Bulaşıcı hastalıklarda virolojik araştırma yöntemleri. Virolojik çalışmalar Time Machine ile Yedekleme

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisine yönelik üç ana yaklaşım vardır.

1) viral antijen veya nükleik asitlerin varlığı için materyalin doğrudan incelenmesi;

2) virüsün klinik materyalden izolasyonu ve tanımlanması;

Klinik materyali teşhis etmek için doğrudan yöntemler

Direkt yöntemler, bir virüsün, viral antijenin veya viral nükleik asidin (NA) doğrudan klinik materyalde saptanmasına olanak sağlayan yani en hızlı (2-24 saat) olan yöntemlerdir.

Elektron mikroskobu (EM). Bu yöntemi kullanarak gerçek virüsü tespit edebilirsiniz.

virüslere karşı spesifik antikorlar kullanan immün elektron mikroskobu (IEM). Antikorların virüslerle etkileşiminin bir sonucu olarak, negatif boyamadan sonra daha kolay tespit edilen kompleksler oluşur.

İmmünofloresan reaksiyonu (RIF). Yöntem, boyaya bağlı antikorların kullanımına dayanmaktadır.

RIF yöntemi, üst solunum yollarının mukoza zarından smear izlerinin analizinde akut solunum yolu viral enfeksiyonlarının etiyolojisini hızlı bir şekilde deşifre etmek için yaygın olarak kullanılır.

Enzim immünoassay (ELISA). Viral antijenlerin belirlenmesi için enzim immünoanaliz yöntemleri prensipte RIF'ye benzer, ancak antikorların boyalardan ziyade enzimlerle etiketlenmesine dayanır.

Radyoimmunoassay (RIA). Yöntem, viral antijenin belirlenmesinde yüksek hassasiyet sağlayan antikorların radyoizotoplarla etiketlenmesine dayanmaktadır.

Moleküler yöntemler. Başlangıçta, oldukça spesifik NA hibridizasyonu yöntemi, viral genomu saptamak için klasik bir yöntem olarak kabul edildi, ancak şimdi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak virüs genomlarının izolasyonu giderek daha fazla kullanılmaktadır.

Nükleik asitlerin moleküler hibridizasyonu. Yöntem, çift sarmallı yapıların oluşumu ile DNA veya RNA'nın tamamlayıcı zincirlerinin hibridizasyonuna ve bunların saptanmasına dayanır.

PCR, doğal DNA replikasyonu ilkesine dayanmaktadır. Yöntemin özü, termostabil bir Taq DNA polimeraz ve iki spesifik primer - sözde primerler kullanılarak virüse özgü bir DNA dizisinin sentez (amplifikasyon) döngülerinin tekrarlanmasıdır.

Sitolojik yöntemler şu anda sınırlı tanı değerine sahiptir, ancak yine de bir dizi enfeksiyonda kullanılmalıdır. Otopsi materyalleri, biyopsiler, smearler incelenir ve uygun işlemden sonra boyanır ve mikroskop altında analiz edilir.

Virüslerin başarılı izolasyonu için, şüphelenilen hastalığın patogenezine uygun ve en kısa sürede klinik materyal alınmalıdır.

Kural olarak, şunları alın:

- solunum yolu enfeksiyonlarında - nazofaringeal lavaj;

- enterovirüs enfeksiyonlu - kızarma ve dışkı (reo-, enterovirüsler);

- cilt ve mukoza zarlarının lezyonları ile - sıyrıklar, veziküllerin içeriği (herpes, su çiçeği);

- ekzantemik enfeksiyonlarda - sürüntüler (kızamık, kızamıkçık);

- arbovirüs enfeksiyonlarında - kan, beyin omurilik sıvısı.

Virüsleri izole etmek için hücre kültürleri, laboratuvar hayvanları, tavuk embriyoları kullanılır. Süreç uzundur, bazen virüs bir veya daha fazla yöntemle - nötralizasyon testi (RN), RIF, ELISA veya PCR kullanılarak tespit edilip tanımlanmadan önce birkaç geçiş gerektirir.

serodiagnostik

Antijen-antikor reaksiyonuna dayalı serolojik tanı, her ikisini de belirlemek için kullanılabilir ve virüs izolasyonunun olumsuz sonuçlarında bile viral bir enfeksiyonun etiyolojisinin belirlenmesinde rol oynar.

RSK, geleneksel serolojik testlerden biridir ve birçok viral enfeksiyonu teşhis etmek için kullanılır. Reaksiyonda iki sistem yer alır: hastanın serumunun antikorları + standart virüs ve koyun eritrositleri + bunlara karşı antikorlar ve ayrıca titre edilmiş bir tamamlayıcı. Antikorlar ve virüs eşleşirse, bu kompleks komplemanı bağlar ve koyun eritrositlerinin parçalanması gerçekleşmez (pozitif reaksiyon). Negatif bir RSC ile kompleman, eritrositlerin parçalanmasına katkıda bulunur. Yöntemin dezavantajı, yetersiz yüksek duyarlılığı ve reaktifleri standardize etmenin zorluğudur.ELISA gibi IF yöntemi, serumdaki antikorları belirlemek için kullanılır.

Virolojik araştırma yöntemleri- virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını inceleme yöntemleri. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nasıl nüfuz ettiklerini ve viral nükleik asitlerin birincil yapısı olan virüslerin üreme özelliklerini belirlemenin mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elementlerinin sırasını belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve kodladıkları proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid sekansı ile ilişkilendirmek ve e-virüs enfeksiyonunda önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglütine etme yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatinin doğası) dayanır. etkisi, hücre içi kapanımların oluşumu, vb.) .

Viral enfeksiyonların teşhisinde, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında ve ayrıca aşı preparatlarının hazırlanmasında doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, kararlı sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokunun proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtılmasıyla elde edilir. Hücrelerin kaynağı, insan ve hayvan embriyolarının dokuları ve organları (çoğunlukla böbrekler) olabilir. Bir besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu, şilteler, şişeler veya Petri kapları olarak adlandırılan yerlere yerleştirilir, burada, kabın yüzeyine bağlandıktan sonra hücreler çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek tabakası kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, viral süspansiyon belirli seyreltmelerde eklenir ve hücrelerle temas ettikten sonra, genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Çoğu birincil kültürden alınan hücreler alt kültürlenebilir ve ikincil kültürler olarak adlandırılır. Hücrelerin daha fazla geçişi ile, çoğu orijinal kromozom setini koruyan, hızlı üreme yeteneğine sahip bir fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültivasyonunda stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre hatları, tek katmanlı ve süspansiyon olabilir. Tek tabakalı kültürler, cam yüzey üzerinde sürekli bir tabaka şeklinde büyür, süspansiyon kültürleri, karıştırıcılar kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyon şeklinde büyür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan türetilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.

Tek tek organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besin ortamında yetiştirilebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde üremeyen virüslerin (örneğin koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklik, spesifik olabilen sitopatik etki, inklüzyonların görünümü, hücredeki ve kültür sıvısındaki viral antijenleri belirleyerek; kültür sıvısında viral progeninin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültürü, civciv embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titrasyonu; floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle moleküler hibridizasyon veya nükleik asit kümeleri ile hücrelerdeki tek tek viral nükleik asitleri tespit ederek.

Virüslerin izolasyonu zahmetli ve uzun bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek (örneğin, virüs a'nın serovaryanını, virüs a'nın vahşi veya aşı suşunu vb. belirlemek için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; çevresel nesnelerde virüslerin gösterilmesi için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılığının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun ortaya çıkma olasılığı dikkate alınır. Tek bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon denir ve onu elde etme işlemine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu, tavuk embriyoları kullanılır, ancak en sık doku kültürü kullanılır. Virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki) ile belirlenir,

Bir dizi virüsün, örneğin virüslerin izolasyonu için, tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir dizi arbovirüsün - yeni doğan farelerin izolasyonu için kullanılır. İzole virüslerin tanımlanması, serolojik testler ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir ve doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesini belirler. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplama altında tek katmanlı bir doku kültürünün virüs tarafından tahrip edilen hücrelerinin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir enfeksiyöz virüs partikülünün bir plak oluşturması temelinde virüslerin enfeksiyöz aktivitesinin nicel bir analizine izin verir. Plaklar, kültürün, genellikle nötr kırmızı olan vital boyalarla boyanmasıyla tanımlanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görünür. Virüsün titresi, 1'deki plak oluşturan birimlerin sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlarında santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisi, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin saptanmasını içerir; bu materyalden virüs izolasyonu; serolojik tanı. Her bir vakada laboratuvar tanı yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalıktan sonraki erken evrelerde klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanızı sağlayan ekspres yöntemlere dayanır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu,

Negatif boyanmış virüslerin elektron mikroskobu, virüslerin ayırt edilmesini ve konsantrasyonlarının belirlenmesini sağlar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun yeterince yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1 ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı, aynı taksonomik gruba ait virüsleri ayırt edememesidir. Bu dezavantaj, immün elektron mikroskobu kullanılarak ortadan kaldırılır. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklendiğinde immün komplekslerin oluşumuna dayanırken, viral partiküllerin eşzamanlı konsantrasyonu meydana gelir, bu da onları tanımlamayı mümkün kılar. Yöntem ayrıca antikorları tespit etmek için kullanılır. Ekspres teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, veziküllerden sıvıların ve nazofarenksten gelen sırların elektron mikroskobik incelemesi yapılır. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılır; yetenekleri, etiketli antikorların kullanımıyla genişletilir.

