طرق البحث الفيروسي للأمراض المعدية. النسخ الاحتياطي لأبحاث علم الفيروسات باستخدام آلة الزمن

في التشخيص المختبري اصابات فيروسيةهناك ثلاث طرق رئيسية

1) الفحص المباشر للمادة لوجود المستضد الفيروسي أو الأحماض النووية؛

2) عزل الفيروس وتحديده من المواد السريرية؛

الطرق المباشرة لتشخيص المواد السريرية

الطرق المباشرة هي طرق تسمح باكتشاف الفيروس أو المستضد الفيروسي أو الحمض النووي الفيروسي (NA) مباشرة في المواد السريرية، أي أنها الأسرع (2-24 ساعة).

المجهر الإلكتروني (EM). باستخدام هذه الطريقة، يمكنك اكتشاف الفيروس نفسه.

المجهر الإلكتروني المناعي (IEM)، والذي يستخدم أجسام مضادة محددة للفيروسات. نتيجة لتفاعل الأجسام المضادة مع الفيروسات، يتم تشكيل المجمعات التي يسهل اكتشافها بعد التباين السلبي.

رد الفعل المناعي (RIF). تعتمد الطريقة على استخدام الأجسام المضادة المرتبطة بالصبغة

تُستخدم طريقة RIF على نطاق واسع لفك مسببات الالتهابات الفيروسية التنفسية الحادة بسرعة عند تحليل مسحات بصمات الأصابع من الغشاء المخاطي للجهاز التنفسي العلوي.

مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). إن طرق المقايسة المناعية الإنزيمية لتحديد المستضدات الفيروسية تشبه من حيث المبدأ طريقة RIF، ولكنها تعتمد على وسم الأجسام المضادة بالإنزيمات بدلاً من الأصباغ.

المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA). وتعتمد الطريقة على وسم الأجسام المضادة بالنظائر المشعة، مما يضمن حساسية عالية في تحديد المستضد الفيروسي.

الطرق الجزيئية. في البداية، كانت الطريقة الكلاسيكية لتحديد الجينوم الفيروسي تعتبر الطريقة المحددة للغاية لتهجين NA، ولكن في الوقت الحاضر يتم استخدام عزل الجينوم الفيروسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بشكل متزايد.

التهجين الجزيئي للأحماض النووية. تعتمد الطريقة على تهجين الخيوط التكميلية من DNA أو RNA مع تكوين هياكل مزدوجة الجديلة وتحديدها

يعتمد PCR على مبدأ تكرار الحمض النووي الطبيعي. جوهر هذه الطريقة هو تكرار دورات متعددة من التوليف (التضخيم) لتسلسل الحمض النووي الخاص بالفيروس باستخدام بوليميريز DNA Taq القابل للحرارة واثنين من البادئات المحددة - ما يسمى البادئات.

الطرق الخلوية لها قيمة تشخيصية محدودة حاليًا، ولكن يجب استخدامها لعدد من حالات العدوى. يتم فحص مواد التشريح والخزعات والمسحات، والتي يتم صبغها وتحليلها تحت المجهر بعد المعالجة المناسبة.

لعزل الفيروسات بنجاح، يجب أن تؤخذ المواد السريرية وفقا لتسبب المرض المشتبه فيه وفي أقرب وقت ممكن.

كقاعدة عامة، يأخذون:

- في التهابات الجهاز التنفسي– شطف البلعوم الأنفي.

– في حالات العدوى الفيروسية المعوية – الغسل والبراز (الفيروسات المعوية والفيروسات المعوية);

- لآفات الجلد والأغشية المخاطية - الكشط، ومحتويات البثور (الهربس، جدري الماء)؛

- في حالات العدوى الطفحية - الغسل (الحصبة والحصبة الألمانية)؛

– في حالات العدوى الفيروسية المفصلية – الدم والسائل النخاعي.

