Sử dụng xét nghiệm combibest trong chẩn đoán HIV. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm HIV hiện đại Video: phim giáo dục của Đại học quốc gia Moscow mang tên

Chủ sở hữu bằng sáng chế RU 2283497:

Sáng chế liên quan đến lĩnh vực công nghệ sinh học và y học. Hệ thống xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme để xác định phổ kháng thể đối với vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) thuộc loại thứ nhất và loại thứ hai, loại thứ nhất của nhóm O và xác định kháng nguyên đối với vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người loại thứ nhất p24 bao gồm một chất hấp thụ miễn dịch dựa trên các kháng nguyên virus gây suy giảm miễn dịch ở người đại diện cho gp41 (env HIV-1 và HIV-2 nhóm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), kháng thể kháng kháng nguyên HIV 1 p24, và thuốc thử phát hiện, các kháng nguyên HIV và kháng thể HIV nêu trên được hấp thụ trong các đĩa khác nhau để xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme và các đĩa polystyrene 96 giếng có thể gập lại hoặc không thể tách rời được sử dụng để hấp phụ. Sáng chế giúp tăng độ nhạy, đơn giản hóa và loại bỏ tính chủ quan trong việc đánh giá kết quả. 1 mức lương tập tin, 10 bảng, 1 hình ảnh.

Sáng chế liên quan đến lĩnh vực công nghệ sinh học và y học. Công dụng: phát hiện phân biệt tất cả các loại kháng thể đặc hiệu đối với protein virus gây suy giảm miễn dịch ở người 1 và 2, kháng nguyên HIV 1 nhóm O và HIV 1 p24.

Bản chất: thu được hệ thống xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme để xác định phổ kháng thể của tất cả các loại đối với từng protein và kháng nguyên HIV 1 và 2, HIV 1 nhóm O và HIV 1 p24 trong huyết thanh (huyết tương), globulin miễn dịch và các sản phẩm máu người trong nhằm xác định phổ kháng thể kháng HIV 1 và 2, HIV 1 nhóm O, phát hiện kháng nguyên HIV 1 p24 và xác nhận kết quả sàng lọc dương tính hoặc nghi vấn đối với kháng thể kháng HIV 1 và 2, kháng nguyên HIV 1 nhóm O và HIV 1 p24.

MÔ TẢ SÁNG CHẾ

Chẩn đoán xét nghiệm nhiễm HIV dựa trên ba lĩnh vực: a) dấu hiệu nhiễm HIV và các thành phần của nó; b) phát hiện kháng thể kháng HIV; c) xác định những thay đổi trong hệ thống miễn dịch. Trong số các phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm hiện có, phổ biến nhất là phương pháp huyết thanh học - phát hiện kháng thể đối với kháng nguyên vi rút.

Để phát hiện kháng thể trong nhiễm HIV, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) và phương pháp thấm miễn dịch (IB) chủ yếu được sử dụng. ELISA dựa trên việc cố định các kháng nguyên virus trên các đĩa mà kháng thể của bệnh nhân liên kết và phức hợp kháng nguyên-kháng thể được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chuột kết hợp peroxidase với peroxidase với globulin miễn dịch G và M của người. Phương pháp này khá đặc hiệu và nhạy cảm, cho phép phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus ở 95% bệnh nhân. 5% trường hợp còn lại xảy ra ở giai đoạn đầu của nhiễm trùng, khi huyết thanh vẫn còn ít kháng thể, hoặc ở giai đoạn cuối của bệnh, khi cơ thể không còn khả năng tổng hợp kháng thể do lượng kháng thể bị suy giảm mạnh. hệ thống miễn dịch. Kết quả ELISA dương tính giả cũng có thể xảy ra, chủ yếu ở những bệnh nhân mắc các bệnh tự miễn và ung thư, cũng như trong các trường hợp nhiễm trùng do vi rút Eshptain-Barr gây ra. Trong trường hợp này, phản ứng chéo của kháng thể với yếu tố dạng thấp, virus Epstein-Barr hoặc với các yếu tố quyết định kháng nguyên tương tự như protein của phức hợp tương hợp mô chính loại 1 và 2 (HLA-4 và DQW3) và có khả năng liên kết với kháng nguyên HIV. xảy ra. Kết quả dương tính giả thường gặp ở phụ nữ mang thai và người già. Tan máu, nhiễm mỡ máu và nhiễm khuẩn trong huyết thanh cũng có thể gây ra kết quả không đáng tin cậy.

Về vấn đề này, một số phương pháp đã được đề xuất và sử dụng để kiểm tra tính đặc hiệu của kết quả phát hiện kháng thể. Trong số các phương pháp này, phản ứng được sử dụng phổ biến nhất là “làm mờ miễn dịch” trong bản sửa đổi “Western Blot”. Bản chất của phương pháp như sau: ở giai đoạn đầu tiên, protein HIV được phân tách theo trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Sau đó, quá trình điện di được thực hiện từ gel polyacrylamide lên bề mặt màng nitrocellulose. Các kháng nguyên được chuyển theo cách này được phát hiện trên màng bằng cách sử dụng phân tích gián tiếp: màng được ủ với vật liệu thử nghiệm; kháng thể chứa trong đó liên kết với kháng nguyên HIV được chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó ủ các dải màng với chất liên hợp; Khi phức hợp kháng nguyên-kháng thể được hình thành, liên hợp sẽ gắn vào nó; sau khi rửa từ liên hợp và ủ với chất nền, sự nhuộm màu xảy ra ở những vùng nitrocellulose nơi xảy ra sự hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể-liên hợp. Hình vẽ cho thấy các ví dụ về kết quả immunoblot dương tính, dương tính yếu và âm tính.

Các kháng thể chống lại các protein (p) và glycoprotein (gp) sau đây được phát hiện trong huyết thanh của người nhiễm HIV-1 và HIV-2: Bảng A.

Bảng B trình bày các tiêu chí để đánh giá kết quả của quá trình miễn dịch được khuyến nghị bởi WHO và Trung tâm Phòng chống và Kiểm soát AIDS của Nga.

Dựa trên tiêu chí của WHO, huyết thanh có kháng thể với bất kỳ hai protein vỏ HIV-1 nào được phát hiện bằng phương pháp IB được coi là dương tính. Nếu xảy ra phản ứng chỉ với một trong các protein vỏ (gp160, gp120, gp41) kết hợp có hoặc không có phản ứng với các protein khác thì kết quả được coi là đáng ngờ. Theo Trung tâm Khoa học và Phương pháp Liên bang của Bộ Y tế Liên bang Nga về Phòng chống và Kiểm soát AIDS, có thể giải thích huyết thanh là dương tính ngay cả khi có kháng thể chỉ với một protein màng.

Việc phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên p24 có thể chỉ ra thời kỳ bắt đầu chuyển đổi huyết thanh, vì kháng thể kháng protein này xuất hiện trước tiên. Phản ứng dương tính với protein gag và pol mà không có phản ứng với protein env có thể phản ánh giai đoạn chuyển đổi huyết thanh sớm và cũng cho thấy sự hiện diện của nhiễm HIV-2 hoặc phản ứng không đặc hiệu.

Việc sử dụng phản ứng immunoblotting như một phương pháp chuyên môn để chẩn đoán HIV có một số nhược điểm đáng kể:

1. Không thể khẳng định việc phát hiện kháng nguyên HIV 1 p24 trong trường hợp sử dụng xét nghiệm phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể kháng HIV, khiến việc sử dụng xét nghiệm sàng lọc để phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể kháng HIV là không phù hợp (vô nghĩa) ( Lệnh của Bộ Y tế Liên bang Nga số 292 ngày 30 tháng 7 năm 2001: “để kiểm tra người hiến máu tại các trạm truyền máu, cần sử dụng hệ thống xét nghiệm phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể kháng HIV”).

2. Chỉ phát hiện kháng thể thuộc lớp IgG. Không thể xác nhận đầy đủ kết quả dương tính thu được bằng xét nghiệm thế hệ thứ 3 và thứ 4 (phát hiện kháng thể IgG và IgM).

3. Tính chủ quan trong việc giải thích đánh giá xét nghiệm, đặc biệt trong các trường hợp có kết quả “nghi ngờ”, “không chắc chắn” và trong giai đoạn đầu của chuyển đổi huyết thanh (các dải được phát hiện trên màng nitrocellulose trong những trường hợp này không rõ ràng, khó có thể nhìn thấy bằng mắt thường, và thường có sự bất đồng khi được đánh giá bởi những người khác nhau).