Virüse özgü nükleik asitlerin saptanmasına dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının saptanmasını mümkün kılar ve duyarlılık açısından eşdeğeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA ipliklerinin (sondalar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncülerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyonun birkaç çeşidi vardır: nokta hibridizasyonu, leke hibridizasyonu, sandviç hibridizasyonu, yerinde hibridizasyon, vb.

lgM sınıfının antikorları, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle bunların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösterir. IgM sınıfının antikorları, anti-m antiserumları (anti-IgM ağır zincir serumları) kullanılarak immünofloresan veya enzim immünoassay ile saptanır.

Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanmaktadır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri ): tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonları

Önceden protein saflaştırması yapılmadan karmaşık karışımlarda virüslerin tek tek antijenlerini ve bunlara karşı antikorları belirlemek için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu, enzim immünoanalizi ile proteinlerin müteakip immünoanalizini birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı gereksinimlerini azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzim immünoassay reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücre antijenlerine karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hastaların serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonların analizinde - viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonunda immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, büyüklüklerini ve antijenik belirleyicilerin varlığını belirleme olasılığında yatmaktadır.

Kaynakça: Bukrinskaya A.G. Viroloji, M., 1986; Viroloji, Yöntemler, ed. B. Meikhi, çev. English, M., 1988'den; Mikrobiyolojik ve virolojik araştırma yöntemleri el kitabı, ed. M.Ö. Birger, M., 1982.

Virolojik araştırma yöntemleri, tıpta viral nitelikteki birçok bulaşıcı ve bazı onkolojik hastalıkların teşhisi için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca onların biyolojilerini ve hayvan ve insan hücrelerini etkileme yeteneklerini belirlemek, incelemek için de kullanılır, bu da viral hastalıkların patogenezinin anlaşılmasına ve tedavileri için doğru yöntemlerin seçilmesine yardımcı olur. Hastalığın etiyolojisinin belirlenmesi ve tedavinin etkinliğinin izlenmesinin yanı sıra, anti-salgın önlemlerin belirlenmesi ve uygulanmasında virolojik araştırma yöntemleri büyük önem taşımaktadır.

Virolojide doğrudan araştırma yöntemleri

Doğrudan virolojik araştırma yöntemleri, bir virüsün, viral nükleik asidin veya viral antijenin doğrudan klinik materyalde saptanmasına olanak tanır ve bu nedenle en hızlıdır (ekspres yöntemler - 24 saate kadar). Bu yöntemler daha az bilgilendiricidir ve sıklıkla yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçların alınması nedeniyle dolaylı tanı yöntemleriyle laboratuvar onayı gerektirir. Doğrudan yöntemler aşağıdaki araştırma yöntemlerini içerir:

• negatif boyama ile virüs boyamalı elektron mikroskobu (1 ml'nin en az 105 viral partikül içermesi şartıyla virüsün varlığını ve materyaldeki konsantrasyonunu belirlemenizi sağlar);
• negatif kontrastla tespit edilmesi tek başına virüslerden daha kolay olan kompleksler oluşturmak için spesifik antikorların virüslerle etkileşimine dayanan immün elektron mikroskobu;
• kullanılan enzim için substrat eklendiğinde tespit edilen kompleksler oluşturan, antijenlere bağlanan enzim etiketli antikorlar kullanılarak enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA);
• immünofloresan reaksiyonu (RIF) - doğrudan veya dolaylı - bir floresan boya ile bağlantılı antikorların kullanımına dayalı;
• radyoimmünoassay (RIA), radyoizotop etiketli antikorların ve gama sayaçlarının kullanımına dayanır;
• sitolojik yöntemler, lekeli yaymaların, biyopsilerin, otopsi materyallerinin mikroskobik incelemesine dayanır;
• moleküler yöntemler - nükleik asitlerin moleküler hibridizasyonu ve polimeraz zincir reaksiyonu (birincisi, bir etiket kullanılarak tamamlayıcı nükleik asit zincirlerinin saptanmasına dayanır, ikincisi, virüse özgü bir DNA dizisinin üç aşamada replikasyonu ilkesine dayanır) .

Nükleik asitlerin moleküler hibridizasyonu için üç seçenek vardır - nokta hibridizasyonu, blot hibridizasyonu (HIV enfeksiyonunu teşhis etmek için kullanılır) ve in situ hibridizasyon (doğrudan enfekte hücrelerde). PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), bu yöntemin yüksek duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle viral enfeksiyonların izlenmesi ve teşhisinde giderek daha fazla kullanılmaktadır.

Dolaylı virolojik araştırma yöntemleri

Bu yöntemler, virüsün izolasyonu ve tanımlanmasına dayanmaktadır. Bunlar daha çok zaman alan ve zaman alan yöntemlerdir, ancak daha doğrudur. Bu tür çalışmalar için malzeme veziküller, kazımalar (su çiçeği, cilt ve mukoza zarının herpetik lezyonları ile), nazofaringeal lavaj (solunum yolu enfeksiyonları ile), kan ve beyin omurilik sıvısı (arbovirüs enfeksiyonları ile), dışkı (enterovirüs ile) olabilir. enfeksiyonlar), sürüntüler (kızamık, kızamıkçık vb.). Virüslerin sadece canlı hücrelerde çoğalabilmesi nedeniyle, virüsün ekimi doku kültürü, tavuk embriyosu veya bir hayvanın (hamster, beyaz fare, köpek, kedi, bazı maymun türleri) vücudunda gerçekleştirilir. Virüsün endikasyonu sitopatik etki ile, hemadsorpsiyon reaksiyonunda, renk testinde, hemaglütinasyon inhibisyon reaksiyonunun sonuçlarına göre, tavuk embriyolarında veya doku kültürlerinde değişikliklere veya yokluklarına göre, hayatta kalma durumuna göre gerçekleştirilir. hassas hayvanlar.

Virolojide kullanılan serolojik tanı yöntemleri

Serolojik, antijen-antikor reaksiyonuna dayalı virolojik araştırma yöntemleri anlamına gelir. Bu durumda, çoğunlukla birkaç haftalık aralıklarla alınan eşleştirilmiş kan serumları kullanılır. Antikor titresinde 4 veya daha fazla artışla reaksiyon pozitif olarak kabul edilir. Virüslerin tip spesifikliğini belirlemek için bir virüs nötralizasyon reaksiyonu kullanılır, grup spesifikliğini belirlemek için bir kompleman fiksasyon reaksiyonu kullanılır. Pasif hemaglutinasyon reaksiyonları, hemaglutinasyonun inhibisyonu, ters pasif hemaglutinasyon, RIF ve çeşitli enzim immünoassay varyantları da yaygın olarak kullanılmaktadır.

Nispeten yakın zamanda, genetik mühendisliği araştırmaları sırasında, monoklonal antikorların elde edilmesi için bir yöntem geliştirilmiştir. Monoklonların dar özgüllüğü, farklı viral determinantlara karşı birkaç monoklonal antikorun kullanılmasıyla aşılır. Bu, viral antijenlerin belirlenmesi ile virolojik araştırma yöntemlerinin duyarlılığını ve özgüllüğünü artırdı. Şu anda viral enfeksiyonların immünolojik teşhisi için birçok farklı test sistemi oluşturulmuştur.

virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını incelemek için yöntemler. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nasıl nüfuz ettiklerini ve viral nükleik asitlerin birincil yapısı olan virüslerin üreme özelliklerini belirlemenin mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elementlerinin sırasını belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve onlar tarafından kodlanan proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid sekansı ile ilişkilendirmek ve viral bir enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca immünolojik süreçlere (bir antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglütinasyon yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (bir antijenin antikorlarla etkileşimi) dayanır. sitopatik etkinin doğası, hücre içi kapanımların oluşumu vb.).

