. Периодот на инкубација е 60-80 дена, понекогаш од 2 до 6 години. FeLV се јавува во латентна форма без манифестација на клинички симптоми на инфекција и може да не се манифестира долго време. Под влијание на негативни фактори (промена на условите за хранење, хипотермија, стрес), вирусот се активира и болеста се развива. На самиот почеток може да се забележат промени во крвта (леукоцитоза, лимфоцитоза, појава на атипични крвни зрнца); бледило / иктерус на мукозните мембрани, зголемени лимфни јазли, губење на тежината, намален апетит, варење.

Дијагностика

Се јавува врз основа на клинички, хематолошки, серолошки и вирусолошки студии. Најзначајните дијагностички методи вклучуваат:

• Ензимско-поврзана имуносорбентна анализа (ELISA), имунохроматографска анализа (ICA). Лажни негативни резултати се вообичаени.
• Клинички тест на крвта.
• Биохемија на крв.
• Ултразвук на абдоминалната празнина.
• Биопсија и хистологија.

Третман... Нема лек. Таа е насочена кон обезбедување на симптоматска терапија и подобрување на квалитетот на животот на животното. На пример, со тешка анемија, се пропишува трансфузија на крв, како и употреба на лекови кои го стимулираат производството на црвени крвни зрнца во црвената коскена срцевина. Пропишани лекови кои го стимулираат имунолошкиот систем. Ако се најдат лимфоми, се дава хемотерапија.

Профилакса... Вирусот е многу нестабилен во надворешната средина, надвор од жив организам умира по два дена. За да се уништи овој вирус, доволно е да се дезинфицираат просториите и предметите за нега на животните, чиниите и сл. Одржувањето на домашно милениче чисто, хранлива храна и ограничување на контактот со бездомните животни е клучот за здравјето на миленикот.

Оваа болест е опасна само за мачки, за луѓето и другите видови животни, не претставува никаков ризик.

Главниот метод за спречување на оваа болест е вакцинацијата. За такви цели се користат вакцините Purevax FeLV и Leukocel. Вакцинацијата се спроведува од деветнеделна возраст. Имунизацијата се врши два пати, со интервал од 21 ден. Понатаму, мачките треба да се вакцинираат еднаш годишно.

Вирусна имунодефициенција (VIC, FIV)

Заразна болест на мачки, која се карактеризира со хроничен тек, придружен со оштетување на имунолошкиот систем, висока смртност.

Оваа болест стана ендемична кај мачките низ целиот свет.

Вирусот останува на собна температура околу 4 дена. Кога се загрева до 60 степени, вирусот умира во рок од половина час, за време на вриење умира. Кога се третира со лекови кои содржат алкохол, вирусот се деактивира по 5-10 минути. VIC е доста отпорен на ултравиолетова светлина.

Мачките скитници се почесто болни со VIC, приближната возраст на животните е 5-10 години.

Патеки Преносливост... Главниот начин е каснувањето на болни животни, поголеми се шансите да се заразат мачките кои не се педигре; инфекцијата е честа и кај животните кои имаат слободен пристап до улица. Инфекцијата е можна со меѓусебно лижење. Вирусот се наоѓа во плунката, крвта и другите течности.

Клиничката слика.Клиничките знаци се прилично неспецифични и доста разновидни. Тие ги одразуваат истовремените инфекции кои се развиваат против позадината на намалувањето на имунолошкиот систем. Животните се развиваат:

• Слабост;
• Губење на апетит;
• Гингивитис;
• Хронична дијареа
• Губење на тежината итн.

Поради неправилно функционирање на имунолошкиот систем на животното, во VIC може да се приклучат разни инфекции: калцивироза, кламидија, вирусна леукемија итн., кои ја влошуваат општата состојба.

Мачките со FIV се изложени на зголемен ризик од развој на лимфом, а клиничките знаци може да бидат слични на оние на FeLV.