لعزل الفيروسات، يتم استخدام مزارع الخلايا وحيوانات المختبر وأجنة الدجاج. تكون العملية طويلة، وتتطلب أحيانًا عدة مقاطع قبل اكتشاف الفيروس وتحديده باستخدام طريقة واحدة أو أكثر - تفاعل التحييد (RN)، أو RIF، أو ELISA أو PCR.

التشخيص المصلي

يمكن استخدام التشخيص المصلي، المعتمد على تفاعل المستضد والجسم المضاد، لتحديد كليهما ويلعب دورًا في تحديد مسببات العدوى الفيروسية حتى عندما تكون نتائج عزل الفيروس سلبية.

RSK هو أحد الاختبارات المصلية التقليدية ويستخدم لتشخيص العديد من الالتهابات الفيروسية. يشارك نظامان في التفاعل: الأجسام المضادة من مصل المريض + الفيروس القياسي وخلايا الدم الحمراء للأغنام + الأجسام المضادة لها، بالإضافة إلى المكمل المعاير. إذا تطابقت الأجسام المضادة مع الفيروس، فإن هذا المركب يرتبط بتكملة ولا يحدث تحلل لخلايا الدم الحمراء في الأغنام (رد فعل إيجابي). مع RSC السلبي، يعزز المكمل تحلل كريات الدم الحمراء. عيب هذه الطريقة هو حساسيتها العالية غير الكافية وصعوبة توحيد الكواشف. يتم استخدام طريقة IF، مثل ELISA، لتحديد الأجسام المضادة في المصل.

طرق البحث الفيروسي- طرق دراسة بيولوجيا الفيروسات والتعرف عليها. في علم الفيروسات، تُستخدم أساليب البيولوجيا الجزيئية على نطاق واسع، والتي من خلالها كان من الممكن إنشاء التركيب الجزيئي للجزيئات الفيروسية، وطرق اختراقها في الخلية وخصائص التكاثر الفيروسي، والبنية الأساسية للأحماض النووية الفيروسية والبروتينات. يجري تطوير طرق لتحديد تسلسل العناصر المكونة للأحماض النووية الفيروسية والأحماض الأمينية البروتينية. أصبح من الممكن ربط وظائف الأحماض النووية والبروتينات التي تشفرها مع تسلسل النيوكليوتيدات وتحديد أسباب العمليات داخل الخلايا التي تلعب دورا في دور مهمفي العدوى الفيروسية.

تعتمد طرق البحث الفيروسي أيضًا على العمليات المناعية (تفاعل المستضد مع الأجسام المضادة)، والخصائص البيولوجية للفيروس (القدرة على التراص الدموي، وانحلال الدم، والنشاط الأنزيمي)، وخصائص تفاعل الفيروس مع الخلية المضيفة (طبيعة تأثير الاعتلال الخلوي). ، وتشكيل شوائب داخل الخلايا، وما إلى ذلك).

في تشخيص الالتهابات الفيروسية، في زراعة وعزل وتحديد الفيروسات، وكذلك في إنتاج مستحضرات اللقاحات، يتم استخدام طريقة زراعة الأنسجة والخلايا على نطاق واسع. يتم استخدام مزارع الخلايا الأولية والثانوية والمستقرة والمستمرة وثنائية الصبغية. يتم الحصول على الثقافات الأولية عن طريق تفريق الأنسجة مع الإنزيمات المحللة للبروتين (التربسين، كولاجيناز). يمكن أن يكون مصدر الخلايا هو الأنسجة والأعضاء (عادة الكلى) للأجنة البشرية والحيوانية. يتم وضع الخلايا المعلقة في وسط غذائي في ما يسمى بالمراتب أو الزجاجات أو أطباق بيتري، حيث تبدأ الخلايا في التكاثر بعد التصاقها بسطح الوعاء. بالنسبة لعدوى الفيروس، عادة ما يتم استخدام طبقة أحادية الخلية. يتم تصريف السائل المغذي، ويضاف المعلق الفيروسي في تخفيفات معينة، وبعد الاتصال بالخلايا، يضاف وسط مغذي طازج، عادة بدون مصل.