Viral enfeksiyonların teşhisinde, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında ve ayrıca aşı preparatlarının hazırlanmasında doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, kararlı sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokunun proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtılmasıyla elde edilir. Hücrelerin kaynağı, insan ve hayvan embriyolarının dokuları ve organları (çoğunlukla böbrekler) olabilir. Bir besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu, şilteler, şişeler veya Petri kapları olarak adlandırılan yerlere yerleştirilir, burada, kabın yüzeyine bağlandıktan sonra hücreler çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek tabakası kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, viral süspansiyon belirli seyreltmelerde eklenir ve hücrelerle temas ettikten sonra, genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Çoğu birincil kültürden alınan hücreler alt kültürlenebilir ve ikincil kültürler olarak adlandırılır. Hücrelerin daha fazla pasajlanmasıyla, çoğu orijinal kromozom setini koruyan, hızlı üreme yeteneğine sahip bir fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültivasyonunda stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre hatları, tek katmanlı ve süspansiyon olabilir. Tek tabakalı kültürler, cam yüzey üzerinde sürekli bir tabaka şeklinde büyür, süspansiyon kültürleri, karıştırıcılar kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyon şeklinde büyür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan türetilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.

Tek tek organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besin ortamında yetiştirilebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde üremeyen virüslerin (örneğin koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklik, spesifik olabilen sitopatik etki, inklüzyonların görünümü, hücredeki ve kültür sıvısındaki viral antijenleri belirleyerek; kültür sıvısında viral progeninin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültürü, civciv embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titrasyonu; floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle moleküler hibridizasyon veya nükleik asit kümeleri ile hücrelerdeki tek tek viral nükleik asitleri tespit ederek.

Virüslerin izolasyonu zahmetli ve uzun bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek (örneğin, influenza virüsünün serovaryanını, çocuk felci virüsünün vahşi veya aşı suşunu vb. belirlemek için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; çevresel nesnelerde virüslerin gösterilmesi için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılığının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun ortaya çıkma olasılığı dikkate alınır. Tek bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon denir ve onu elde etme işlemine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu, tavuk embriyoları kullanılır, ancak en sık doku kültürü kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsi oluşumu, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorbsiyon, hemaglütinasyon (hemaglütinasyon virüslerinde) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. . Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebilir.

İnfluenza virüsleri gibi bir dizi virüsün izolasyonu için tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir takım arbovirüslerin izolasyonu için yeni doğan fareler kullanılmaktadır. İzole virüslerin tanımlanması, serolojik testler ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir ve doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesini belirler. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplama altında tek katmanlı bir doku kültürünün virüs tarafından tahrip edilen hücrelerinin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir enfeksiyöz virüs partikülünün bir plak oluşturması temelinde virüslerin enfeksiyöz aktivitesinin nicel bir analizine izin verir. Plaklar, kültürün, genellikle nötr kırmızı olan vital boyalarla boyanmasıyla tanımlanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görünür. Virüsün titresi, 1'deki plak oluşturan birimlerin sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlarında santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisi, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin saptanmasını içerir; bu materyalden virüs izolasyonu; serolojik tanı. Her bir vakada laboratuvar tanı yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalıktan sonraki erken evrelerde klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanıza izin veren ekspres yöntemlere dayanır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu ile immünofloresan, moleküler hibridizasyon yöntemi bulunur. , IgM sınıfının antikorlarının tespiti, vb.

Negatif boyanmış virüslerin elektron mikroskobu, virüslerin ayırt edilmesini ve konsantrasyonlarının belirlenmesini sağlar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun yeterince yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1 ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı, aynı taksonomik gruba ait virüsleri ayırt edememesidir. Bu dezavantaj, immün elektron mikroskobu kullanılarak ortadan kaldırılır. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklendiğinde immün komplekslerin oluşumuna dayanırken, viral partiküllerin eşzamanlı konsantrasyonu meydana gelir, bu da onları tanımlamayı mümkün kılar. Yöntem ayrıca antikorları tespit etmek için kullanılır. Ekspres teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, veziküllerden sıvıların ve nazofarenksten gelen sırların elektron mikroskobik incelemesi yapılır. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılır; yetenekleri, etiketli antikorların kullanımıyla genişletilir.

Virüse özgü nükleik asitlerin saptanmasına dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının saptanmasını mümkün kılar ve duyarlılık açısından eşdeğeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA ipliklerinin (sondalar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncülerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyonun birkaç çeşidi vardır: nokta hibridizasyonu, leke hibridizasyonu, sandviç hibridizasyonu, yerinde hibridizasyon, vb.

lgM sınıfının antikorları, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle bunların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösterir. IgM sınıfının antikorları, anti-μ antiserumlar (anti-IgM ağır zincir serumları) kullanılarak immünofloresan veya enzim immünolojik testi ile saptanır.

Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri) : kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglütinasyon, radyal hemoliz, immünofloresan, enzim immünolojik testi, radyoimmünoassay. Birçok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiş ve teknikleri sürekli olarak iyileştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve ikinci serumdaki antikorlardaki artışı birinciye kıyasla belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde, ikinci - sonra alınır). 2-3 hafta). Teşhis değeri, ikinci serumdaki antikorlarda dört kat artıştan az değildir. IgM sınıfının antikorlarının tespiti yakın zamanda bir enfeksiyonu gösteriyorsa, o zaman lgC sınıfının antikorları birkaç yıl ve bazen yaşam boyu varlığını sürdürür.

Önceden protein saflaştırması yapılmadan karmaşık karışımlarda virüslerin tek tek antijenlerini ve bunlara karşı antikorları belirlemek için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu, enzim immünoanalizi ile proteinlerin müteakip immünoanalizini birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı gereksinimlerini azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzim immünoassay reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücre antijenlerine karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hastaların serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonların analizinde - viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonunda immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, büyüklüklerini ve antijenik belirleyicilerin varlığını belirleme olasılığında yatmaktadır.