4. Không thể đánh giá định lượng tự động kết quả phân tích.

5. Độ nhạy thấp hơn so với ELISA.

6. Thời hạn sử dụng ngắn (trong quá trình bảo quản, dải màng nitrocellulose mờ dần và không thể xác nhận khách quan việc phát hiện hay không phát hiện HIV trong các trường hợp còn tranh cãi).

7. Khó khăn trong việc thiết lập phản ứng và bảo quản (dải màng nitrocellulose rất mỏng manh và thường bị đứt).

8. Chi phí cao cho bộ công cụ bảo mật thông tin.

Thuốc thử đã biết là một bộ dụng cụ để xác định đồng thời các kháng nguyên và kháng thể đối với cùng một mầm bệnh, bao gồm cả HIV (DE 4236189 F1, 28/04/1994). Tuy nhiên, hệ thống xét nghiệm cho phép chẩn đoán nhiễm HIV ở các giai đoạn khác nhau vẫn chưa được tiết lộ.

Mục tiêu của sáng chế là tạo ra một hệ thống xét nghiệm có thể xác nhận các kết quả dương tính hoặc nghi vấn của các xét nghiệm sàng lọc kháng thể kháng HIV 1 và 2, kháng nguyên HIV 1 nhóm O và HIV 1 p24 khi sử dụng các xét nghiệm để phát hiện đồng thời. của kháng nguyên và kháng thể.

Giải pháp kỹ thuật đề xuất đạt được bằng hệ thống xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme để xác định phổ kháng thể đối với vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) thuộc loại thứ nhất và loại thứ hai, loại thứ nhất của nhóm O và xác định kháng nguyên p24 đối với bệnh suy giảm miễn dịch ở người vi-rút loại p24 đầu tiên, đặc trưng ở chỗ nó bao gồm chất hấp thụ miễn dịch dựa trên kháng nguyên vi-rút gây suy giảm miễn dịch ở người, đại diện cho gp41 (env HIV-1 và HIV-2 nhóm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), kháng thể kháng kháng nguyên HIV 1 p24 và thuốc thử phát hiện, trong khi các kháng nguyên HIV và kháng thể HIV nêu trên được hấp phụ trong các giếng khác nhau của các đĩa xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme.

Ngoài ra, các đĩa polystyrene 96 giếng có thể gập lại hoặc không thể tháo rời để xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng để hấp phụ.

Kết quả kỹ thuật mà sáng chế đạt được là khả năng xác nhận kết quả dương tính đối với kháng thể kháng HIV 1 và 2, kháng nguyên HIV 1 nhóm O và HIV 1 p24, độ nhạy cao, khả năng giải thích kết quả tự động, loại bỏ tính chủ quan của kết quả. đánh giá, dễ dàng thực hiện kiểm tra, ít hơn so với các bộ bảo mật thông tin chi phí hiện có.

Giải pháp kỹ thuật này khác với những giải pháp đã biết:

1. Sử dụng tấm phản ứng miễn dịch làm chất mang pha rắn.

2. Sử dụng đồng thời kháng thể kháng HIV p 24 và bộ kháng nguyên HIV làm chất hấp phụ.

Sáng chế được minh họa bằng ví dụ sau.

Các nguyên tắc hoạt động của hệ thống xét nghiệm được phát triển "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" là:

Chất hấp thụ miễn dịch - kháng nguyên tái tổ hợp tương tự protein cấu trúc của HIV-1: gp41 (env HIV-1 và HIV 1 nhóm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) và kháng thể đơn dòng của chuột chống lại kháng nguyên HIV 1(p24), được hấp phụ riêng biệt trên các dải của tấm polystyrene có thể gập lại được.

Để chuẩn bị sử dụng chất hấp thụ miễn dịch:

1. HIV-1 gp41 là protein được sản xuất bởi chủng E. Coli số AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 là protein được sản xuất bởi chủng E. Coli số AHIV 109.

3. HIV-1 p24 là protein được sản xuất bởi chủng E. Coli số AHIV 105.

4. HIV-1 p31 là protein được sản xuất bởi chủng E. Coli số AHIV 108.

5. HIV-2 p36 là protein được sản xuất bởi chủng E. Coli số AHIV 106.

Liên hợp 1, đông khô hoặc lỏng, là kháng thể đơn dòng của chuột chống lại kháng nguyên HIV1 p24 kết hợp với biotin.

1. Liên hợp 2, dạng đông khô hoặc dạng lỏng, là hỗn hợp các kháng nguyên tái tổ hợp tương tự các protein cấu trúc của HIV-1: gp41 (env HIV-1 và HIV 1 nhóm O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), liên hợp với biotin;

2. Liên hợp 3, 4 - đông khô hoặc lỏng - streptavidin, được dán nhãn peroxidase cải ngựa;

Trong quá trình nghiên cứu sơ bộ, thiết kế của hệ thống thử nghiệm đã được chọn, công nghệ điều chế các thành phần của nó đã được phát triển và các điều kiện tiến hành phản ứng xét nghiệm miễn dịch enzyme đã được tối ưu hóa.

Khi thực hiện ELISA trong hệ thống xét nghiệm "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1", 25 μl liên hợp-1 được thêm vào các giếng của đĩa có kháng thể đã hấp phụ với p24 và 25 μl của liên hợp-1 được thêm vào các giếng có kháng nguyên đã hấp thụ. 25 µl liên hợp-2. Sơ đồ phản ứng được hiển thị dưới đây. Tiếp theo, 25 μl mẫu thử được thêm vào từng giếng. Đồng thời, trong giếng có kháng nguyên, màu sắc thay đổi từ cam sang hồng và trong giếng có kháng thể - từ xanh sang xám. Hỗn hợp này được ủ trong 45 phút ở 37°C trên máy lắc (hoặc 1 giờ ở 37°C trong máy điều nhiệt). Sau đó, không cần rửa, thêm 50 μl liên hợp-3 vào các giếng của đĩa để xác định kháng nguyên p24 và 50 μl liên hợp-4 vào các giếng để xác định kháng thể. Sau khi ủ trong 20 phút ở 37°C trên máy lắc (hoặc 30 phút ở 37°C trong bộ điều nhiệt), đĩa được rửa sạch và phát triển bằng hỗn hợp cơ chất. Tổng thời gian phản ứng 1 giờ 25 phút (hoặc 1 giờ 50 phút). Kháng nguyên p24 có trong mẫu xét nghiệm liên kết với kháng thể đơn dòng với p24 và các kháng thể đặc hiệu tạo thành phức hợp với các kháng nguyên tái tổ hợp trên đĩa. Phức hợp miễn dịch thu được của kháng p24 với p24 được phát hiện cùng với liên hợp kháng p24-biotin, sau đó với streptavidin-peroxidase, và phức hợp miễn dịch Ag-HIV với At-HIV được phát hiện với liên hợp Ag-biotin, sau đó với streptavidin- peroxidaza.

Sơ đồ thiết lập phản ứng.

Các kết quả được tính toán bằng phương pháp đo quang phổ ở hai bước sóng: 450/620-680 nm với thiết bị được cấu hình “bằng đường hàng không”. Chúng ta hãy tính đến kết quả ở bước sóng 450 nm.

Kết quả phân tích được tính đến nếu giá trị trung bình của mật độ quang (OD) trong giếng có K- không quá 0,2, trong giếng có K+ - không nhỏ hơn 1,0. OP phê bình. được tính theo công thức:

OP phê bình. gp41 = trung bình nghĩa OP K-(gp41)+0,15

OP phê bình. gp120 = trung bình nghĩa OP K-(gp120)+0,15

OP phê bình. p24 = trung bình nghĩa OP K-(р24)+0,15

OP phê bình. p31 = trung bình nghĩa OP K-(р31)+0,15

OP phê bình. gp36 = trung bình nghĩa OP K-(gp36)+0,15

OP phê bình. Ag p24 = trung bình nghĩa OP k- (Ag p24)+0,04

trong đó 0,15 và 0,04 là các hệ số được thiết lập bằng quá trình xử lý thống kê tại nhà sản xuất. Trong quá trình phát triển hệ thống thử nghiệm, những điều sau đây đã được sử dụng:

1. Mẫu huyết thanh từ người hiến khỏe mạnh (n=610).

2. Mẫu huyết thanh của bệnh nhân mắc các bệnh truyền nhiễm khác nhau không liên quan đến HIV (nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính, viêm phổi, viêm amidan, nhiễm Herpetic và cytomegalovirus, giang mai, chlamydia, viêm gan siêu vi A, B và C (n=224)).