يمكن إجراء زراعة فرعية لخلايا معظم المزارع الأولية، وتسمى هذه المزرعة بالمزرعة الثانوية. مع مرور المزيد من الخلايا، يتم تشكيل مجموعة من الخلايا الشبيهة بالليفية، قادرة على التكاثر السريع، معظمالذي يحتفظ بالمجموعة الأصلية من الكروموسومات. هذه هي ما يسمى خلايا ثنائية الصبغية. عن طريق زراعة الخلايا بشكل تسلسلي، يتم الحصول على ثقافات الخلايا المستمرة المستقرة. أثناء الممرات، تظهر الخلايا المتجانسة التي تنقسم بسرعة مع مجموعة من الكروموسومات غير المتجانسة. يمكن أن تكون خطوط الخلايا المستقرة أحادية الطبقة أو معلقة. تنمو المزارع أحادية الطبقة على شكل طبقة متواصلة على السطح الزجاجي، بينما تنمو المزارع المعلقة على شكل معلقات في أوعية مختلفة باستخدام أجهزة الخلط. هناك أكثر من 400 خط خلوي مشتق من 40 نوعًا حيوانيًا مختلفًا (بما في ذلك الرئيسيات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك والحشرات) والبشر.

يمكن زراعة قطع من الأعضاء والأنسجة الفردية (مزارع الأعضاء) في وسائط مغذية صناعية. تحافظ هذه الأنواع من المزارع على بنية الأنسجة، وهو أمر مهم بشكل خاص لعزل ومرور الفيروسات التي لا تتكاثر في مزارع الأنسجة غير المتمايزة (على سبيل المثال، الفيروسات التاجية).

في المصابة مزارع الخلايايمكن الكشف عن الفيروسات عن طريق التغيرات في شكل الخلية، والتأثيرات الخلوية، والتي قد تكون محددة، وظهور الشوائب، عن طريق تحديد المستضدات الفيروسية في الخلية وفي سائل المزرعة؛ تحديد الخصائص البيولوجية للذرية الفيروسية في سائل الاستنبات ومعايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة أو أجنة الدجاج أو الحيوانات الحساسة؛ من خلال تحديد الأحماض النووية الفيروسية الفردية في الخلايا عن طريق التهجين الجزيئي أو تراكم الأحماض النووية بالطريقة الكيميائية الخلوية باستخدام المجهر الفلوري.

تعد عملية عزل الفيروسات عملية كثيفة العمالة وتستغرق وقتًا طويلاً. يتم إجراؤها لتحديد نوع أو متغير الفيروس المنتشر بين السكان (على سبيل المثال، لتحديد متغير مصلي للفيروس أ، أو سلالة برية أو لقاحية للفيروس أ، وما إلى ذلك)؛ في الحالات التي يكون فيها من الضروري اتخاذ تدابير وبائية عاجلة؛ عند ظهور أنواع أو أشكال جديدة من الفيروسات؛ إذا لزم الأمر، تأكيد التشخيص الأولي. للإشارة إلى الفيروسات في الكائنات بيئة. عند عزل الفيروسات، يؤخذ في الاعتبار احتمالية بقائها في جسم الإنسان، وكذلك حدوث عدوى مختلطة ناجمة عن فيروسين أو أكثر. تسمى المجموعة المتجانسة وراثيا من الفيروس التي يتم الحصول عليها من فيروس واحد بالاستنساخ الفيروسي، وتسمى عملية الحصول عليها بالاستنساخ.

لعزل الفيروسات، يتم استخدام إصابة حيوانات المختبر الحساسة وأجنة الدجاج، ولكن في أغلب الأحيان يتم استخدام زراعة الأنسجة. عادة ما يتم تحديد وجود الفيروس عن طريق تنكس خلايا معينة (تأثير الاعتلال الخلوي)،

لعزل عدد من الفيروسات، على سبيل المثال فيروسات أ، يتم استخدام أجنة الدجاج، لعزل بعض فيروسات كوكساكي وعدد من الفيروسات المفصلية - الفئران حديثي الولادة. يتم التعرف على الفيروسات المعزولة باستخدام التفاعلات المصلية وطرق أخرى.