20) Virionların ana yapısal bileşeni (tam viral partiküller) bir nükleokapsiddir, yani. viral genomu (DNA veya RNA) çevreleyen protein kılıfı (kapsid). Çoğu virüs ailesinin nükleokapsidi, bir lipoprotein zarfı ile çevrilidir. Bazı virüslerde (orto-, paramikso-, rhabdo-, filo- ve retrovirüsler) zarf ve nükleokapsid arasında, viryonlara ek sertlik veren glikosile edilmemiş bir matris proteini vardır. Çoğu ailenin virüsleri, bulaşıcılıkta önemli bir rol oynayan bir zarfa sahiptir. Virionlar, nükleokapsid tomurcuklanarak hücre zarına nüfuz ettiğinde zarfın dış tabakasını alır. Zarf proteinleri virüs tarafından kodlanır ve lipidler hücre zarından ödünç alınır. Genellikle dimerler ve trimerler biçimindeki glikoproteinler, viryonların (orto-, paramiksovirüsler, rhabdo-, filo-, korona-, bunya-, arena-, retrovirüsler) yüzeyinde peplomerler (çıkıntılar) oluşturur. Glikosile edilmiş füzyon proteinleri peplomerlerle ilişkilidir ve virüsün hücreye girişinde anahtar rol oynar. Virionların kapsidleri ve zarfları, kendi kendine bir araya gelme işleminin bir sonucu olarak bir veya daha fazla tipte protein alt biriminin birçok kopyası tarafından oluşturulur. Zayıf kimyasal bağlar nedeniyle protein-protein sistemindeki etkileşim, simetrik kapsidlerin birleşmesine yol açar. Virionların şekli ve boyutundaki virüslerdeki farklılıklar, yapısal protein alt birimlerinin şekline, boyutuna ve sayısına ve bunlar arasındaki etkileşimin doğasına bağlıdır. Kapsid, nispeten basit geometrik ilkelere uygun olarak, kesin olarak tanımlanmış bir şekilde viral polipeptidlerden bir araya getirilen morfolojik olarak ifade edilen birçok alt birimden (kapsomerler) oluşur. Birbirleriyle bağlanan protein alt birimleri, iki tür simetriye sahip kapsidler oluşturur: izometrik ve sarmal. Zarflı virüslerin nükleokapsidinin yapısı, zarfsız virüslerin nükleokapsidinin yapısına benzer. Virüs zarfının yüzeyinde, morfolojik olarak ifade edilen glikoprotein yapıları - peplomerler ayırt edilir. Süperkapsid zarın bileşimi, hücresel kökenli lipidleri (% 20-35'e kadar) ve karbonhidratları (% 7-8'e kadar) içerir. Lipid biyo tabakasının dışında ve içinde yer alan çift katlı hücresel lipidler ve virüse özgü proteinlerden oluşur. Süperkapsid kabuğun dış tabakası, bir veya daha fazla glikoprotein molekülünden oluşan bir veya daha fazla tipte peplomerler (çıkıntılar) ile temsil edilir. Zarflı virüslerin nükleokapsidi genellikle çekirdek olarak adlandırılır ve viryonların nükleik asidi içeren merkezi kısmına nükleoid adı verilir. Kapsomerler (peplomerler), bir veya birkaç homolog veya heterolog polipeptit zincirinden (protein alt birimleri) oluşan yapısal birimlerden oluşur. virüslerin sınıflandırılması İzometrik kapsidler küreler değil, düzenli çokyüzlülerdir (ikosahedronlar). Doğrusal boyutları simetri eksenleri boyunca aynıdır. Kaspar ve Klug'a (1962) göre, kapsidlerdeki kapsomerler ikosahedral simetriye göre düzenlenmiştir. Bu tür kapsidler, bir ikosahedron oluşturan özdeş alt birimlerden oluşur. 12 köşesi (köşesi), 30 yüzü ve ikizkenar üçgen şeklinde 20 yüzeyi vardır. Bu kurala göre, poliovirüs ve şap hastalığı virüsünün kapsidi, her biri dört polipeptit zincirinden oluşan 60 protein yapısal biriminden oluşur. İkosahedron, tekrar eden alt birimleri minimum hacimle sıkı bir kompakt yapı içinde paketleme problemini en iyi şekilde çözer. Viral ikosahedronun yüzeylerini, köşelerini ve yüzlerini sadece yapısal alt birimlerin bazı konfigürasyonları oluşturabilir. Örneğin, adenovirüsün yapısal alt birimleri, yüzeylerde ve yüzlerde altıgen kapsomerler (heksonlar) ve tepelerde beşgen kapsomerler (peptonlar) oluşturur. Bazı virüslerde, her iki tip kapsomer aynı polipeptitlerden, bazılarında ise farklı polipeptitlerden oluşur. Farklı virüslerin yapısal alt birimleri birbirinden farklı olduğundan, bazı virüsler daha altıgen, diğerleri daha küresel görünmektedir. Çiçek hastalığı virüsleri dışında bilinen tüm DNA içeren omurgalı virüslerinin yanı sıra birçok RNA içeren virüs (7 aile) kübik kapsid simetri tipine sahiptir. Reovirüsler, diğer omurgalı virüslerinden farklı olarak, her biri morfolojik birimlerden oluşan çift kapside (dış ve iç) sahiptir. Sarmal tipte bir simetriye sahip virüsler, silindirik bir filamentli yapıya sahiptir, genomik RNA'ları bir spiral şeklindedir ve kapsidin içinde bulunur. Sarmal simetriye sahip tüm hayvan virüsleri bir lipoprotein zarfı ile çevrilidir. Sarmal nükleokapsidler uzunluk, çap, sarmal aralığı ve sarmalın dönüşü başına kapsomer sayısı ile karakterize edilir. Bu nedenle, Sendai virüsünde (paramiksovirüs), nükleokapsid yaklaşık 1 um uzunluğunda, 20 nm çapında ve 5 nm'lik bir sarmal aralığı olan bir sarmaldır. Kapsid, her biri 60 kD moleküler ağırlığa sahip bir protein olan yaklaşık 2400 yapısal birimden oluşur. Sarmalın her dönüşünde 11-13 alt birim vardır. Sarmal nükleokapsid simetrisine sahip virüslerde, protein moleküllerinin bir sarmal halinde katlanması, nükleik asit ve protein alt birimleri arasında maksimum etkileşimi sağlar. İkozahedral virüslerde, nükleik asit viryonların içinde kıvrılır ve kapsidin içinde bulunan bir veya daha fazla polipeptit ile etkileşime girer.

Antireseptörler (reseptörler) Viral- yüzey virion proteinleri, örneğin, duyarlı bir hücrenin karşılık gelen reseptörüne tamamlayıcı bir şekilde bağlanan hemaglutinin.

21) Virolojik araştırmalarda immünolojik yöntemler.

Serolojik testler, bireysel antikor sınıflarını tespit etme yeteneklerine göre değişir. Aglütinasyon testi, örneğin, IgM antikorlarını saptamada iyidir, ancak IgG antikorlarını saptamada daha az duyarlıdır. Kompleman gerektiren kompleman fiksasyonu ve hemoliz testleri, IgA antikorları ve IgE antikorları gibi tamamlayıcı olmayan antikorları tespit etmez. Sadece patojenite ile bağlantılı viryon yüzeyinin antijenik belirleyicilerine karşı yönlendirilen antikorlar, virüs nötralizasyon reaksiyonuna katılır. Duyarlılık I. m. ve. antijenlerin ve antikorların incelenmesi için diğer tüm yöntemleri geride bırakır, özellikle radyoimmünoassay ve enzim immünoassay, nanogramlarda ve hatta pikogramlarda ölçülen miktarlarda protein varlığının yakalanmasına izin verir. I. m.'nin yardımıyla ve. grubu belirleyin ve kanın güvenliğini kontrol edin (hepatit B ve HIV enfeksiyonu). Kumaş ve gövde naklinde ve m. doku uyumluluğunun belirlenmesine ve uyumsuzluk bastırma yöntemlerinin test edilmesine izin verir. Adli tıpta, bir proteinin tür özgüllüğünü belirlemek için Castellani reaksiyonu ve kan grubunu belirlemek için aglütinasyon reaksiyonu kullanılır.

İmmünolojik yöntemler, bulaşıcı hastalıkların laboratuvar tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hastalığın etiyolojisi, hastalığın ilk günlerinde alınan numuneyle karşılaştırıldığında, nekahanın kan serumundaki patojene karşı antikorların artması temelinde de belirlenir. I. m. ve. nüfusun bağışıklığını grip gibi toplu enfeksiyonlarla ilgili olarak inceleyin ve ayrıca önleyici aşıların etkinliğini değerlendirin.

Mekanizmalarına ve sonuçların hesabına bağlı olarak I. m. ve. aglütinasyon olgusuna dayalı reaksiyonlara ayrılabilir; çökelme olgusuna dayalı reaksiyonlar; tamamlayıcı içeren reaksiyonlar; Nötrleştirme reaksiyonu; kimyasal ve fiziksel yöntemlerle reaksiyonlar.

Aglütinasyon olgusuna dayalı reaksiyonlar. Aglütinasyon, hücrelerin veya bireysel parçacıkların - bu antijene bağışıklık serumu yardımıyla bir antijenin taşıyıcılarının yapıştırılmasıdır.

Uygun bir antibakteriyel serum kullanılarak bakteriyel aglütinasyon testi, en basit serolojik testlerden biridir. Test edilen kan serumunun çeşitli dilüsyonlarına bir bakteri süspansiyonu eklenir ve t ° 37 ° 'de belirli bir temas süresinden sonra, kan serumu aglütinasyonunun en yüksek dilüsyonunun gerçekleştiği kaydedilir. Bakterilerin aglütinasyon reaksiyonu birçok bulaşıcı hastalığı teşhis etmek için kullanılır: bruselloz, tularemi, tifo ve paratifo ateşi, basiller dizanteri ve tifüs.

Pasif veya dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu (RPGA, RNGA). Yüzeyinde antijenlerin (bakteriyel, viral, doku) veya antikorların adsorbe edildiği eritrositler veya nötr sentetik malzemeler (örneğin lateks parçacıkları) kullanır. Aglütinasyonları, uygun serum veya antijenler eklendiğinde meydana gelir.

Pasif hemaglütinasyon reaksiyonu, bakterilerin (tifo ve paratifo, dizanteri, bruselloz, veba, kolera, vb.), protozoa (sıtma) ve virüslerin (grip, adenovirüs enfeksiyonları, viral hepatit B, kızamık, kene kaynaklı) neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için kullanılır. ensefalit, Kırım kanamalı ateşi vb.) ve ayrıca belirli hormonları belirlemek, hastanın penisilin ve insülin gibi ilaçlara ve hormonlara karşı aşırı duyarlılığını belirlemek için.

Hemaglütinasyon inhibisyon testi (HITA), virüsler tarafından eritrositlerin hemaglütinasyonunun immün serumunun önlenmesi (inhibisyonu) fenomenine dayanır ve antiviral antikorları tespit etmek ve titre etmek için kullanılır. Nedensel ajanları hemaglütinasyon özelliklerine sahip olan influenza, kızamık, kızamıkçık, kabakulak, kene kaynaklı ensefalit ve diğer viral enfeksiyonların serodiagnozu için ana yöntem olarak hizmet eder. örneğin, kene kaynaklı ensefalitin serodiagnozu için, hastanın serumunun bir alkali borat tampon çözeltisi içinde iki kat seyreltileri panelin oyuklarına dökülür. Daha sonra belirli bir miktarda, genellikle 8 AU (aglütinasyon birimi) kene kaynaklı ensefalit antijeni eklenir ve t ° 4 ° 'de 18 saat maruz kaldıktan sonra, asidik bir fosfat tampon çözeltisi içinde hazırlanan bir kaz eritrosit süspansiyonu eklenir. Hastanın kan serumunda kene kaynaklı ensefalit virüsüne karşı antikorlar varsa, antijen nötralize edilir ve eritrosit aglütinasyonu oluşmaz.