3. Mẫu huyết thanh của bệnh nhân mắc các bệnh không nhiễm trùng khác nhau - chấn thương, bệnh về hệ tim mạch, ung thư (n=35).

4. Mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai (n=40).

5. Mẫu huyết thanh có huyết thanh dương tính trong ELISA và được xác nhận bằng immunoblot (n=428).

6. Các mẫu huyết thanh có kết quả dương tính thu được trong hệ thống xét nghiệm miễn dịch enzyme để xác định đồng thời kháng thể HIV 1.2 và kháng nguyên p24 và kết quả không xác định bằng phương pháp immunoblot (n=123).

7. Bảng bên trong của huyết thanh chứa và không chứa kháng thể kháng HIV 1,2, được thử nghiệm trên hệ thống xét nghiệm miễn dịch enzyme và immunoblot được Bộ Y tế Liên bang Nga đăng ký (n=21).

8. Tiêu chuẩn “Tiêu chuẩn kháng nguyên HIV 1”, “BIO RAD”, Pháp, cat. Số 72217, là một kháng nguyên thu được từ dịch ly giải của virus.

9. Tiêu chuẩn nội bộ của doanh nghiệp. Một mẫu chứa kháng nguyên p 24 ở nồng độ 200 pg/ml, thu được từ dịch ly giải của virus và được chuẩn độ theo tiêu chuẩn "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" của công ty "BIO RAD", Pháp, cat. Số 72217.

10. Bảng huyết thanh chuẩn chứa kháng thể kháng vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người loại 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, "Medical and Students Union", Novosibirsk.

11. Bảng huyết thanh chuẩn chứa kháng thể kháng vi-rút gây suy giảm miễn dịch ở người loại 2 (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, "Liên minh Y tế và Sinh học", Novosibirsk.

12. Bảng huyết thanh tiêu chuẩn không chứa kháng thể chống vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người loại 1 và 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, "Liên minh y tế và sinh học", Novosibirsk.

Độ nhạy của hệ thống xét nghiệm để phát hiện kháng nguyên p24 được đánh giá bằng cách sử dụng “Tiêu chuẩn kháng nguyên HIV I”, “BIO RAD” và Tiêu chuẩn nội bộ của doanh nghiệp. Sử dụng Chất chuẩn Nội, 4 dung dịch pha loãng 2 lần nối tiếp từ 40 pg/ml đến 5 pg/ml đã được chuẩn bị bằng huyết tương của người hiến tặng bình thường, không chứa kháng thể HIV 1, 2, làm chất pha loãng. Lượng kháng nguyên nhỏ nhất có thể phát hiện được được lấy làm tiêu chí độ nhạy. Dữ liệu thu được được trình bày trong Bảng 1.

Để đánh giá độ nhạy của hệ thống xét nghiệm trong việc phát hiện các kháng thể cụ thể, các nhóm mẫu chuẩn chứa kháng thể chống vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV 1, 2) đã được sử dụng (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42- 28-216-02P (HIV 2) tr.003).

Số liệu thu được được trình bày ở bảng 3, 4.

Hiệu quả chẩn đoán của hệ thống xét nghiệm "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" được so sánh với các hệ thống xét nghiệm "Jenskrin-HIV-Ag/At" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1 /2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Tái tổ hợp-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard ), "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Vì mục đích này, các mẫu huyết thanh từ bảng bên trong đã được kiểm tra trong tất cả các xét nghiệm được chỉ định. Kết quả trình bày ở Bảng 5 cho thấy hiệu quả chẩn đoán cao của “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”.

Các nghiên cứu về độ nhạy của hệ thống xét nghiệm "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" cũng được thực hiện với huyết thanh của bệnh nhân được xác nhận dương tính với HIV bằng phương pháp thấm miễn dịch. Tổng cộng có 428 mẫu huyết thanh như vậy đã được thử nghiệm. Đã có một số lựa chọn để phát hiện kháng thể đối với các protein HIV khác nhau và kháng nguyên p24. Kết quả được trình bày ở Bảng 6.

Khi xét nghiệm mẫu dương tính với HIV 1, 3% huyết thanh cho thấy phản ứng dương tính với gp36 (HIV 2 env). OP/OPcrit. trong các mẫu này không vượt quá 2,0. Dữ liệu của chúng tôi về khả năng phản ứng chéo của các protein vỏ ngoài của HIV 1 (gp41) và HIV 2 (gp36) trùng khớp với dữ liệu tài liệu.

Giải thích kết quả

Phân tích xét nghiệm huyết thanh dương tính với HIV và các mẫu từ bảng tiêu chuẩn và bảng bên trong trong "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" cho phép chúng tôi phát triển các tiêu chí để diễn giải kết quả của xét nghiệm này. Tiêu chí khuyến nghị được đưa ra trong Bảng 7.

Dựa trên các tiêu chí này, tất cả các mẫu huyết thanh dương tính với HIV (n=428) được xác định là dương tính với “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1”. Trong số 16 mẫu của nhóm tiêu chuẩn chứa kháng thể kháng HIV 1, 14 mẫu được xác định là dương tính và 2 mẫu được xác định là không xác định. Tất cả 8 mẫu từ bảng tiêu chuẩn chứa kháng thể kháng HIV 2 đều được xác định là dương tính. Trong số 10 mẫu của bảng bên trong chứa kháng thể kháng HIV 1, 7 mẫu được xác định là dương tính và 3 mẫu được xác định là không xác định.

Các nghiên cứu về độ nhạy của hệ thống xét nghiệm "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" cũng được thực hiện với huyết thanh của những bệnh nhân có kết quả dương tính trong hệ thống xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme phát hiện đồng thời kháng thể và kháng nguyên p24 và không xác định trong immunoblot. Tổng cộng có 123 mẫu như vậy đã được thử nghiệm. Dữ liệu được trình bày trong Bảng 8.

Khi xét nghiệm huyết thanh có kết quả immunoblot không xác định (n=123) trong “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”, 72 mẫu (58,5%) cho kết quả dương tính. Trong số này, 26 huyết thanh (21,1%) chỉ dương tính với p24, 20 (16,3%) - chỉ với kháng thể, 16 (13%) - đối với p24 có kháng thể với một trong các protein, 10 (8,1%) - trên p24 với kháng thể đối với hai hoặc nhiều protein. Do đó, chỉ xét nghiệm kháng thể (không phát hiện p24) sẽ xác định được 30 mẫu (24,4%) là dương tính. Việc phát hiện kháng nguyên p24 trong xét nghiệm cho phép thêm 42 mẫu (34,1%) được xác định là dương tính.

Để đánh giá tính đặc hiệu của hệ thống xét nghiệm, một nhóm huyết thanh chuẩn không chứa kháng thể kháng HIV 1, 2 (n=20) đã được sử dụng; mẫu huyết thanh từ người hiến khỏe mạnh (n=610), mẫu huyết thanh từ bệnh nhân mắc các bệnh truyền nhiễm khác nhau (n=224) không liên quan đến HIV; mẫu huyết thanh của bệnh nhân mắc các bệnh không nhiễm trùng khác nhau - chấn thương, bệnh về hệ tim mạch, ung thư (n=35); mẫu huyết thanh của phụ nữ mang thai (n=40). Tổng cộng có 929 mẫu đã được thử nghiệm. Một mẫu từ huyết thanh của những người hiến tặng khỏe mạnh cho kết quả dương tính giả - đã phát hiện thấy kháng thể kháng gp41 và p24. 7 mẫu huyết thanh từ người hiến khỏe mạnh và 2 mẫu huyết thanh từ bệnh nhân mắc bệnh truyền nhiễm không liên quan đến HIV cho kết quả dương tính giả với p24.

Để đánh giá tính đặc hiệu của hệ thống xét nghiệm, một nhóm mẫu âm tính tiêu chuẩn đã được sử dụng (OSO 42-28-214-94-02p, tr. 009). Độ đặc hiệu là 100%.

Như vậy, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng độ đặc hiệu của hệ thống xét nghiệm “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” là 99% khi kiểm tra mẫu huyết thanh từ người hiến tặng bình thường và bệnh nhân mắc các bệnh truyền nhiễm và bệnh soma khác nhau .