عند العمل مع الفيروسات، يتم تحديد عيارها. عادة ما يتم إجراء معايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة، وتحديد أعلى تخفيف للسائل المحتوي على الفيروس والذي يحدث فيه تنكس الأنسجة، وتتشكل الشوائب والمستضدات الخاصة بالفيروس. يمكن استخدام طريقة البلاك لمعايرة عدد من الفيروسات. اللويحات، أو المستعمرات السلبية للفيروسات، هي بؤر للخلايا التي دمرها الفيروس في مزرعة نسيجية أحادية الطبقة تحت طبقة أجار. عد مستعمرة يسمح تحليل كميالنشاط المعدي للفيروسات يعتمد على حساب أن جزيء فيروس معدي واحد يشكل لوحة واحدة. يتم الكشف عن لويحات عن طريق تلطيخ الثقافة مع الأصباغ intravital، وعادة ما تكون حمراء محايدة؛ اللويحات لا تمتص الصبغة وبالتالي تكون مرئية على شكل بقع ضوئيةعلى خلفية الخلايا الحية الملطخة. يتم التعبير عن عيار الفيروس بعدد وحدات تشكيل البلاك لكل 1 مل.

يتم عادةً تنقية الفيروسات وتركيزها عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي يليه الطرد المركزي للتركيز أو التدرج في الكثافة. لتنقية الفيروسات، يتم استخدام الطرق المناعية، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني، الممتزات المناعية، وما إلى ذلك.

يشمل التشخيص المختبري للعدوى الفيروسية الكشف عن العامل الممرض أو مكوناته في المواد السريرية؛ عزل الفيروس من هذه المادة؛ التشخيص المصلي. يعتمد اختيار طريقة التشخيص المختبري في كل حالة على حدة على طبيعة المرض وفترة المرض وإمكانيات المختبر. التشخيص الحديثتعتمد العدوى الفيروسية على طرق صريحة تتيح الحصول على إجابة بعد عدة ساعات من تناول المواد السريرية في المراحل المبكرة بعد المرض، وتشمل الفحص المجهري الإلكتروني والمناعي،

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني للفيروسات ذات اللون السلبي إمكانية التمييز بين الفيروسات وتحديد تركيزها. يقتصر استخدام المجهر الإلكتروني في تشخيص الالتهابات الفيروسية على الحالات التي يكون فيها تركيز الجزيئات الفيروسية في المواد السريرية مرتفعًا جدًا (10 5 في 1) ملوأعلى). عيب هذه الطريقة هو عدم القدرة على التمييز بين الفيروسات التي تنتمي إلى نفس المجموعة التصنيفية. ويتم التغلب على هذا النقص عن طريق استخدام المجهر الإلكتروني المناعي. تعتمد الطريقة على تكوين مجمعات مناعية عن طريق إضافة مصل محدد إلى الجزيئات الفيروسية، مع تركيز الجزيئات الفيروسية في الوقت نفسه، مما يسمح بالتعرف عليها. تُستخدم الطريقة أيضًا للكشف عن الأجسام المضادة. لأغراض التشخيص السريع، يتم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني لمستخلصات الأنسجة والبراز والسوائل من الحويصلات وإفرازات البلعوم الأنفي. يُستخدم المجهر الإلكتروني على نطاق واسع لدراسة تكوّن الفيروس، ويتم توسيع قدراته باستخدام الأجسام المضادة الموسومة.