Дијагностика... Се користат клинички лабораториски тестови: крв ОЦА (може да се појави неутропенија, лимфопенија, анемија, моноцитоза). Биохемиски тест на крвта открива голема количина на протеини, зголемување на активноста на ензимите на црниот дроб, азотемија, хипергликемија.

Постојат неколку специфични студии за оваа болест:

Ензимско-поврзана имуносорбентна анализа (ELISA); IHA.

Вирусот може да се открие со PCR доколку серолошките тестови се негативни.

Третман.Во моментов нема специфичен третман.

Беше забележано дека третманот со зидовудин ја подобрува клиничката состојба и функцијата на имунолошкиот систем кај многу мачки. Овие лекови се скапи и може да предизвикаат значителни несакани реакции како што е анемија. Исто така, се користат имуномодулатори кои имаат корисен ефект врз телото.

Не треба да се вакцинираат клинички нездрави мачки и мачки со низок имунолошки систем.

Профилакса... Нема вакцини. Минимизирање на контакт со мачки надвор од домот. Усогласеност со исхраната, одржување на животните чисти, дезинфекција на предметите за нега и навремена замена на филер во послужавници. Кога ќе се појават нови животни - задолжителен карантин и медицински преглед на ново милениче.

Сакајте ги вашите миленици!

Библиографија:

• Гаскел, Бенет: Прирачник за заразни болести на кучиња и мачки, печатење на аквариум, 2015 година.
• Различни извори од Интернет

За почеток, би сакал да одредам што е значењето на методот на полимеразна верижна реакција (PCR) од практична гледна точка, од гледна точка на ветеринар. Што точно треба да разбере лекар кој препишува PCR анализа... Нема да навлегувам во никакви чисто професионални детали за молекуларните механизми вклучени во PCR. Само сакам ветеринарот јасно да разбере: методот на ПЦР е директен, а при спроведување на таква студија, се претпоставува дека е можно да се изолира нуклеинската киселина (ДНК или РНК) на наводниот патоген од клиничкиот материјал испратен во лабораторија. . Ова е главниот постулат. Но, и покрај овој постулат, многу често наидувам на мислење, кое ќе го наречам Мит 1 , дека секој предизвикувачки агенс на која било болест може да се открие со PCR во крвта. Строго кажано, во овој случај, крвта се јавува како еден вид колективна слика на универзален материјал за истражување. Честопати сакаат да работиме „со се и за се“. За жал, тоа не е можно. Како да се утврди кој патоген може да се најде со помош на PCR, а кој не? При изборот на материјал за истражување со методот на PCR, лекарот пред сè мора да ја замисли патогенезата на болеста или болестите, чии предизвикувачки агенси сака да ги открие. Ако интравиталното собирање на потребниот материјал од животното не е можно, тогаш не треба да пропишувате таква дијагноза. Во моментов, во арсеналот на лаборатории постојат многу достапни дијагностички методи, на пример, ензимски имуносорбентна анализа. Овој метод ви овозможува да го одредите присуството на антитела на патогенот, нивниот број и, според одредени критериуми, со висок степен на сигурност - статусот на болеста. За поголема јасност, можете да разгледате конкретни примери. Уште еднаш, да се задржиме на коронавирусот кај мачките и, конкретно, на заразниот перитонитис. Во моментот на мутација на вирусот во цревата на мачката, тој добива афинитет за моноцити. Инфицирајќи моноцит, вирусот влегува во крвотокот на мачката, ова е неоспорен факт, но моноцитот е во крвотокот многу кратко време, нормално околу 3 дена, а потоа мора да ја претрпи својата конечна диференцијација во ткивен макрофаг. Затоа, моноцитот, заедно со коронавирусот, го остава крвотокот низ ѕидовите на садовите во ткивото, каде што станува макрофаг. Постојат докази дека коронавирусот исто така ја стимулира забрзаната диференцијација на моноцитите. Од ова произлегува дека коронавирусот, несомнено, некое многу кратко време е во периферната крв на животното и, се разбира, може да се најде таму, но ова е многу ретко откритие и дијагностичката вредност на тестовите на крвта за присуството на коронавирус со PCR е нула, бидејќи негативниот резултат од ваква студија, за жал, не исклучува присуство на инфекција со коронавирус. Исто така, понекогаш лекарот има желба да го пронајде во крвта со PCR парвовирусот на кучиња и мачки. Можам да претпоставам дека оваа желба се заснова на леукопенија забележана кај панлеукопенија или парвовирусен ентеритис. Веројатно некој верува дека оваа леукопенија е резултат на уништување на леукоцитите од вирусот директно во крвотокот. Ајде да размислиме логично: парвовирусот е вирус што содржи ДНК, а за успешно размножување и размножување, вирусот што содржи ДНК треба да се интегрира во геномот на домаќинот и во клетките кои активно се делат, инаку како вирусот ќе се размножува? Секој знае дека леукоцитите нормално не се делат во крвта. И нивните претходници се поделени во коскената срцевина. Парвовирусот ја напаѓа коскената срцевина, а леукопенија е резултат на уништување на прогениторните клетки во коскената срцевина. Активно се делат и клетките на цревните ресички, каде парвовирусот успешно се реплицира, а најдобар материјал за истражување на парвовирусната инфекција е животинскиот измет, со чија помош вирусот се шири во надворешната средина. Општо земено, коронавирусот и парвовирусот користат крв само како, релативно кажано, транспортен медиум за да стигнат до конечната локализација и доволно брзо да го напуштат крвотокот. Постојат вируси кои воопшто не влегуваат во крвотокот. Примерите вклучуваат калицивирус и херпес вирус на мачки. Репликацијата на овие вируси најчесто е ограничена на лимфоидното ткиво на устата и назофаринксот. Калицивирусната инфекција може да се појави системски, но ова се доста ретки и тешки случаи.