Dữ liệu thu được cho thấy hiệu quả chẩn đoán cao của hệ thống xét nghiệm được phát triển "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1". Hệ thống xét nghiệm có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể đối với từng protein của HIV loại 1 và 2 và kháng nguyên HIV1 p24 để xác nhận kết quả sàng lọc dương tính bằng hệ thống xét nghiệm phát hiện kháng thể hoặc hệ thống xét nghiệm phát hiện đồng thời kháng thể và kháng nguyên HIV1 p24. Hệ thống xét nghiệm có thể được sử dụng thay thế cho xét nghiệm immunoblot để xác nhận kết quả dương tính, cũng như nghiên cứu hoạt động của kháng thể HIV và kháng nguyên p24 ở các giai đoạn lây nhiễm khác nhau.

ƯU ĐIỂM CỦA KIỂM TRA

1. Xét nghiệm miễn dịch enzyme khẳng định ở dạng viên

2. Xét nghiệm khẳng định kết hợp xác định phổ kháng thể HIV 1, 2 và kháng nguyên HIV 1 p24

3. Phát hiện kháng thể tất cả các lớp Ig

4. Độ nhạy phát hiện p24 tối thiểu là 5 pg/ml

5. Giảm kết quả không xác định so với phương pháp miễn dịch

6. Thời gian phân tích - 1 giờ 25 phút (immunoblot - từ 3 đến 20 giờ)

7. Đánh giá trực quan việc bổ sung tất cả các thành phần và mẫu.

1. Hệ thống xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme để xác định phổ kháng thể đối với vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) thuộc loại thứ nhất và thứ hai, loại thứ nhất thuộc nhóm O và xác định kháng nguyên p24 đối với vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người loại thứ nhất p24, đặc trưng ở chỗ nó bao gồm một chất hấp thụ miễn dịch dựa trên kháng nguyên virus gây suy giảm miễn dịch ở người, đại diện cho gp41 (env HIV-1 và HIV-2 nhóm O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV -2), kháng thể kháng kháng nguyên HIV 1 p24, và thuốc thử phát hiện, trong khi kháng nguyên HIV và kháng thể HIV nêu trên được hấp thụ trong các giếng khác nhau của đĩa để xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme.

2. Hệ thống xét nghiệm miễn dịch enzyme theo điểm 1, đặc trưng ở chỗ các tấm polystyrene 96 giếng có thể gập lại hoặc không thể tách rời dùng cho xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng để hấp phụ.

Chẩn đoán kịp thời nhiễm HIV trở thành một biện pháp cực kỳ quan trọng, vì việc bắt đầu điều trị sớm có thể quyết định phần lớn sự phát triển tiếp theo của bệnh và kéo dài sự sống của bệnh nhân. Trong những năm gần đây, đã có những tiến bộ đáng kể trong việc xác định căn bệnh khủng khiếp này: các hệ thống xét nghiệm cũ đang được thay thế bằng những hệ thống tiên tiến hơn, các phương pháp kiểm tra ngày càng dễ tiếp cận hơn và độ chính xác của chúng ngày càng tăng lên đáng kể.

Trong bài viết này, chúng tôi sẽ nói về các phương pháp hiện đại để chẩn đoán nhiễm HIV, những kiến ​​thức về phương pháp này rất hữu ích để điều trị kịp thời vấn đề này và duy trì chất lượng cuộc sống bình thường cho bệnh nhân.

Phương pháp chẩn đoán HIV

Ở Nga, một quy trình chuẩn được thực hiện để chẩn đoán nhiễm HIV, bao gồm hai cấp độ:

• Hệ thống xét nghiệm ELISA (phân tích sàng lọc);
• quá trình miễn dịch (IB).

Các phương pháp khác cũng có thể được sử dụng để chẩn đoán:

• các xét nghiệm nhanh chóng.

Hệ thống xét nghiệm ELISA

Ở giai đoạn chẩn đoán đầu tiên, xét nghiệm sàng lọc (ELISA) được sử dụng để phát hiện nhiễm HIV, xét nghiệm này dựa trên các protein HIV được tạo ra trong phòng thí nghiệm để thu thập các kháng thể cụ thể được tạo ra trong cơ thể để đáp ứng với nhiễm trùng. Sau khi chúng tương tác với thuốc thử (enzim) của hệ thống xét nghiệm, màu của chất chỉ thị sẽ thay đổi. Tiếp theo, những thay đổi màu sắc này được xử lý bằng thiết bị đặc biệt, thiết bị này xác định kết quả phân tích được thực hiện.

Các xét nghiệm ELISA như vậy có thể cho kết quả trong vòng vài tuần sau khi nhiễm HIV. Xét nghiệm này không xác định sự hiện diện của virus nhưng phát hiện việc sản xuất kháng thể chống lại nó. Đôi khi, trong cơ thể con người, việc sản xuất kháng thể kháng HIV bắt đầu sau 2 tuần sau khi nhiễm bệnh, nhưng ở hầu hết mọi người, chúng được sản xuất muộn hơn, sau 3-6 tuần.

Có bốn thế hệ xét nghiệm ELISA với độ nhạy khác nhau. Trong những năm gần đây, các hệ thống xét nghiệm thế hệ thứ ba và thứ tư ngày càng được sử dụng nhiều hơn, dựa trên các peptide tổng hợp hoặc protein tái tổ hợp và có độ đặc hiệu và độ chính xác cao hơn. Chúng có thể được sử dụng để chẩn đoán nhiễm HIV, theo dõi tỷ lệ nhiễm HIV và đảm bảo an toàn khi xét nghiệm máu hiến tặng. Độ chính xác của hệ thống xét nghiệm ELISA thế hệ III và IV là 93-99% (các xét nghiệm được sản xuất ở Tây Âu nhạy hơn - 99%).

Để thực hiện xét nghiệm ELISA, 5 ml máu được lấy từ tĩnh mạch của bệnh nhân. Ít nhất 8 giờ phải trôi qua giữa bữa ăn cuối cùng và phân tích (thường được thực hiện vào buổi sáng khi bụng đói). Nên thực hiện xét nghiệm như vậy không sớm hơn 3 tuần sau khi nghi ngờ nhiễm trùng (ví dụ: sau khi quan hệ tình dục không được bảo vệ với bạn tình mới).

Kết quả xét nghiệm ELISA có được sau 2-10 ngày:

• kết quả âm tính: cho thấy không nhiễm HIV và không cần liên hệ với bác sĩ chuyên khoa;
• kết quả âm tính giả: có thể được quan sát thấy ở giai đoạn đầu của nhiễm trùng (tối đa 3 tuần), trong giai đoạn sau của AIDS với sự ức chế nghiêm trọng của hệ thống miễn dịch và chuẩn bị máu không đúng cách;
• kết quả dương tính giả: có thể được quan sát thấy ở một số bệnh và trong trường hợp chuẩn bị máu không đúng cách;
• kết quả dương tính: cho thấy nhiễm HIV, yêu cầu thực hiện IB và bệnh nhân liên hệ với bác sĩ chuyên khoa tại trung tâm AIDS.

Tại sao xét nghiệm ELISA có thể cho kết quả dương tính giả?

Kết quả xét nghiệm ELISA HIV dương tính giả có thể xảy ra do xử lý máu không đúng cách hoặc ở những bệnh nhân mắc các bệnh và tình trạng sau:

• bệnh đa u tủy;
• các bệnh truyền nhiễm do virus Epstein-Barr gây ra;
• trạng thái sau ;
• bệnh tự miễn;
• trong bối cảnh mang thai;
• tình trạng sau tiêm chủng.

Vì những lý do được mô tả ở trên, các kháng thể phản ứng chéo không đặc hiệu có thể có trong máu, việc sản xuất kháng thể này không phải do nhiễm HIV.

Trong những năm gần đây, tần suất kết quả dương tính giả đã giảm đáng kể do sử dụng hệ thống xét nghiệm thế hệ III và IV, chứa các protein tái tổ hợp và peptide nhạy hơn (chúng được tổng hợp bằng kỹ thuật di truyền trong ống nghiệm). Sau khi áp dụng các xét nghiệm ELISA như vậy, tần suất kết quả dương tính giả giảm đáng kể và còn khoảng 0,02-0,5%.

Kết quả dương tính giả không có nghĩa là người đó bị nhiễm HIV. Trong những trường hợp như vậy, WHO khuyến nghị tiến hành xét nghiệm ELISA khác (nhất thiết phải là thế hệ IV).