Yağış olgusuna dayalı reaksiyonlar. Çökelme, antikorların çözünür antijenlerle etkileşiminin bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bir çökelme reaksiyonunun en basit örneği, bir antikor üzerindeki antijen tabakasının sınırında bir test tüpünde opak bir çökeltme bandının oluşmasıdır. Hem kalitatif hem de kantitatif olan yarı sıvı agar veya agaroz jellerde (Ouchterlon çift immünodifüzyon yöntemi, radyal immünodifüzyon yöntemi, immünoelektroforez) çeşitli çökeltme reaksiyonları yaygın olarak kullanılır. Antijenlerin jelindeki serbest difüzyonun ve optimal oranlarının bölgesindeki antikorların bir sonucu olarak, spesifik kompleksler oluşur - görsel olarak veya boyama ile tespit edilen çökelme bantları. Yöntemin bir özelliği, her antijen-antikor çiftinin ayrı bir çökelme bandı oluşturması ve reaksiyonun incelenen sistemdeki diğer antijenlerin ve antikorların varlığına bağlı olmamasıdır.

Taze kobay serumu olarak kullanılan tamamlayıcıyı içeren reaksiyonlar, Clq tamamlayıcı alt bileşeninin ve ardından diğer tamamlayıcı bileşenlerinin bağışıklık komplekslerine bağlanma yeteneğine dayanır.

Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR), antijen-antikor kompleksi tarafından kompleman fiksasyonu derecesine göre antijenlerin veya antikorların titrasyonuna izin verir. Bu reaksiyon iki aşamadan oluşur: antijenin test kan serumu ile etkileşimi (test sistemi) ve hemolitik serumun koyun eritrositleri ile etkileşimi (gösterge sistemi). Pozitif bir reaksiyonla, çalışılan sistemde kompleman fiksasyonu meydana gelir ve ardından antikorla duyarlılaştırılmış eritrositler eklenirken hemoliz gözlenmez. Reaksiyon, sifiliz (Wassermann reaksiyonu), viral ve bakteriyel enfeksiyonların serodiagnozu için kullanılır.

Nötralizasyon reaksiyonu, antikorların, enzim aktivitesi, bakteriyel toksinler ve virüslerin patojenitesi gibi makromoleküler veya çözünür antijenlerin belirli spesifik fonksiyonlarını nötralize etme yeteneğine dayanır. Toksinlerin nötralizasyon reaksiyonu biyolojik etki ile değerlendirilebilir, örneğin anti-tetanoz ve anti-botulinum serumları titre edilir. Hayvanlara verilen bir toksin ve antiserum karışımı onların ölümüne neden olmaz. Virolojide nötralizasyon reaksiyonunun çeşitli varyantları kullanılmaktadır. Virüsler uygun bir antiserum ile karıştırılıp bu karışım hayvanlara veya hücre kültürlerine verildiğinde virüslerin patojenitesi nötralize edilerek hayvanlar hastalanmamakta ve kültürlerin hücreleri tahribata uğramamaktadır.

Kimyasal ve fiziksel etiketlerin kullanıldığı reaksiyonlar. İmmünofloresan, florokrom etiketli antikorların, daha doğrusu IgG antikorlarının immünoglobulin fraksiyonunun kullanılmasından oluşur. Florokrom etiketli antikor, florokromun lüminesansını uyaran UV ışınlarında mikroskop altında gözlem için uygun hale gelen antijen ile bir antijen-antikor kompleksi oluşturur. Doğrudan immünofloresan reaksiyonu, hücresel antijenleri incelemek, enfekte hücrelerde virüsü tespit etmek ve yaymalarda bakteri ve riketsiyayı tespit etmek için kullanılır.

Dolaylı immünofloresan yöntemi daha yaygın olarak kullanılmaktadır. ışıldayan bir anti-lgG antikor serumu kullanılarak bir antijen-antikor kompleksinin saptanmasına dayanır ve yalnızca antijenleri değil, aynı zamanda antikorları titre etmek için de kullanılır.

İmmünoenzim veya enzim immünolojik yöntemleri, başlıca yaban turpu peroksidaz veya alkalin fosfataz olmak üzere enzimlerle konjuge antikorların kullanımına dayanır. İmmünofloresan gibi, enzim immünoassay, hücrelerdeki antijenleri tespit etmek veya antijen içeren hücreler üzerindeki antikorları titre etmek için kullanılır.

Radyoimmünolojik yöntem, antijenlerin veya antikorların bir radyoizotop etiketinin kullanımına dayanır. Hormon, ilaç ve antibiyotiklerin belirlenmesinde, bakteriyel, viral, riketsiyal, protozoal hastalıkların teşhisinde, kan proteinleri, doku antijenlerinin incelenmesinde kullanılan antijen ve antikorların belirlenmesinde en hassas yöntemdir.

İmmünoblotlama, tek tek antijenlere karşı antikorları saptamak veya bilinen serumlardan antijenleri "tanımak" için kullanılır. Yöntem 3 aşamadan oluşur: biyolojik makromoleküllerin (örneğin bir virüs) poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak tek tek proteinlere ayrılması; aktifleştirilmiş kağıda veya nitroselüloza bir poliakrilamid jel plakası uygulayarak jelden ayrılmış proteinlerin katı bir destek (leke) üzerine aktarılması (elektro lekeleme); doğrudan veya dolaylı enzim immün testi kullanılarak substrat üzerinde istenen proteinlerin tespiti. Tanı yöntemi olarak, HIV enfeksiyonu için immünoblotlama kullanılır. Teşhis değeri, virüsün dış kabuğunun proteinlerinden birine karşı antikorların tespitidir.

22) Simetri türleri virüsler (kübik, sarmal, karışık). Virüs genomlarının paketlenmesinde proteinlerin ve nükleik asitlerin etkileşimi.

Kapsidin nükleik asit ile etkileşimine bağlı olarak, virüs partikülleri birkaç simetri tipine ayrılabilir:

1). Kübik simetri türü.

Kübik kapsidler, yaklaşık 20 üçgen yüzeyli ve 12 köşeli ikosiderlerdir. Küresel bir oluşumu andıran bir yapı oluştururlar, ancak aslında bir polihedrondur. Bazı durumlarda, bu tür ikosahedral çokyüzlülerin köşelerine sivri denilen özel lipoprotein oluşumları eklenir. Bu sivri uçların rolü, muhtemelen, viryonların veya viral parçacıkların, kendilerine duyarlı olan konakçı hücrelerin karşılık gelen alanları ile etkileşimine indirgenmiştir. Kübik simetri ile, viral nükleik asit sıkıca paketlenir (bir top haline getirilir) ve protein molekülleri onu çevreleyerek bir polihedron (ikosahedron) oluşturur. Bir ikosahedron, kübik simetriye ve yaklaşık olarak küresel bir şekle sahip yirmi üçgen yüze sahip bir çokyüzlüdür. İkosahedral virüsler arasında herpes simpleks virüsü, reovirüsler vb. bulunur.

2). Spiral simetri tipi. Spiral kapsidler biraz daha basittir. Onlar. Kapsidi oluşturan kapsomerler sarmal NK'yi kaplar ve ayrıca bu virüslerin oldukça kararlı bir protein kabuğunu oluşturur. Ve yüksek çözünürlüklü elektron mikroskopları ve uygun hazırlama yöntemleri kullanıldığında virüsler üzerinde spiral yapılar görülebilir. Kapsidin sarmal simetrisiyle, viral nükleik asit sarmal (veya sarmal) bir şekil oluşturur, içi boştur ve protein alt birimleri (kapsomerler) de bir spiral (boru şeklindeki kapsid) içinde istiflenir. Kapsidin sarmal simetrisine sahip bir virüsün bir örneği, çubuk şeklinde olan ve 300 nm uzunluğunda ve 15 nm çapında olan tütün mozaik virüsüdür. Bir viral partikülün bileşimi, boyut olarak yaklaşık 6000 nükleotit olan bir RNA molekülü içerir. Kapsid, sarmal şeklinde düzenlenmiş 2000 özdeş protein alt biriminden oluşur.

3). Karışık veya karmaşık simetri türü. Kural olarak, bu tür simetri esas olarak bakteriyel virüsler arasında bulunur. Ve klasik örnekler, fajlar, E. coli veya ılıman fajlardır. Bunlar, iç nükleik içeriğe sahip bir kafaya, çeşitli uzantılara, bir kuyruk işlemine ve değişen derecelerde karmaşıklığa sahip bir cihaza sahip karmaşık oluşumlardır. Ve bu tür parçacıkların her bir bileşeni, virüs ile hücre arasındaki etkileşim sürecinde gerçekleştirilen belirli bir işleve sahiptir. Başka bir deyişle, karmaşık bir simetri türü, kübik simetrinin bir kombinasyonudur, baş bir icosider polihedrondur ve çubuk şeklindeki oluşumlar kuyruk işlemleridir. Bakteriyel virüsler arasında, küresel veya kübik şekilli ilkel nükleokapsidler olan oldukça basit organize viryonlar da vardır. Bakteriyel virüsler, bitki ve hayvan virüslerinden daha karmaşıktır.