Бидејќи зборуваме за вирусни инфекции, би сакал да забележам дека методот на PCR е многу точен и многу специфичен, но оваа специфичност и лабилност на геномот на вирусите, особено оние што содржат РНК, во реалноста може да доведе до фактот дека Специфичен тест систем за истражување со методот PCR може да открие само специфичен вид или неколку видови на специфичен вирус. Повторно, калицивирусот на мачки може да се земе како пример, кој има огромен број на многу различни соеви, како и постојано откривање на нови изолати. Затоа, за жал, ПЦР дијагностиката на калицивирусот дава многу лажно негативни резултати.

Мит 2

Приоритетна важност на квантитативна наспроти неквантитативна PCR

Мит 3

Значење на резултатот добиен во „човечката“ лабораторија

Мит 4

Комерцијалните лаборатории не работат со РНК

Мит 5

PCR може и треба да биде евтин

Мит 6

Лабораторијата мора да направи дијагноза

Мит 7

Ако методот на PCR не потврди ниту една од диференцијалните дијагнози, тогаш лабораторијата е лоша

Како заклучок, би сакал да напишам дека, за жал, често добивам впечаток на некаква конфронтација меѓу лекарите и лабораторијата, барем во Русија. Лекарите не им веруваат на лабораториите, лабораториите ги сметаат лекарите за некомпетентни итн. Ми се чини дека не треба да има таква конфронтација: лабораторијата мора секогаш да му помага на лекарот, а за ова лекарот мора да сподели целосни информации со своите вработени. Можам со сигурност да кажам дека нашата лабораторија се обидува да помогне во решавањето на секој проблем што се појавил и секогаш сме подготвени да разговараме за сите неразбирливи моменти и недоразбирања што се случиле.