Máu của bệnh nhân được gửi đến phòng thí nghiệm tham chiếu hoặc phân xử có đánh dấu “lặp lại” và được xét nghiệm bằng hệ thống xét nghiệm ELISA thế hệ IV. Nếu kết quả phân tích mới là âm tính thì kết quả đầu tiên được coi là sai (dương tính giả) và IS không được thực hiện. Nếu kết quả dương tính hoặc có nghi vấn trong lần xét nghiệm thứ hai, bệnh nhân phải trải qua IB sau 4-6 tuần để xác nhận hoặc bác bỏ nhiễm HIV.

Làm mờ miễn dịch

Chẩn đoán xác định nhiễm HIV chỉ có thể được thực hiện sau khi có kết quả xét nghiệm miễn dịch dương tính (IB). Để thực hiện điều này, người ta sử dụng một dải nitrocellulose, trên đó dán các protein virus.

Lấy mẫu máu cho IB được thực hiện từ tĩnh mạch. Tiếp theo, nó trải qua quá trình xử lý đặc biệt và các protein có trong huyết thanh của nó được tách ra trong một loại gel đặc biệt theo điện tích và trọng lượng phân tử của chúng (thao tác được thực hiện bằng thiết bị đặc biệt dưới tác động của điện trường). Một dải nitrocellulose được áp dụng cho gel huyết thanh và quá trình làm mờ (“làm mờ”) được thực hiện trong một buồng đặc biệt. Dải này được xử lý và nếu vật liệu được sử dụng có chứa kháng thể kháng HIV, chúng sẽ liên kết với các dải kháng nguyên trên IB và xuất hiện dưới dạng vạch.

IB được coi là tích cực nếu:

• theo tiêu chí CDC của Mỹ - có hai hoặc ba dòng gp41, p24, gp120/gp160 trên dải;
• theo tiêu chí của FDA Hoa Kỳ, dải có hai dòng p24, p31 và một dòng gp41 hoặc gp120/gp160.

Trong 99,9% trường hợp, kết quả IB dương tính cho thấy nhiễm HIV.

Nếu không có dòng nào thì IB âm.

Khi xác định các dòng có gr160, gr120 và gr41 thì IB còn nghi ngờ. Kết quả này có thể xảy ra khi:

• bệnh ung thư;
• thai kỳ;
• truyền máu thường xuyên.

Trong những trường hợp như vậy, nên lặp lại nghiên cứu bằng cách sử dụng bộ sản phẩm của công ty khác. Nếu sau khi bổ sung IB mà kết quả vẫn còn nghi ngờ thì cần phải quan sát trong sáu tháng (IB được thực hiện 3 tháng một lần).

Phản ứng chuỗi polymerase

Xét nghiệm PCR có thể phát hiện RNA của virus. Độ nhạy của nó khá cao và cho phép phát hiện nhiễm HIV trong vòng 10 ngày sau khi nhiễm bệnh. Trong một số trường hợp, PCR có thể cho kết quả dương tính giả vì độ nhạy cao của nó cũng có thể đáp ứng với kháng thể chống lại các bệnh nhiễm trùng khác.

Kỹ thuật chẩn đoán này đắt tiền và đòi hỏi thiết bị đặc biệt và các chuyên gia có trình độ cao. Những lý do này không thể thực hiện được việc xét nghiệm hàng loạt trên dân số.

PCR được sử dụng trong các trường hợp sau:

• phát hiện HIV ở trẻ sơ sinh sinh ra từ mẹ nhiễm HIV;
• để phát hiện HIV trong “giai đoạn cửa sổ” hoặc trong trường hợp nghi ngờ IB;
• kiểm soát nồng độ HIV trong máu;
• để nghiên cứu máu của người hiến tặng.

Chỉ xét nghiệm PCR không giúp chẩn đoán HIV mà được thực hiện như một phương pháp chẩn đoán bổ sung để giải quyết các tình huống gây tranh cãi.

Phương thức thể hiện

Một trong những đổi mới trong chẩn đoán HIV là xét nghiệm nhanh, kết quả có thể được đánh giá trong vòng 10-15 phút. Các kết quả hiệu quả và chính xác nhất thu được bằng cách sử dụng các xét nghiệm sắc ký miễn dịch dựa trên nguyên tắc dòng mao quản. Chúng là những dải đặc biệt để dán máu hoặc các chất dịch xét nghiệm khác (nước bọt, nước tiểu). Nếu có kháng thể kháng HIV, sau 10-15 phút, que thử sẽ xuất hiện dải màu và dải đối chứng - kết quả dương tính. Nếu kết quả là âm tính thì chỉ có dải chứng xuất hiện.

Giống như xét nghiệm ELISA, kết quả xét nghiệm nhanh phải được xác nhận bằng phân tích IB. Chỉ sau đó mới có thể chẩn đoán nhiễm HIV.

Có sẵn bộ dụng cụ xét nghiệm nhanh tại nhà. Xét nghiệm OraSure Technologies1 (Hoa Kỳ) đã được FDA phê duyệt, được bán không cần kê đơn và có thể được sử dụng để phát hiện HIV. Sau khi xét nghiệm, nếu kết quả dương tính, bệnh nhân được khuyến cáo đi khám tại trung tâm chuyên khoa để xác nhận chẩn đoán.

Các thử nghiệm khác để sử dụng tại nhà vẫn chưa được FDA chấp thuận và kết quả của chúng có thể rất đáng nghi ngờ.

Mặc dù thực tế là các xét nghiệm nhanh có độ chính xác kém hơn so với xét nghiệm ELISA thế hệ IV, nhưng chúng vẫn được sử dụng rộng rãi để xét nghiệm bổ sung cho dân số.

Bạn có thể làm xét nghiệm phát hiện nhiễm HIV tại bất kỳ phòng khám, bệnh viện trung ương huyện hoặc trung tâm chuyên khoa AIDS nào. Trên lãnh thổ Nga, chúng được thực hiện hoàn toàn bí mật hoặc ẩn danh. Mỗi bệnh nhân có thể mong đợi nhận được tư vấn y tế hoặc tâm lý trước hoặc sau khi xét nghiệm. Bạn sẽ chỉ phải trả tiền xét nghiệm HIV tại các cơ sở y tế thương mại, trong khi tại các phòng khám và bệnh viện công, việc xét nghiệm này được thực hiện miễn phí.

Đọc về những con đường mà bạn có thể bị nhiễm HIV và những lầm tưởng tồn tại về khả năng bị nhiễm HIV.

Sự miêu tả

Sự chuẩn bị

chỉ định

Giải thích kết quả

Sự miêu tả

Phương pháp xác định Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA).

Tài liệu đang nghiên cứu Huyết thanh

Có thể đến thăm nhà

Phát hiện kết hợp kháng thể kháng HIV týp 1, 2 và kháng nguyên HIV p24, xét nghiệm định tính.

Chú ý. Trong trường hợp có phản ứng tích cực và nghi vấn, thời gian công bố kết quả có thể kéo dài đến 10 ngày làm việc. HIV (vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người), gây ra bệnh AIDS (hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải), thuộc họ retrovirus. Nó lây truyền từ người này sang người khác thông qua việc sử dụng kim tiêm và ống tiêm bị ô nhiễm để tiêm thuốc vào tĩnh mạch hoặc các thủ tục điều trị, trong khi quan hệ tình dục, cả tình dục khác giới và đồng tính luyến ái. Sự lây truyền vi-rút có thể xảy ra thông qua truyền máu bị nhiễm bệnh và các sản phẩm của nó, hiến nội tạng hoặc tinh dịch và giữa các nhân viên y tế - do bị thương do kim hoặc dụng cụ bị ô nhiễm. Nhiễm HIV có thể xảy ra thông qua lây truyền từ mẹ bị nhiễm sang con (theo đường dọc), mặc dù các phương pháp phòng ngừa hiện đại bằng liệu pháp kháng vi-rút, nếu tuân thủ tất cả các khuyến nghị, có thể giảm nguy cơ này đến mức tối thiểu.

Quá trình tương tác của virus với tế bào bao gồm một số giai đoạn: gắn virus vào tế bào, giải phóng nó ra khỏi vỏ, xâm nhập vào tế bào chất, tổng hợp DNA bằng RNA virus, tích hợp DNA virus vào bộ gen của tế bào. tế bào chủ. Sau đó, giai đoạn nhiễm trùng tiềm ẩn bắt đầu. Ở trạng thái này, DNA tiền virus có thể tồn tại một thời gian mà không thể hiện hoạt động và không ảnh hưởng đến đời sống của tế bào chủ. Mặc dù không có biểu hiện của protein vi rút nhưng không có phản ứng miễn dịch đối với vi rút. Các kháng thể chống lại HIV, đặc trưng cho phản ứng miễn dịch của cơ thể, xuất hiện sau khi DNA của virus được kích hoạt và virus bắt đầu sinh sản tích cực. Thời gian của giai đoạn tiềm ẩn phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm cả đặc điểm di truyền của từng sinh vật.