24) Bir fajın bir hücre ile etkileşimi. Virülent ve ılıman fajlar.

Adsorpsiyon.

Etkileşim, viral partiküllerin hücre yüzeyine bağlanmasıyla başlar. İşlem, hücre yüzeyinde uygun reseptörlerin ve viral partikülün yüzeyinde anti-reseptörlerin varlığında mümkün olur.

Virüsler, temel maddeleri taşımak için tasarlanmış hücre reseptörlerini kullanır: besin parçacıkları, hormonlar, büyüme faktörleri vb.

Reseptörler: proteinler, proteinlerin ve lipidlerin karbonhidrat bileşeni, lipidler. Spesifik reseptörler, viral partikülün diğer kaderini belirler (taşıma, sitoplazmanın veya çekirdeğin bölgelerine teslimat). Virüs, spesifik olmayan reseptörlere bağlanabilir ve hatta hücreye nüfuz edebilir. Ancak bu süreç enfeksiyona neden olmaz.

Başlangıçta antireseptör ile reseptör arasında tek bir bağ oluşur. Bu bağ kırılgandır ve kırılabilir. Tersinmez adsorpsiyon oluşumu için çok değerlikli bağlanma gereklidir. Kararlı bağlanma, reseptör moleküllerinin zardaki serbest hareketi nedeniyle meydana gelir. Virüsün hücre ile etkileşimi sırasında, lipidlerin akışkanlığında bir artış ve virüs ile hücre arasındaki etkileşim alanında reseptör alanlarının oluşumu gözlenir. Bir dizi virüsün reseptörleri, yalnızca sınırlı sayıda konakçı hücrede mevcut olabilir. Bu, organizmanın bu virüse duyarlılığını belirler. Böylece viral DNA ve RNA, daha geniş bir konukçu hücre yelpazesini enfekte etme yeteneğine sahiptir.

Antireseptörler benzersiz viral organellerde bulunabilir: T-bakteriyofajlardaki büyüme yapıları, adenovirüslerdeki lifler, viral membranların yüzeyindeki sivri uçlar, koronavirüslerde korona.

Penetrasyon.

2 mekanizma - reseptör endositozu ve membran füzyonu.

Reseptör endositozu:

Besinlerin ve düzenleyici maddelerin hücreye girişi için olağan mekanizma. Özel alanlarda oluşur - klatrin ile kaplı özel çukurların olduğu yerlerde, çukurun dibinde özel alıcılar bulunur. Çukurlar hızlı invaginasyon ve klatrin ile kaplı vakuollerin oluşumunu sağlar (adsorpsiyon anından itibaren 10 dakikadan fazla geçmez, bir dakikada 2000 vakuol oluşabilir). Vakuoller daha büyük sitoplazmik vakuollerle birleşerek reseptorozomları (artık klatrin içermeyen) oluşturur ve bunlar da lizozomlarla birleşir.

Viral ve hücre zarlarının füzyonu:

Zarflı virüslerde, füzyon, viral proteinin hücre membran lipidleri ile nokta etkileşimleri tarafından aracılık edilir, bu da viral lipoprotein zarfının hücre zarı ile entegrasyonu ile sonuçlanır. Zarfsız virüslerde, yüzey proteinlerinden biri ayrıca hücre zarı lipidleri ile etkileşime girer ve iç bileşen zardan geçer (paramiksovirüslerde F-proteini; ortomiksovirüslerde HA2 hemaglütinasyon alt birimi). Yüzey proteinlerinin yapısı pH'dan etkilenir.

Şerit.

Bu süreçte enfeksiyöz aktivite kaybolur, nükleazlara duyarlılık sıklıkla ortaya çıkar ve antikorlara direnç ortaya çıkar. Soyunmanın son ürünü, bir dahili viral proteine ​​bağlı nükleik asitlerdir. Soyunma aşaması ayrıca enfeksiyon olasılığını da sınırlar (virüsler her hücrede soyunamaz). Soyunma, hücrenin özel alanlarında gerçekleşir: lizozomlar, Golgi aygıtı ve perinükleer boşluk.

Soyunma bir dizi reaksiyon sonucunda gerçekleşir. Örneğin, pikornavirüslerde soyunma, boyutları 156 ila 12S arasında olan ara subviral partiküllerin oluşumu ile ilerler. Adenovirüslerde sitoplazmada ve nükleer gözeneklerde bulunur ve en az 3 evresi vardır:

Viryonlardan daha yüksek yoğunluğa sahip subviral parçacıkların oluşumu;

3 viral proteinin eksik olduğu çekirdeklerin oluşumu;

DNA'nın bir terminal proteine ​​kovalent olarak bağlı olduğu bir DNA-protein kompleksinin oluşumu.

Virülent ve ılıman fajların karakterizasyonu.

Bir bakteri bir faj ile enfekte olduğunda, sözde litik enfeksiyon meydana gelir, yani enfeksiyon, konakçı hücrenin parçalanmasıyla sona erer, ancak bu sadece hücre ile etkileşimi olan virülent fajlar olarak adlandırılanların özelliğidir. hücre ölümüne ve faj soyunun oluşumuna yol açar.

Aynı zamanda, fajın hücre ile etkileşimlerine göre aşağıdaki aşamalar ayırt edilir: fajın hücre kültürü ile karıştırılması (enfeksiyonun çokluğu 10 hücre başına 1 fajdır) ve konsantrasyonun yeterince yüksek olması gerekir. fajlar hücrelerle temas edebilir. Yeniden enfeksiyonu önlemek için - enfeksiyondan en fazla 5 dakika sonra, fajlar adsorbe edildiğinde - bu hücre karışımı fajla seyreltilir. Faj sayısının artmadığı bir latent periyot vardır, ardından faj partiküllerinin sayısının keskin bir şekilde arttığı, hücre parçalanması ve faj soyu serbest bırakıldığı ve daha sonra faj sayısının faj sayısının kaldığı çok kısa bir çıkış periyodu vardır. aynı seviyede, çünkü yeniden enfeksiyon oluşmaz. Bu eğriye dayanarak, bu fazlar ayırt edilebilir: "büyümenin" vejetatif periyodu (gizli periyot), çıkış periyodu ve 1 enfekte hücre başına faj verimini hesaplayın. Latent dönemde bakterilerde faj partiküllerine benzer hiçbir şey bulunmaz ve latent dönemde enfeksiyon prensibini bu tür hücrelerden izole etmek mümkün değildir. Yalnızca olgun faj parçacıkları bakterileri enfekte edebilir. Bu nedenle, virülan fajlar her zaman bakterilerin ölümüne neden olur ve sonraki ve diğer hassas hücreleri enfekte edebilen yeni viral partiküllerin üretiminde ortaya çıkan enfeksiyon üretir.

Virülanların aksine, ılıman fajlarla enfeksiyon, bakteri hücrelerinin parçalanmasına yol açmaz, ancak bir fajın bakteri hücresi ile özel bir birlikte yaşama durumunun oluşumu gerçekleştirilir. Bu bir arada bulunma, bakteri hücresinde herhangi bir olumsuz koşul olmaksızın fajın belirli bir başlangıcının bulunması ve nesilden nesile korunmasıyla ifade edilir. Bu tür bir arada yaşamanın belirli aşamalarında, faj hücrede aktive edilir ve litik gelişim döngüsü durumuna girerek hücre lizisine ve faj soyunun salınmasına neden olur. Bu tür fajlara lizojenik veya ılıman fajlar denir ve fajla orta derecede varlık durumu lizojendir ve böyle bir gizli faj içeren bakterilere lizojenik bakteri denir. Lizojenik bakteri terimi, bir fajın kendiliğinden ortaya çıktığı kültürlerin bir zamanlar keşfedildiği ve bu bakteriyofajın kültür kontaminasyonu olarak kabul edilmeye başlanması, yani bir bakteriyel virüsün kültüre girmesi ve bu tür kültürlerin lizojenik olarak adlandırılması gerçeğinden geldi. , lizis üretirler .

virüslerin biyolojisini ve bunların tanımlanmasını incelemek için yöntemler. Virolojide, viral partiküllerin moleküler yapısını, hücreye nasıl nüfuz ettiklerini ve viral nükleik asitlerin birincil yapısı olan virüslerin üreme özelliklerini belirlemenin mümkün olduğu moleküler biyoloji yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. ve proteinler. Viral nükleik asitlerin ve protein amino asitlerinin kurucu elementlerinin sırasını belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmektedir. Nükleik asitlerin ve onlar tarafından kodlanan proteinlerin fonksiyonlarını nükleotid sekansı ile ilişkilendirmek ve viral bir enfeksiyonun patogenezinde önemli rol oynayan hücre içi süreçlerin nedenlerini belirlemek mümkün hale gelir.