Полимеразна верижна реакција (PCR) е молекуларна дијагностичка метода која стана „златен стандард“ за многу инфекции, временски тестирана и клинички темелно тестирана. Високата чувствителност и специфичност на методот овозможуваат сигурно откривање на единечни патогени во биолошки материјал врз основа на нивните генетски информации. Аналитичката чувствителност на PCR за повеќето вируси и бактерии е 1000 микроорганизми во 1 ml примерок. Специфичноста на PCR за вирусни, кламидијални, микоплазма и повеќето други бактериски инфекции достигнува 100%.

Методот на PCR беше развиен релативно неодамна, но досега успеа да заземе водечки позиции и во медицинската и во ветеринарната лабораториска дијагностика на заразни и инвазивни болести. Основните принципи на PCR беа откриени во 1983 година од страна на американскиот хемичар Кери Б. Мулис, за што беше награден со Нобеловата награда.

PCR анализата се состои од неколку фази. Првата фаза - подготовка на примерок - се состои во обработка на материјалот за тестирање (подготовка на суспензија, центрифугирање). Во втората фаза, наследниот материјал - ДНК или РНК - се изолира од клетките. Во овој случај, по лиза на клетките и уништување на комплексот "ДНК-протеин", ДНК или РНК се таложи на сорбентот, проследено со нивно пренесување во пуферот за елуција. Во третата фаза се врши засилување, односно множење на бројот на специфични области на ДНК. За ова се користат тест системи, кои вклучуваат прајмери ​​- олигонуклеотиди кои се специфични за секој патоген. Примероците и контролите се додаваат во смесата со PCR истурена во микроцевки, кои се ставаат во термоциклерот или термоциклерот - програмабилен термостат со голема брзина и точност на поставената температура. Процесот на засилување вклучува три фази: денатурација, жарење и издолжување. При откривање на вируси кои содржат РНК во клиничките примероци, на засилувањето му претходи фаза на обратна транскрипција, во која РНК се претвора во форма на ДНК користејќи го ензимот реверзна транскриптаза или обратна транскрипција. Четвртата фаза од дијагностиката на ПЦР е да се спроведе електрофоретско откривање на ПЦР производи - ампликони. Во овој случај, производите на PCR се ставаат во бунарите на гел од агароза и се изложени на постојана електрична струја, како резултат на што негативно наелектризираната молекула на ДНК се движи кон позитивната електрода. Гелот содржи етидиум бромид, кој, формирајќи стабилен комплекс со ДНК, ги прави овие ленти јасно видливи кога се гледаат под ултравиолетово зрачење (сл. 1).

Ориз. 1. Фази на PCR

Треба да се напомене дека за да се добие сигурен резултат од PCR анализата, предуслов е усогласеноста со правилата за избор, складирање и транспорт на клинички материјал. И покрај фактот дека PCR е многу чувствителен метод, пожелно е да се има одредена количина на патоген во примерокот.

Земање материјал за PCR истражувањетреба да се изведува во негазирани ракавици за еднократна употреба (бидејќи талкот ја инхибира PCR). Кога земате гребење и брисеви, треба да користите стерилни сонди за еднократна употреба со зголемена адсорпција (со четка на крајот), бидејќи тие земаат оптимална количина на материјал.

Стружење и испирањеод мукозните мембрани на носот, устата, вагината, конјуктивата се земаат во пластични микроцевки за еднократна употреба - епендорфс - со волумен од 1,5 ml, во кои се истура 0,5 ml стерилен солен раствор. Препорачливо е да не се користат сонди со памучен врв. Исто така, треба да се избегнува кршење на врвот на сондата во физиолошката цевка бидејќи тоа ја комплицира понатамошната обработка и го зголемува ризикот од вкрстена контаминација на примерокот. За да се добие потребната количина материјал, доволно е да се ротира сондата во епрувета 1-2 минути, избегнувајќи прскање на течноста. Примерокот треба да биде заматен по изглед, а при таложење во него треба да се формира мал талог.