Kháng thể kháng HIV có thể xuất hiện bắt đầu từ tuần thứ hai sau khi nhiễm bệnh; hàm lượng của chúng tăng lên trong vòng 2-4 tuần và duy trì trong nhiều năm. Ở 90-95% số người nhiễm bệnh, chúng xuất hiện trong ba tháng đầu tiên sau khi nhiễm bệnh, ở 5-9% - trong khoảng thời gian từ ba đến sáu tháng, ở 0,5-1% - vào một ngày sau đó.

Trong những tuần đầu tiên bị nhiễm bệnh, ngay cả trước khi xuất hiện kháng thể chống lại vi rút (tức là trước khi chuyển đổi huyết thanh), sự hiện diện của kháng nguyên HIV, bao gồm cả protein p24capsid của nó, có thể được phát hiện trong các mẫu huyết thanh hoặc huyết tương. Sau đó, sau khi chuyển đổi huyết thanh, nó thường không thể phát hiện được.

Hệ thống xét nghiệm kết hợp thế hệ thứ 4, bao gồm xét nghiệm HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), phát hiện cả kháng thể kháng HIV loại 1 và 2 và kháng nguyên HIV p24, cho phép phát hiện sớm tình trạng nhiễm trùng. Điểm đặc biệt của xét nghiệm sàng lọc được sử dụng trong phòng thí nghiệm INVITRO để phát hiện nhiễm HIV bao gồm độ đặc hiệu cao của nghiên cứu (> 99,5%); Xét nghiệm có độ nhạy 100% với kháng thể đặc trưng của thời kỳ chuyển đổi huyết thanh và độ nhạy của xét nghiệm với kháng nguyên p24 là khoảng 18 pg/ml.

Quy trình tiến hành xét nghiệm HIV trong phòng thí nghiệm được quy định chặt chẽ theo lệnh của Bộ Y tế Liên bang Nga và bao gồm giai đoạn nghiên cứu sàng lọc (chọn lọc) về sự hiện diện của kháng thể kháng HIV bằng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) các phương pháp được phê duyệt để sử dụng và giai đoạn nghiên cứu xác minh (xác nhận) chi tiết hơn trong phòng thí nghiệm của trung tâm AIDS thành phố. Cần lưu ý rằng ngay cả các hệ thống ELISA sàng lọc tốt nhất cũng không đảm bảo độ đặc hiệu 100%, nghĩa là có một số khả năng thu được kết quả dương tính giả, không đặc hiệu liên quan đến đặc điểm huyết thanh của bệnh nhân. Do đó, kết quả dương tính của xét nghiệm ELISA sàng lọc có thể không được xác nhận trong các xét nghiệm xác nhận, sau đó bệnh nhân sẽ nhận được kết quả âm tính hoặc không xác định được. Nếu kết quả của nghiên cứu xác nhận là không chắc chắn, xét nghiệm nên được lặp lại theo thời gian sau 2-3 tuần.

Chẩn đoán xét nghiệm nhiễm HIV ở trẻ sinh ra từ mẹ nhiễm HIV có những đặc điểm riêng. Kháng thể kháng HIV của mẹ (lớp IgG) có thể lưu hành trong máu của trẻ tới 18 tháng kể từ thời điểm sinh. Việc không có kháng thể kháng HIV ở trẻ sơ sinh không có nghĩa là virus chưa xâm nhập được hàng rào nhau thai. Con của bà mẹ nhiễm HIV phải được xét nghiệm chẩn đoán trong vòng 36 tháng sau khi sinh.

Sự chuẩn bị

Không cần chuẩn bị đặc biệt. Nên lấy máu không sớm hơn 4 giờ sau bữa ăn cuối cùng. Có thể tìm thấy các khuyến nghị chung cho việc chuẩn bị cho nghiên cứu. Nên tiến hành xét nghiệm để phát hiện kháng nguyên và kháng thể kháng HIV không sớm hơn hai tuần sau khi có thể bị nhiễm trùng, lặp lại xét nghiệm sau ba và sáu tuần trong trường hợp có kết quả âm tính. Đơn đăng ký nghiên cứu tại INVITRO LLC được điền bằng hộ chiếu hoặc giấy tờ thay thế (thẻ di trú, đăng ký tạm trú tại nơi cư trú, thẻ căn cước quân nhân, giấy chứng nhận của cơ quan cấp hộ chiếu trong trường hợp mất hộ chiếu, thẻ đăng ký từ cơ quan quản lý hộ chiếu). khách sạn). Tài liệu được trình bày nhất thiết phải chứa thông tin về đăng ký tạm thời hoặc thường trú tại Liên bang Nga và một bức ảnh. Trong trường hợp không có hộ chiếu (tài liệu thay thế), bệnh nhân có quyền điền đơn đăng ký ẩn danh để quyên góp vật liệu sinh học. Trong quá trình kiểm tra ẩn danh, đơn đăng ký và mẫu vật liệu sinh học nhận được từ khách hàng, một con số được chỉ định mà chỉ bệnh nhân và nhân viên y tế đã đặt hàng mới biết. ! Kết quả của các nghiên cứu được thực hiện ẩn danh không thể được gửi để nhập viện, kiểm tra chuyên môn và không phải đăng ký trong ORUIB.

Hướng dẫn sử dụng

• Các hạch bạch huyết mở rộng ở nhiều hơn hai khu vực.
• Giảm bạch cầu với giảm bạch cầu.
• Đổ mồ hôi đêm.
• Sụt cân đột ngột không rõ nguyên nhân.
• Tiêu chảy kéo dài hơn 3 tuần không rõ nguyên nhân.
• Sốt không rõ nguyên nhân.
• Lập kế hoạch mang thai.
• Chuẩn bị trước mổ, nhập viện.
• Phát hiện các bệnh nhiễm trùng sau đây hoặc sự kết hợp của chúng: bệnh lao, bệnh toxoplasmosis biểu hiện, nhiễm herpesvirus thường tái phát, nhiễm nấm candida ở các cơ quan nội tạng, đau dây thần kinh do herpes zoster lặp đi lặp lại, viêm phổi do mycoplasmas, pneumocystis hoặc Legionella.
• Sarcoma Kaposi khi còn trẻ.
• Quan hệ tình dục thông thường.

Giải thích kết quả

Giải thích kết quả nghiên cứu chứa thông tin cho bác sĩ tham gia và không phải là chẩn đoán. Thông tin trong phần này không nên được sử dụng để tự chẩn đoán hoặc tự điều trị. Bác sĩ đưa ra chẩn đoán chính xác bằng cách sử dụng cả kết quả kiểm tra này và thông tin cần thiết từ các nguồn khác: tiền sử bệnh, kết quả kiểm tra khác, v.v.

Đơn vị đo lường tại Phòng thí nghiệm độc lập INVITRO: xét nghiệm định tính. Hình thức trình bày kết quả: trong trường hợp không có kháng thể kháng kháng nguyên HIV 1, 2 và p24 thì câu trả lời là “âm tính”. Nếu phát hiện kháng thể kháng HIV hoặc kháng nguyên trong xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme sàng lọc, mẫu huyết thanh sẽ được gửi để xác nhận bằng phương pháp thấm miễn dịch đến trung tâm AIDS của thành phố, nơi xác minh kết quả dương tính và không xác định.

Kết quả tích cực:

1. Nhiễm HIV;
2. kết quả dương tính giả cần nghiên cứu lặp lại hoặc bổ sung *);
3. nghiên cứu này không có nhiều thông tin ở trẻ dưới 18 tháng tuổi sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.

*Độ đặc hiệu của hệ thống xét nghiệm sàng lọc Kháng thể kháng HIV 1 và 2 cũng như kháng nguyên HIV 1 và 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), theo ước tính do nhà sản xuất thuốc thử cung cấp, là khoảng 99,6% ở cả dân số nói chung và cộng đồng nhóm bệnh nhân có khả năng gây nhiễu (nhiễm HBV, HCV, Rubella, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, Chl. trach., v.v., các bệnh lý tự miễn dịch (bao gồm viêm khớp dạng thấp, sự hiện diện của kháng thể kháng nhân) , mang thai, tăng nồng độ IgG, IgM, bệnh lý giao tử đơn dòng, chạy thận nhân tạo, truyền máu nhiều lần).

ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, ELISA) đã đi vào cuộc sống của y học thực tế vào khoảng những năm 60 của thế kỷ trước. Nhiệm vụ ban đầu của nó là nghiên cứu mô học cho mục đích khoa học, tập trung vào việc tìm kiếm và xác định cấu trúc kháng nguyên của tế bào của một sinh vật sống.

Phương pháp ELISA dựa trên sự tương tác giữa các kháng nguyên đặc hiệu (AT) và các kháng nguyên liên quan (AG) với sự hình thành phức hợp “kháng nguyên-kháng thể”, được phát hiện bằng cách sử dụng enzyme. Thực tế này khiến các nhà khoa học nghĩ rằng phương pháp này có thể được sử dụng cho mục đích chẩn đoán để xác định các loại globulin miễn dịch cụ thể thuộc nhiều loại khác nhau có liên quan đến phản ứng miễn dịch đối với một bệnh nhiễm trùng cụ thể. Và đó là một bước đột phá trong chẩn đoán xét nghiệm lâm sàng!

Phương pháp này bắt đầu chỉ được sử dụng tích cực vào đầu những năm 80, và sau đó chủ yếu ở các cơ sở chuyên ngành. Các máy phân tích enzyme miễn dịch đầu tiên được trang bị các trung tâm và trạm truyền máu, bệnh viện truyền nhiễm và bệnh hoa liễu, kể từ khi căn bệnh AIDS ghê gớm, sinh ra ở lục địa châu Phi, xuất hiện ở chân trời của chúng ta và ngay lập tức gia nhập các bệnh nhiễm trùng “cũ”, cần có các biện pháp chẩn đoán ngay lập tức và tìm kiếm. cho các loại thuốc điều trị ảnh hưởng đến anh ta.

Phạm vi áp dụng của phương pháp ELISA

Khả năng của xét nghiệm miễn dịch enzyme thực sự rất rộng lớn. Bây giờ thật khó để tưởng tượng làm thế nào người ta có thể làm được nếu không có nghiên cứu như vậy, được sử dụng trong tất cả các ngành y học theo đúng nghĩa đen. Có vẻ như ELISA có thể làm gì trong ung thư? Hóa ra nó có thể. Và rất nhiều. Khả năng phân tích để tìm ra các dấu hiệu đặc trưng của một số loại khối u ác tính làm cơ sở cho việc phát hiện sớm khối u khi nó chưa được xác định bằng bất kỳ phương pháp nào khác do kích thước nhỏ của nó.

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm lâm sàng hiện đại (CDL), ngoài các dấu ấn khối u, còn có một kho bảng ELISA đáng kể và sử dụng chúng để chẩn đoán các tình trạng bệnh lý khác nhau (quá trình lây nhiễm, rối loạn nội tiết tố) và theo dõi dược phẩm để xác định tác dụng của chúng đối với cơ thể bệnh nhân. và nhân tiện, không chỉ con người. Hiện nay, xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng rộng rãi trong ngành thú y, bởi “những đứa em nhỏ của chúng ta” cũng dễ mắc nhiều bệnh, có khi phải mắc rất nhiều bệnh.

Như vậy, ELISA, do độ nhạy và độ đặc hiệu của nó, có thể xác định từ mẫu máu lấy từ tĩnh mạch:

• Tình trạng nội tiết tố (hormone tuyến giáp và tuyến thượng thận, hormone giới tính);
• Sự hiện diện của các bệnh nhiễm trùng do virus và vi khuẩn (HIV, B và C, chlamydia, giang mai, và, cũng như nhiều bệnh khác do vi sinh vật gây bệnh gây ra);
• Dấu vết về hoạt động sống còn của vi sinh vật đã khởi đầu quá trình lây nhiễm, quá trình này đã kết thúc thành công và chuyển sang giai đoạn hình thành phản ứng miễn dịch đối với mầm bệnh này. Những dấu vết như vậy, tức là kháng thể, trong nhiều trường hợp vẫn lưu thông trong máu suốt đời, do đó bảo vệ một người khỏi bị tái nhiễm.

Bản chất của ELISA là gì?

Phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme cho phép xác định không chỉ sự hiện diện của mầm bệnh (phân tích định tính) mà còn xác định hàm lượng định lượng của nó trong huyết thanh bệnh nhân.

Liều lượng virus hoặc vi khuẩn ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lây nhiễm và kết quả của nó, do đó phân tích định lượng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và điều trị bệnh ở nhiều dạng và giai đoạn khác nhau.

Tuy nhiên, khi biết các nghiên cứu xét nghiệm miễn dịch enzyme là phương pháp ELISA, chúng tôi thậm chí không nghĩ về cách nó có thể bao quát được nhiều loại vi sinh vật sinh sống trên hành tinh của chúng ta, nhiều loài trong số đó gây ra mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe và sự sống của con người và động vật. Nhưng thực tế là ELISA có nhiều lựa chọn (không cạnh tranh và cạnh tranh - trực tiếp và gián tiếp), mỗi lựa chọn đều giải quyết được vấn đề riêng của mình và do đó, cho phép tìm kiếm có mục tiêu.

Để xác định các globulin miễn dịch thuộc loại này hay loại khác, người ta sử dụng bảng (tấm) polystyrene 96 giếng truyền thống, trong các giếng chứa protein tái tổ hợp đã hấp thụ được cô đặc ở pha rắn. Kháng thể hoặc kháng nguyên xâm nhập vào giếng cùng với huyết thanh sẽ tìm thấy vật thể “quen thuộc” và tạo thành phức hợp với nó (AG - AT), được cố định bằng liên hợp enzyme, biểu hiện bằng sự thay đổi màu sắc của giếng khi đọc kết quả.

Xét nghiệm miễn dịch enzyme được thực hiện bằng cách sử dụng các hệ thống xét nghiệm có tính đặc hiệu nhất định, được sản xuất trong các phòng thí nghiệm đặc biệt và được trang bị tất cả các thành phần phản ứng cần thiết. Nghiên cứu có thể được thực hiện bằng cách sử dụng máy giặt (“máy giặt”) và đọc máy đo quang phổ, hầu hết đều sử dụng lao động chân tay. Tất nhiên, trên các máy hoàn toàn tự động, giúp người trợ lý phòng thí nghiệm thoát khỏi công việc nhỏ giọt, rửa và các công việc thường ngày đơn điệu khác, làm việc nhanh hơn và thuận tiện hơn, nhưng không phải phòng thí nghiệm nào cũng có đủ khả năng sang trọng như vậy và tiếp tục làm việc theo cách cũ - trên máy bán tự động.

Việc giải thích kết quả ELISA thuộc thẩm quyền của bác sĩ chẩn đoán trong phòng thí nghiệm và đặc tính cố hữu của hầu hết các phản ứng hóa miễn dịch là đưa ra câu trả lời dương tính giả hoặc âm tính giả cũng phải được tính đến.

Video: xét nghiệm miễn dịch enzyme hiện đại

Kết quả ELISA sử dụng ví dụ về bệnh giang mai

Xét nghiệm miễn dịch enzyme phù hợp để phát hiện tất cả các dạng và ngoài ra còn được sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc. Để thực hiện phân tích, máu tĩnh mạch của bệnh nhân được lấy khi bụng đói sẽ được sử dụng. Công việc sử dụng máy tính bảng có tính đặc hiệu nhất định (AB loại A, M, G) hoặc kháng thể tổng số.

Xét rằng các kháng thể trong bệnh giang mai được tạo ra theo một trình tự cụ thể, ELISA có thể dễ dàng trả lời câu hỏi khi nào nhiễm trùng xảy ra và quá trình này diễn ra ở giai đoạn nào, đồng thời việc giải thích kết quả thu được có thể được trình bày dưới dạng sau:

• IgM cho biết thời gian của quá trình lây nhiễm (có thể xuất hiện trong đợt trầm trọng của các bệnh viêm mãn tính);
• IgA cho biết nhiễm trùng đã xảy ra hơn một tháng trước;
• IgG chỉ ra rằng tình trạng nhiễm trùng đang diễn ra mạnh mẽ hoặc việc điều trị gần đây đã được thực hiện, điều này có thể dễ dàng xác định bằng cách lấy tiền sử bệnh.