Virolojik araştırma yöntemleri ayrıca immünolojik süreçlere (antijenin antikorlarla etkileşimi), virüsün biyolojik özelliklerine (hemaglütine etme yeteneği, hemoliz, enzimatik aktivite), virüsün konakçı hücre ile etkileşiminin özelliklerine (sitopatinin doğası) dayanır. etkisi, hücre içi kapanımların oluşumu, vb.) .

Viral enfeksiyonların teşhisinde, virüslerin yetiştirilmesinde, izolasyonunda ve tanımlanmasında ve ayrıca aşı preparatlarının hazırlanmasında doku ve hücre kültürü yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır. Birincil, ikincil, kararlı sürekli ve diploid hücre kültürleri kullanılır. Birincil kültürler, dokunun proteolitik enzimler (tripsin, kollajenaz) ile dağıtılmasıyla elde edilir. Hücrelerin kaynağı, insan ve hayvan embriyolarının dokuları ve organları (çoğunlukla böbrekler) olabilir. Bir besin ortamındaki hücrelerin bir süspansiyonu, şilteler, şişeler veya Petri kapları olarak adlandırılan yerlere yerleştirilir, burada, kabın yüzeyine bağlandıktan sonra hücreler çoğalmaya başlar. Virüs enfeksiyonu için genellikle bir hücre tek tabakası kullanılır. Besin sıvısı boşaltılır, viral süspansiyon belirli seyreltmelerde eklenir ve hücrelerle temas ettikten sonra, genellikle serumsuz taze besin ortamı eklenir.

Çoğu birincil kültürden alınan hücreler alt kültürlenebilir ve ikincil kültürler olarak adlandırılır. Hücrelerin daha fazla geçişi ile, çoğu orijinal kromozom setini koruyan, hızlı üreme yeteneğine sahip bir fibroblast benzeri hücre popülasyonu oluşur. Bunlar sözde diploid hücrelerdir. Hücrelerin seri kültivasyonunda stabil sürekli hücre kültürleri elde edilir. Geçişler sırasında, heteroploid bir kromozom seti ile hızla bölünen homojen hücreler ortaya çıkar. Kararlı hücre hatları, tek katmanlı ve süspansiyon olabilir. Tek tabakalı kültürler, cam yüzey üzerinde sürekli bir tabaka şeklinde büyür, süspansiyon kültürleri, karıştırıcılar kullanılarak çeşitli kaplarda süspansiyon şeklinde büyür. 40 farklı hayvan türünden (primatlar, kuşlar, sürüngenler, amfibiler, balıklar, böcekler dahil) ve insanlardan türetilen 400'den fazla hücre dizisi vardır.

Tek tek organ ve doku parçaları (organ kültürleri) yapay besin ortamında yetiştirilebilir. Bu tür kültürler, özellikle farklılaşmamış doku kültürlerinde üremeyen virüslerin (örneğin koronavirüsler) izolasyonu ve geçişi için önemli olan doku yapısını korur.

Enfekte hücre kültürlerinde virüsler, hücre morfolojisindeki bir değişiklik, spesifik olabilen sitopatik etki, inklüzyonların görünümü, hücredeki ve kültür sıvısındaki viral antijenleri belirleyerek; kültür sıvısında viral progeninin biyolojik özelliklerinin belirlenmesi ve doku kültürü, civciv embriyoları veya hassas hayvanlarda virüslerin titrasyonu; floresan mikroskopi kullanılarak sitokimyasal yöntemle moleküler hibridizasyon veya nükleik asit kümeleri ile hücrelerdeki tek tek viral nükleik asitleri tespit ederek.

Virüslerin izolasyonu zahmetli ve uzun bir süreçtir. Popülasyon arasında dolaşan virüsün tipini veya varyantını belirlemek (örneğin, influenza virüsünün serovaryanını, çocuk felci virüsünün vahşi veya aşı suşunu vb. belirlemek için); acil epidemiyolojik önlemlerin alınmasının gerekli olduğu durumlarda; yeni virüs türleri veya çeşitleri ortaya çıktığında; gerekirse ön tanıyı onaylayın; çevresel nesnelerde virüslerin gösterilmesi için. Virüsleri izole ederken, insan vücudunda kalıcı olma olasılığının yanı sıra iki veya daha fazla virüsün neden olduğu karışık bir enfeksiyonun ortaya çıkma olasılığı dikkate alınır. Tek bir viriondan elde edilen bir virüsün genetik olarak homojen bir popülasyonuna viral klon denir ve onu elde etme işlemine klonlama denir.

Virüsleri izole etmek için duyarlı laboratuvar hayvanlarının enfeksiyonu, tavuk embriyoları kullanılır, ancak en sık doku kültürü kullanılır. Bir virüsün varlığı genellikle spesifik hücre dejenerasyonu (sitopatik etki), semplast ve sinsi oluşumu, hücre içi inklüzyonların tespiti ve ayrıca immünofloresan, hemadsorbsiyon, hemaglütinasyon (hemaglütinasyon virüslerinde) vb. kullanılarak tespit edilen spesifik bir antijen ile belirlenir. . Bu belirtiler ancak virüsün 2-3 geçişinden sonra tespit edilebilir.

İnfluenza virüsleri gibi bir dizi virüsün izolasyonu için tavuk embriyoları, bazı Coxsackie virüslerinin ve bir takım arbovirüslerin izolasyonu için yeni doğan fareler kullanılmaktadır. İzole virüslerin tanımlanması, serolojik testler ve diğer yöntemler kullanılarak gerçekleştirilir.

Virüslerle çalışırken titreleri belirlenir. Virüslerin titrasyonu genellikle doku kültüründe gerçekleştirilir ve doku dejenerasyonunun meydana geldiği, inklüzyonların ve virüse özgü antijenlerin oluştuğu virüs içeren sıvının en yüksek seyreltmesini belirler. Plak yöntemi, bir dizi virüsü titre etmek için kullanılabilir. Plaklar veya negatif virüs kolonileri, agar kaplama altında tek katmanlı bir doku kültürünün virüs tarafından tahrip edilen hücrelerinin odaklarıdır. Koloni sayımı, bir enfeksiyöz virüs partikülünün bir plak oluşturması temelinde virüslerin enfeksiyöz aktivitesinin nicel bir analizine izin verir. Plaklar, kültürün, genellikle nötr kırmızı olan vital boyalarla boyanmasıyla tanımlanır; plaklar boyayı adsorbe etmez ve bu nedenle lekeli canlı hücrelerin arka planında hafif noktalar olarak görünür. Virüsün titresi, 1'deki plak oluşturan birimlerin sayısı olarak ifade edilir. ml.

Virüslerin saflaştırılması ve konsantrasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme ve ardından konsantrasyon veya yoğunluk gradyanlarında santrifüjleme ile gerçekleştirilir. Virüsleri saflaştırmak için immünolojik yöntemler, iyon değişim kromatografisi, immünosorbentler vb. kullanılır.

Viral enfeksiyonların laboratuvar teşhisi, klinik materyalde patojenin veya bileşenlerinin saptanmasını içerir; bu materyalden virüs izolasyonu; serolojik tanı. Her bir vakada laboratuvar tanı yönteminin seçimi, hastalığın doğasına, hastalığın süresine ve laboratuvarın yeteneklerine bağlıdır. Viral enfeksiyonların modern teşhisi, hastalıktan sonraki erken evrelerde klinik materyali aldıktan birkaç saat sonra yanıt almanıza izin veren ekspres yöntemlere dayanır.Bunlar arasında elektron ve immün elektron mikroskobu ile immünofloresan, moleküler hibridizasyon yöntemi bulunur. , IgM sınıfının antikorlarının tespiti, vb.

Negatif boyanmış virüslerin elektron mikroskobu, virüslerin ayırt edilmesini ve konsantrasyonlarının belirlenmesini sağlar. Viral enfeksiyonların tanısında elektron mikroskobunun kullanımı, klinik materyaldeki viral partikül konsantrasyonunun yeterince yüksek olduğu durumlarla sınırlıdır (10 5'te 1 ml Ve daha yüksek). Yöntemin dezavantajı, aynı taksonomik gruba ait virüsleri ayırt edememesidir. Bu dezavantaj, immün elektron mikroskobu kullanılarak ortadan kaldırılır. Yöntem, viral partiküllere spesifik serum eklendiğinde immün komplekslerin oluşumuna dayanırken, viral partiküllerin eşzamanlı konsantrasyonu meydana gelir, bu da onları tanımlamayı mümkün kılar. Yöntem ayrıca antikorları tespit etmek için kullanılır. Ekspres teşhis amacıyla, doku ekstraktlarının, dışkıların, veziküllerden sıvıların ve nazofarenksten gelen sırların elektron mikroskobik incelemesi yapılır. Elektron mikroskobu, virüsün morfogenezini incelemek için yaygın olarak kullanılır; yetenekleri, etiketli antikorların kullanımıyla genişletilir.