Земање крвсе внесува со игла за еднократна употреба во шприц за еднократна употреба или во стаклена цевка без антикоагулант. Кога се вовлекува во шприц, крвта од него внимателно (без формирање на пена) се пренесува во стаклена цевка за еднократна употреба. Можно е да се користат вакуумски системи („Vacuette“) за собирање крв. За истражување, можете да обезбедите крвен серум: епруветите со крв се бранат на собна температура 30 минути додека целосно не се формира згрутчување, потоа се центрифугираат со 3 илјади вртежи во минута за 10 минути и се пренесуваат во количина од најмалку 1 ml во стерилни Eppendorfs. со волумен од 1,5 ml.

Спермасобрани во стерилни епрувети или ампули за еднократна употреба.

Урина.Земете ја првата порција утринска урина во количина од најмалку 20-40 ml во стерилна сува вијала или епрувета.

Измет.Примероците со тежина од 1-3 грама се земаат од претходно дезинфициран и измиен послужавник, се префрлаат во стерилно шише со шпатули за еднократна употреба.

Парчиња од засегнатите органиод мртвите животни се внесуваат во стерилни садови за еднократна употреба или во чисти стаклени или пластични садови.

Треба строго да се почитуваат температурните услови за складирање и транспорт на избраниот материјал. Транспортот се врши во термо контејнер со елементи за ладење или во термос со мраз. Ако материјалот се чува повеќе од еден ден, мора да се замрзне на T минус 20 ° C.

Најчести болести кај мачките и кучињата се конјунктивитис, ринотрахеитис и ентеритис. За да се дознае етиологијата на болеста, потребно е да се спроведе висококвалитетна лабораториска дијагностика.

Конјунктивитис или инфекции на горниот респираторен тракт кај мачките може да бидат предизвикани од инфекција со следниве микроорганизми: херпесвирус тип 1 (FHV1), калицивирус на мачки, кламедијапцитаци. Mycoplasma felis, Bordetella bronchiseptica, Feline reovirus, Staphylococ-cuc aureus, Brohaemolytic streptococic и Salmonella tephimurium.

Најчеста причина, според различни автори и методи на истражување, е вирусот на херпес тип FHY1 (од 10% до 34%) и калицивирусот на мачки (од 20% до 53%). Chlamydia pcittaci (10% до 35%).

Инфекција со херпес вирус, е поврзан со абортус, висока смртност на доенчиња (инфекција во речиси 60% од случаите) со знаци на интерстицијална пневмонија.
Калицивирус - има тежок тек кај мачиња, во исто време, 25-80% од возрасните животни кои се опоравиле стануваат носители и се извор на инфекција, пренесувајќи го вирусот преку плунка.

Панлеукопенија- заразна вирусна болест на мачки, која се карактеризира со остар пад на нивото на леукоцити, гастроентеритис, ринитис со конјунктивитис, висока смртност (30-90% од болните мачиња).

Вистинското зло за расадниците е заразен перитонитис кај мачки- сериозна болест предизвикана од високо патоген вирус кој содржи РНК. Вирусот се реплицира во крајниците и ентероцитите на тенкото црево, расејувајќи се низ телото преку макрофагите и моноцитите. Коронавирусите со ниска вирулентност предизвикуваат умерен ентеритис, најчесто кај мачиња по одвикнување. Вирулентен коронавирус може да доведе до развој на сув или излив на перитонитис. Перитонитисот е често придружен со бубрежна инсуфициенција, хепатални и невролошки симптоми.

Кога е заразен аденовирусии типови и вируси чума на месојадикај кучињата се манифестира општ комплекс на симптоми: треска, конјунктивитис и ринотрахеит, вознемирување на гастроинтестиналниот тракт, оштетување на нервниот систем.

На чума на месојадиклиничките знаци може да вклучуваат мукозен серозен назален и конјунктивален исцедок, кашлица, отежнато дишење, пневмонија, повраќање и дијареа и треска и хиперкератоза.