Khi xét nghiệm bệnh giang mai, các giếng âm tính (và đối chứng âm tính) sẽ không màu, trong khi các giếng dương tính (và đối chứng dương tính) sẽ hiển thị màu vàng sáng do sự thay đổi màu của chất nhiễm sắc được thêm vào trong quá trình xét nghiệm. Tuy nhiên, cường độ màu không phải lúc nào cũng trùng với mức kiểm soát, tức là nó có thể nhạt hơn hoặc hơi vàng. Đây là những kết quả không rõ ràng, theo quy luật, có thể được kiểm tra lại với việc xem xét bắt buộc các chỉ số định lượng thu được trên máy quang phổ, nhưng nói chung, màu sắc tỷ lệ thuận với số lượng phức hợp miễn dịch (Ags và AT liên quan) .

Xét nghiệm miễn dịch enzyme thú vị nhất là ELISA HIV

Phân tích trên có lẽ thú vị hơn những phân tích khác đối với nhiều người dân, bởi vì vẫn không thể tự tin nói rằng nhiều vấn đề xã hội đã biến mất (mại dâm, nghiện ma túy, v.v.). Thật không may, HIV không chỉ ảnh hưởng đến những tầng lớp này trong xã hội loài người; bạn có thể bị nhiễm bệnh trong nhiều trường hợp khác nhau không liên quan đến tình dục vô đạo đức hoặc sử dụng ma túy. Nhưng nếu có nhu cầu xét nghiệm HIV, bạn không nên sợ mọi người xung quanh sẽ biết việc bạn đến phòng thí nghiệm đó. Giờ đây, những người nhiễm HIV đã được pháp luật bảo vệ, những người còn nghi ngờ có thể tìm đến các văn phòng ẩn danh để giải quyết vấn đề mà không sợ dư luận và lên án.

Phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng để chẩn đoán nhiễm HIV là một trong những nghiên cứu tiêu chuẩn quan trọng nhất, tuy nhiên, đòi hỏi những điều kiện đặc biệt vì chủ đề này rất tế nhị.

Việc thực hiện ELISA HIV sau khi quan hệ tình dục, truyền máu, các thủ tục y tế khác gợi ý nhiễm trùng là hợp lý và vào cuối thời kỳ ủ bệnh (“cửa sổ huyết thanh âm tính”), nhưng cần lưu ý rằng khoảng thời gian này không Vĩnh viễn. Nó có thể kết thúc sau 14-30 ngày hoặc có thể kéo dài đến sáu tháng, vì vậy giá trị trung bình được coi là khoảng từ 45 đến 90 ngày. Máu được hiến cho người nhiễm HIV cũng giống như các bệnh nhiễm trùng khác - từ tĩnh mạch khi bụng đói. Kết quả sẽ có sẵn tùy thuộc vào sự tích lũy vật liệu trong phòng thí nghiệm và khối lượng công việc của nó (từ 2 đến 10 ngày), mặc dù hầu hết các phòng thí nghiệm thường đưa ra câu trả lời trong cùng ngày hoặc ngày hôm sau.

Bạn có thể mong đợi điều gì từ kết quả xét nghiệm HIV của mình?

ELISA để phát hiện nhiễm HIV phát hiện kháng thể đối với hai loại vi-rút: HIV-1 (phổ biến hơn ở Nga và các quốc gia khác ở Châu Âu và Châu Á) và HIV-2 (phổ biến hơn ở Tây Phi).

Nhiệm vụ của ELISA HIV là tìm kiếm các kháng thể loại G, được phát hiện trên tất cả các hệ thống xét nghiệm, nhưng ở giai đoạn muộn hơn, và các kháng thể loại A và M, được phát hiện trên các bộ xét nghiệm tái tổ hợp thế hệ mới, giúp tìm thấy kháng thể. ở giai đoạn sớm nhất (giai đoạn ủ bệnh - "cửa sổ huyết thanh âm tính"). Bạn có thể mong đợi những câu trả lời sau đây từ ELISA:

1. Kết quả dương tính sơ cấp: máu phải được xét nghiệm lại bằng hệ thống xét nghiệm cùng loại, nhưng nếu có thể là một loạt xét nghiệm khác và bởi người khác (trợ lý phòng thí nghiệm);
2. Lặp lại (+) liên quan đến việc lấy máu mới từ bệnh nhân với kết quả xét nghiệm tương tự như phân tích ban đầu;
3. Một kết quả tích cực khác phải được phân tích tham chiếu, sử dụng bộ dụng cụ xét nghiệm có độ đặc hiệu cao (2-3 chiếc.);
4. Kết quả dương tính ở cả hai (hoặc ba) hệ thống sẽ được gửi đi phân tích miễn dịch (cùng một ELISA, nhưng được thực hiện riêng lẻ bằng cách sử dụng các bộ xét nghiệm có độ đặc hiệu đặc biệt cao).

Kết luận về nhiễm HIV chỉ được đưa ra trên cơ sở xét nghiệm miễn dịch. Một cuộc trò chuyện được thực hiện với người bị nhiễm bệnh một cách hoàn toàn bí mật. Việc tiết lộ bí mật y tế ở Nga cũng như ở các nước khác có thể bị trừng phạt hình sự.

Các xét nghiệm tìm chlamydia và cytomegalovirus bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme cũng đặc biệt phổ biến, do chúng có thể xác định thời gian lây nhiễm, giai đoạn bệnh và hiệu quả của các biện pháp điều trị.

Trong quá trình thực hiện, người ta cũng có thể quan sát sự xuất hiện của các kháng thể thuộc nhiều loại khác nhau. trong các giai đoạn khác nhau của tình trạng bệnh lý do tác nhân truyền nhiễm gây ra:

• IgM có thể được phát hiện sớm nhất là bảy ngày sau khi nhiễm bệnh;
• IgA chỉ ra rằng nhiễm trùng đã tồn tại trong cơ thể hơn một tháng;
• IgG xác nhận chẩn đoán bệnh chlamydia và giúp theo dõi điều trị và xác định hiệu quả của nó. Cần lưu ý rằng kháng thể lớp G vẫn tồn tại và lưu hành trong cơ thể bất kể thời gian mắc bệnh, do đó, để diễn giải chính xác kết quả phân tích, bạn cần tính đến các giá trị tham chiếu (định mức), nhân tiện, , khác nhau đối với mỗi CDL: có tính đến nhãn hiệu của hệ thống xét nghiệm và tính đặc hiệu của thuốc thử có trong bộ sản phẩm. Các giá trị bình thường được nhập vào biểu mẫu bên cạnh kết quả ELISA.

Đối với , ở đây hơi khác một chút: Kháng thể loại M xuất hiện sau khoảng một tháng đến một tháng rưỡi, nghĩa là kết quả dương tính (IgM+) xuất hiện trong giai đoạn nhiễm trùng tiên phát hoặc trong quá trình tái hoạt động của nhiễm trùng tiềm ẩn và duy trì như vậy từ 4 tháng đến sáu tháng.

Sự hiện diện của kháng thể lớp G là đặc điểm của sự khởi đầu của nhiễm trùng cấp tính tiên phát hoặc tái nhiễm. Phân tích cho biết vi rút hiện diện nhưng không cung cấp thông tin về giai đoạn của quá trình lây nhiễm. Trong khi đó, việc xác định hiệu giá IgG bình thường cũng gây ra khó khăn, vì nó hoàn toàn phụ thuộc vào tình trạng miễn dịch của từng người cụ thể, tuy nhiên, điều này được xác định bằng cách xác định các globulin miễn dịch loại G. Với đặc tính này của kháng thể, cần phải có khi chẩn đoán CMV. để đánh giá khả năng tương tác của kháng thể lớp G với CMV, để sau này “trung hòa” nó (Ái lực AT). Ở giai đoạn đầu của bệnh, IgG liên kết rất kém với kháng nguyên virus (ái lực thấp) và chỉ sau đó mới bắt đầu biểu hiện hoạt động, do đó, chúng ta có thể nói về sự gia tăng ái lực của kháng thể.

Chúng ta có thể nói nhiều về lợi ích của xét nghiệm miễn dịch enzyme, bởi vì phương pháp này đã giải quyết được nhiều vấn đề chẩn đoán chỉ sử dụng máu tĩnh mạch. Không cần phải chờ đợi lâu, lo lắng và gặp khó khăn trong việc thu thập tài liệu cho nghiên cứu. Ngoài ra, hệ thống xét nghiệm ELISA tiếp tục được cải tiến và không còn xa nữa xét nghiệm sẽ cho kết quả đáng tin cậy 100%.

Video: Phim giáo dục của Đại học Y quốc gia Moscow mang tên. Sechenov về những điều cơ bản của ELISA