إن طريقة التهجين الجزيئي، التي تعتمد على اكتشاف الأحماض النووية الخاصة بالفيروس، تجعل من الممكن اكتشاف نسخ مفردة من الجينات ولا مثيل لها في الحساسية. يعتمد التفاعل على تهجين خيوط DNA أو RNA التكميلية (المسبارات) وتشكيل هياكل مزدوجة الجديلة. أرخص مسبار هو استنساخ الحمض النووي المؤتلف. يتم تمييز المسبار بالسلائف المشعة (عادةً الفوسفور المشع). استخدام ردود الفعل اللونية واعدة. هناك عدة خيارات للتهجين الجزيئي: التهجين الموضعي، والتهجين البقعي، والتهجين الساندويتش، والتهجين الموضعي، وما إلى ذلك.

تظهر الأجسام المضادة من فئة IgM في وقت أبكر من الأجسام المضادة من الفئة G (في اليوم الثالث إلى الخامس من المرض) وتختفي بعد بضعة أسابيع، لذلك يشير اكتشافها إلى وجود عدوى حديثة. يتم الكشف عن الأجسام المضادة من فئة IgM عن طريق التألق المناعي أو الاستخدام المقايسة المناعية الإنزيميةباستخدام الأمصال المضادة لـ m (الأمصال ضد سلاسل lgM الثقيلة).

تعتمد الطرق المصلية في علم الفيروسات على التفاعلات المناعية الكلاسيكية (انظر. طرق البحث المناعية ): تفاعلات التثبيت التكميلية

لتحديد المستضدات الفردية للفيروسات والأجسام المضادة لها في مخاليط معقدة دون تنقية أولية للبروتينات، يتم استخدام التطعيم المناعي. تجمع هذه الطريقة بين تجزئة البروتين باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد مع الإشارة المناعية اللاحقة للبروتينات باستخدام طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية. يقلل فصل البروتين من متطلبات النقاء الكيميائي للمستضد ويجعل من الممكن تحديد أزواج المستضد والأجسام المضادة الفردية. هذه المهمة ذات صلة، على سبيل المثال، في التشخيص المصلي لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية، حيث ردود فعل إيجابية كاذبةتنجم المقايسة المناعية الإنزيمية عن وجود أجسام مضادة للمستضدات الخلوية، والتي تكون موجودة نتيجة لعدم كفاية تنقية البروتينات الفيروسية. إن تحديد الأجسام المضادة في أمصال المريض للمستضدات الفيروسية الداخلية والخارجية يجعل من الممكن تحديد مرحلة المرض، وعند تحليل المجموعات السكانية، تحديد تباين البروتينات الفيروسية. يتم استخدام اللطخة المناعية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري كاختبار تأكيدي لتحديد المستضدات الفيروسية الفردية والأجسام المضادة لها. عند تحليل السكان، يتم استخدام الطريقة لتحديد تباين البروتينات الفيروسية. تكمن القيمة الكبيرة لهذه الطريقة في إمكانية تحليل المستضدات المُصنّعة باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف، وتحديد أحجامها ووجود محددات المستضدات.

فهرس:بوكرينسكايا أ. علم الفيروسات، م.، 1986؛ علم الفيروسات، الأساليب، أد. ب. ميخي، العابر. من الإنجليزية، م.، 1988؛ دليل طرق البحث الميكروبيولوجية والفيروسية، أد. شهر. بيرجيرا، م.، 1982.

تستخدم طرق البحث الفيروسي على نطاق واسع في الطب لتشخيص العديد من الأمراض المعدية وبعضها أمراض الأورامذات طبيعة فيروسية.

تُستخدم أيضًا طرق البحث الفيروسية لتحديد ودراسة بيولوجيتها وقدرتها على التأثير على الخلايا الحيوانية والبشرية، مما يساعد أيضًا على فهم التسبب في المرض. الأمراض الفيروسيةواختيار طرق العلاج الصحيحة. بالإضافة إلى تحديد مسببات المرض ومراقبة فعالية العلاج، فإن طرق البحث الفيروسي لها أهمية كبيرة في تحديد وتنفيذ تدابير مكافحة الوباء.