Аденовирус на месојад... Предизвикувачкиот агенс е аденовирус кој содржи ДНК на месојади од првиот тип (предизвикува заразен хепатитис кај месојадите) и од вториот тип (предизвикува аденовирус кај кучињата). Се забележува треска, апатија, анорексија, жед, повраќање и дијареа, болка на абдоминалниот ѕид при палпација. Понекогаш се развива конјунктивитис, кератитис, фотофобија. Може да има пунктирани хеморагии на мукозната мембрана и кожата. Невролошките нарушувања се ретки.

Сите овие болести имаат висок индекс на заразност и се поврзани со висока смртност кај кученцата, 10-50% од болните кученца умираат од парвовирус ентеритис, а кога невакцинираните кученца се заразени со месојаден вирус на чума, смртноста достигнува 100%.

Токсоплазмоза... Предизвикувачкиот агенс е наједноставниот Toxoplasma gondii. Репродукцијата на патогенот се јавува кај мачките на ѕидовите на цревата. Со измет, тие излачуваат ооцисти во надворешната средина.

Ткивните цисти може да предизвикаат анорексија, депресија, кератитис, жолтица, повраќање, дијареа и невролошки симптоми во зависност од вклучените органи. Кај кучињата, клиничките симптоми зависат од вклучените органи: може да се забележат невролошки нарушувања (тремор, атаксија, парализа) или токсоплазмозен миозитис (нарушување на одењето, мускулна атрофија, ригидност), како и миокардитис и хепатитис.

Кламидија и пситакоза... Патогени кај мачки - Chlamydophila филц, кај кучиња - Chlamydophila abortus, Ch. pecorum, во двата случаи болеста може да биде предизвикана од Ch. пситаци. Кај птиците, Гл. пситаци.
Кај мачките, болеста се манифестира главно во форма на гноен и негноен конјунктивитис и може да се забележи и кератитис, ринитис, пневмонија, вагинитис, абортус и неплодност. Неонатален хламидијален конјунктивитис се јавува кај мачиња. Кај кучињата симптомите се разновидни и се манифестираат со инфламаторни заболувања на конјунктивата, гениталиите, гастритис, артритис, абортус и неплодност. Постојат докази за улогата на кламидија во патогенезата на атеросклероза кај кучињата.

Микоплазмоза... Предизвикувачките агенси се микроорганизми од родот Mycoplasma. Продолжува со знаци на бронхопневмонија, кератоконјуктевитис и кератитис.

Вирусот луцидна имунодефициенција на мачки.Имунодефициенцијата на мачките е сериозна болест предизвикана од вирус од семејството Retrovoridae, родот Lentivirus. Вирусот го напаѓа имунолошкиот и нервниот систем. Има тропизам за Т-лимфоцити. Како резултат на имуносупресија, телото станува беспомошно од бактерии, габи, вируси и умира од секундарна инфекција.
Клиничките знаци се развиваат бавно и болеста е почеста кај мачките на возраст од 6-10 години.

Кај домашните животни се среќаваат и болести како лептоспироза кај кучињата, листериоза на мачки и кучиња, јерсиниоза на кученца, бруцелоза, ротавирус ентеритис, беснило.

Исправноста на PCR анализата и квалитативната изолација на инфекцијата зависи, пред сè, од исправноста на земање на материјалот, а второ, од почитувањето на температурниот режим на складирање и транспортирање на примероците. Примениот примерок во лабораторијата е регистриран, поминува низ сите фази на PCR, се подложува на електрофоретско детектирање со последователно издавање на конечниот резултат.

Така, високата чувствителност и специфичност на методот PCR овозможува сигурно откривање на единечни патогени во биолошки материјал за краток временски период, што овозможува да се постави точна дијагноза, да се пропише соодветен третман и да се развијат превентивни мерки.

НИВ. Доник, дописен член на Руската академија за земјоделски науки, доктор по биолошки науки, професор, Н.А. Пелевин, помлад истражувач, О.Г. Бодрова, помлад истражувач,
Државна научна институција Урал Државен истражувачки ветеринарен институт на RAAS