Virüse özgü nükleik asitlerin saptanmasına dayanan moleküler hibridizasyon yöntemi, genlerin tek kopyalarının saptanmasını mümkün kılar ve duyarlılık açısından eşdeğeri yoktur. Reaksiyon, tamamlayıcı DNA veya RNA ipliklerinin (sondalar) hibridizasyonuna ve çift iplikli yapıların oluşumuna dayanır. En ucuz prob klonlanmış rekombinant DNA'dır. Prob, radyoaktif öncülerle (genellikle radyoaktif fosfor) etiketlenir. Kolorimetrik reaksiyonların kullanımı umut vericidir. Moleküler hibridizasyonun birkaç çeşidi vardır: nokta hibridizasyonu, leke hibridizasyonu, sandviç hibridizasyonu, yerinde hibridizasyon, vb.

lgM sınıfının antikorları, G sınıfı antikorlardan daha erken ortaya çıkar (hastalığın 3-5. gününde) ve birkaç hafta sonra kaybolur, bu nedenle bunların saptanması yeni bir enfeksiyonu gösterir. IgM sınıfının antikorları, anti-μ antiserumlar (anti-IgM ağır zincir serumları) kullanılarak immünofloresan veya enzim immünolojik testi ile saptanır.

Virolojideki serolojik yöntemler, klasik immünolojik reaksiyonlara dayanır (bkz. İmmünolojik araştırma yöntemleri) : kompleman fiksasyon reaksiyonları, hemaglütinasyon inhibisyonu, biyolojik nötralizasyon, immünodifüzyon, dolaylı hemaglütinasyon, radyal hemoliz, immünofloresan, enzim immünolojik testi, radyoimmünoassay. Birçok reaksiyon için mikro yöntemler geliştirilmiş ve teknikleri sürekli olarak iyileştirilmektedir. Bu yöntemler, bilinen bir dizi serum kullanarak virüsleri tanımlamak ve ikinci serumdaki antikorlardaki artışı birinciye kıyasla belirlemek için serodiagnoz için kullanılır (ilk serum hastalıktan sonraki ilk günlerde, ikinci - sonra alınır). 2-3 hafta). Teşhis değeri, ikinci serumdaki antikorlarda dört kat artıştan az değildir. IgM sınıfının antikorlarının tespiti yakın zamanda bir enfeksiyonu gösteriyorsa, o zaman lgC sınıfının antikorları birkaç yıl ve bazen yaşam boyu varlığını sürdürür.

Önceden protein saflaştırması yapılmadan karmaşık karışımlarda virüslerin tek tek antijenlerini ve bunlara karşı antikorları belirlemek için immünoblotlama kullanılır. Yöntem, poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak protein fraksiyonasyonunu, enzim immünoanalizi ile proteinlerin müteakip immünoanalizini birleştirir. Proteinlerin ayrılması, antijenin kimyasal saflığı gereksinimlerini azaltır ve bireysel antijen-antikor çiftlerinin tanımlanmasını mümkün kılar. Bu görev, örneğin, yanlış pozitif enzim immünoassay reaksiyonlarının, viral proteinlerin yetersiz saflaştırılmasının bir sonucu olarak mevcut olan hücre antijenlerine karşı antikorların varlığından kaynaklandığı HIV enfeksiyonunun serodiagnozu ile ilgilidir. Hastaların serumlarında iç ve dış viral antijenlere karşı antikorların tanımlanması, hastalığın evresini ve popülasyonların analizinde - viral proteinlerin değişkenliğini belirlemeyi mümkün kılar. HIV enfeksiyonunda immünoblotlama, bireysel viral antijenleri ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için doğrulayıcı bir test olarak kullanılır. Popülasyonları analiz ederken, yöntem viral proteinlerin değişkenliğini belirlemek için kullanılır. Yöntemin büyük değeri, rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak sentezlenen antijenleri analiz etme, büyüklüklerini ve antijenik belirleyicilerin varlığını belirleme olasılığında yatmaktadır.

Kaynakça: Bukrinskaya A.G. Viroloji, M., 1986; Viroloji, Yöntemler, ed. B. Meikhi, çev. English, M., 1988'den; Mikrobiyolojik ve virolojik araştırma yöntemleri el kitabı, ed. M.Ö. Birger, M., 1982.

• - termofilik aerobik mikroorganizmaların hayati aktivitesinin bir sonucu olarak ısınmalarına dayanan organik maddeler içeren atıkları nötralize etme yöntemleri ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - doku bölümlerinin organik maddelerle inkübasyonu sırasında enzimatik aktivitenin lokalizasyonunda kalsiyum veya magnezyum fosfat çökeltilerinin oluşumunun reaksiyonuna dayanan enzimlerin tespiti için histokimyasal yöntemler ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - amonyak gümüşü veya piridin-soda gümüş çözeltileri kullanılarak sinir dokusu ve çeşitli organların müstahzarlarında histiyositleri tespit etme yöntemleri ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - kalıtsal hastalıklarla yüklü ailelerde hasta ve sağlıklı insanların gözlemlenen ve beklenen oranlarının karşılaştırılmasına dayanarak, yöntemi dikkate alarak kalıtımın doğası hakkındaki varsayımları değerlendirme yöntemleri ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - normal, patolojik ve deneysel koşullarda insan, hayvan ve bitkilerin hücre ve dokularının yapısını ve işlevini incelemek için kullanılır...

  Tıp Ansiklopedisi

• - histolojik bölümlerde kimyasalları tanımlama yöntemleri. G. m.'nin ayrılmaz bir parçası. hazırlanan smear ve baskıların hücrelerdeki kimyasalları tespit eden sitokimyasal yöntemlerdir...

  Tıp Ansiklopedisi

• - enzim glikoz oksidaz varlığında glikozun atmosferik oksijen ile oksidasyonuna dayanan kan ve idrardaki glikozun nicel ve nitel tespiti için yöntemler ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - antijenlerin ve antikorların spesifik etkileşimine dayanan teşhis araştırma yöntemleri ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - histolojik preparasyonlarda çok renkli boyamalarına dayalı olarak bağ dokusu ve nöroglia lifli yapılarını tespit etme yöntemleri...

  Tıp Ansiklopedisi

• - 1) bir potasyum şap ve rodamin çözeltisi olan Mayer hemalunu kullanarak dermisin histolojik preparatlarını boyama yöntemi; hücre çekirdeği maviye boyanır, eleidin kırmızıya boyanır...

  Tıp Ansiklopedisi

• - tıpta - tıp ve sağlıkla ilgili nesnelerin ve sistemlerin durumunun ve davranışının nicel çalışması ve analizi için bir dizi yöntem ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - mikroskop kullanarak çeşitli nesneleri incelemenin yolları ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - optik aralıkta elektromanyetik radyasyonun doğası, yayılması ve madde ile etkileşimi ile ilgili optik yasalarının kullanımına dayanarak ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - duyu organları yardımıyla çevredeki nesnelerin kalitesini araştırma ve değerlendirme yöntemleri ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - glial ve diğer argirofilik lifleri tespit etmek için histolojik preparatları gümüşle emprenye etmek için bir dizi yöntemin genel adı ...

  Tıp Ansiklopedisi

• - suçların soruşturulmasında ve hukuk davalarının değerlendirilmesinde ortaya çıkan özel sorunları çözmek için soruşturmacı ve mahkeme tarafından atanırlar. Adli tıp önerisiyle de tutuluyorlar...

  Tıp Ansiklopedisi

Kitaplarda "virolojik araştırma yöntemleri"

Adına Öldüren Makineye Karşı Öfke (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Los Angeleslı grup Rage Against The Machine'in ilk albümü, hip-hop ve hard rock'ı bir araya getirerek, onlara güncel politik manifestolar ve hoş bir şekilde hatırı sayılır miktarda yoğun funk ritmi serpiştirdi. İlk single'da yer alan "Adını Öldürmek" şarkısında,

James Brown Kalk (A Olmak Gibi Hissediyorum) Seks Makinesi (1970)

James Brown Kalk (Ben A Olmak Gibi Hissediyorum) Seks Makinesi (1970) 1960'ların sonuna doğru James Brown deneyler yapmaya başladı. The Famous Flames'in yürek parçalayan ruhu, yerini The J.B.'nin cızırtılı funklarına bıraktı. Yaklaşan funk döneminin en önemli kilometre taşlarından biri, on dakikalık bir versiyonu olan "Sex Machine" idi.

Makineye karşı öfke