طرق البحث المباشر في علم الفيروسات

تتيح طرق البحث الفيروسي المباشر اكتشاف الفيروس أو الحمض النووي الفيروسي أو المستضد الفيروسي مباشرة في المواد السريرية، وبالتالي فهي الأسرع (الطرق السريعة - تصل إلى 24 ساعة). هذه الطرق أقل إفادة وتتطلب تأكيدًا مختبريًا طرق غير مباشرةالتشخيص بسبب التلقي المتكرر لنتائج سلبية كاذبة أو نتائج إيجابية كاذبة. تشمل طرق البحث المباشر ما يلي:

• المجهر الإلكتروني مع تلطيخ الفيروسات باستخدام طريقة التباين السلبي (يسمح لك بتحديد وجود الفيروس وتركيزه في المادة، بشرط أن يحتوي 1 مل على 105 جزيئات فيروسية على الأقل)؛
• المجهر الإلكتروني المناعي، الذي يعتمد على تفاعل أجسام مضادة محددة مع الفيروسات لتكوين مجمعات يسهل اكتشافها بتباين سلبي مقارنة بالفيروسات بشكل منفصل؛
• مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) باستخدام الأجسام المضادة التي تحمل علامة الإنزيم والتي ترتبط بالمستضدات، وتشكل مجمعات يتم الكشف عنها عند إضافة ركيزة للإنزيم المستخدم؛
• يعتمد تفاعل التألق المناعي (RIF) - المباشر أو غير المباشر - على استخدام الأجسام المضادة المرتبطة بصبغة الفلورسنت؛
• تعتمد المقايسة المناعية الإشعاعية (RIA) على استخدام الأجسام المضادة الموسومة إشعاعيًا وعدادات جاما؛
• وتعتمد الطرق الخلوية على الفحص المجهري للمسحات الملونة، وعينات الخزعة، ومواد التشريح؛
• الطرق الجزيئية - التهجين الجزيئي للأحماض النووية وتفاعل البوليميراز المتسلسل (يعتمد الأول على تحديد السلاسل التكميلية للأحماض النووية باستخدام علامة، والثاني على مبدأ تكرار تسلسل الحمض النووي الخاص بالفيروس على ثلاث مراحل).

هناك ثلاثة خيارات للتهجين الجزيئي للأحماض النووية - تهجين النقطة، وتهجين اللطخة (يستخدم للتشخيص عدوى فيروس نقص المناعة البشرية) والتهجين في الموقع (مباشرة في الخلايا المصابة). يستخدم الآن PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل) بشكل متزايد في مراقبة وتشخيص الالتهابات الفيروسية بسبب الحساسية العالية والخصوصية لهذه الطريقة.

طرق البحث الفيروسي غير المباشرة

وتعتمد هذه الطرق على عزل الفيروس وتحديد هويته. هذه الأساليب أكثر كثافة في العمل وتستغرق وقتًا طويلاً، ولكنها أكثر دقة. يمكن أن تكون المادة المستخدمة في مثل هذه الدراسات هي محتويات الحويصلات والقصاصات (إذا كانت حُماق, الآفة الهربسيةالجلد والأغشية المخاطية)، وغسل البلعوم الأنفي (لالتهابات الجهاز التنفسي)، والدم والسائل النخاعي (للعدوى الفيروسية المفصلية)، والبراز (للعدوى الفيروسية المعوية)، وغسل (للحصبة والحصبة الألمانية، وما إلى ذلك). نظرًا لأن الفيروسات لا يمكنها التكاثر إلا في الخلايا الحية، تتم زراعة الفيروس في زراعة الأنسجة أو في جنين دجاج أو في حيوان (الهامستر، الفأر الأبيض، الكلب، القط، بعض أنواع القرود). يتم تحديد الفيروس عن طريق العمل الخلوي، في تفاعل امتصاص الدم، عن طريق اختبار اللون، عن طريق نتائج تفاعل تثبيط التراص الدموي، عن طريق التغيرات أو غيابها في أجنة الدجاج أو مزارع الأنسجة، عن طريق بقاء الحيوانات الحساسة.

طرق التشخيص المصلية المستخدمة في علم الفيروسات

الوسائل المصلية هي طرق البحث الفيروسية القائمة على تفاعل الأجسام المضادة للمستضد. في هذه الحالة، يتم استخدام أمصال الدم المقترنة في أغلب الأحيان، والتي يتم أخذها على فترات عدة أسابيع. عندما يزيد عيار الأجسام المضادة بمقدار 4 مرات أو أكثر، يعتبر التفاعل إيجابيا. لتحديد خصوصية نوع الفيروسات، يتم استخدام تفاعل تحييد الفيروس، ولتحديد خصوصية المجموعة، يتم استخدام تفاعل التثبيت التكميلي. يتم أيضًا استخدام تفاعلات التراص الدموي السلبي، وتثبيط التراص الدموي، وتفاعلات التراص الدموي السلبي العكسي، وRIF والمقايسات المناعية الإنزيمية المختلفة على نطاق واسع.

في الآونة الأخيرة نسبيا، في سياق أبحاث الهندسة الوراثية، تم تطوير طريقة لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. يتم التغلب على الخصوصية الضيقة للوحيدات النسيلة عن طريق استخدام العديد من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لمحددات فيروسية مختلفة. وقد أدى ذلك إلى زيادة حساسية وخصوصية طرق البحث الفيروسي مع تحديد المستضدات الفيروسية. حاليًا، تم إنشاء العديد من أنظمة الاختبار المختلفة التشخيص المناعياصابات فيروسية.

طرق دراسة بيولوجيا الفيروسات وتحديد هويتها. في علم الفيروسات، يتم استخدام أساليب البيولوجيا الجزيئية على نطاق واسع، والتي من خلالها كان من الممكن إنشاء التركيب الجزيئي للجزيئات الفيروسية، وطرق اختراقها في الخلية وميزات التكاثر الفيروسي، والبنية الأولية للأحماض النووية الفيروسية والبروتينات. يجري تطوير طرق لتحديد تسلسل العناصر المكونة للأحماض النووية الفيروسية والأحماض الأمينية البروتينية. يصبح من الممكن ربط وظائف الأحماض النووية والبروتينات التي تشفرها مع تسلسل النيوكليوتيدات وتحديد أسباب العمليات داخل الخلايا التي تلعب دورًا مهمًا في التسبب في العدوى الفيروسية.

تعتمد طرق البحث الفيروسي أيضًا على العمليات المناعية (تفاعل المستضد مع الأجسام المضادة)، والخصائص البيولوجية للفيروس (القدرة على التراص الدموي، وانحلال الدم، والنشاط الأنزيمي)، وخصائص تفاعل الفيروس مع الخلية المضيفة (سمة تأثير الاعتلال الخلوي). ، وتشكيل شوائب داخل الخلايا، وما إلى ذلك).

في تشخيص الالتهابات الفيروسية، في زراعة وعزل وتحديد الفيروسات، وكذلك في إنتاج مستحضرات اللقاحات، يتم استخدام طريقة زراعة الأنسجة والخلايا على نطاق واسع. يتم استخدام مزارع الخلايا الأولية والثانوية والمستقرة والمستمرة وثنائية الصبغية. يتم الحصول على الثقافات الأولية عن طريق تفريق الأنسجة مع الإنزيمات المحللة للبروتين (التربسين، كولاجيناز). يمكن أن يكون مصدر الخلايا هو الأنسجة والأعضاء (عادة الكلى) للأجنة البشرية والحيوانية. يتم وضع الخلايا المعلقة في وسط غذائي في ما يسمى بالمراتب أو الزجاجات أو أطباق بيتري، حيث تبدأ الخلايا في التكاثر بعد التصاقها بسطح الوعاء. بالنسبة لعدوى الفيروس، عادة ما يتم استخدام طبقة أحادية الخلية. يتم تصريف السائل المغذي، ويضاف المعلق الفيروسي في تخفيفات معينة، وبعد الاتصال بالخلايا، يضاف وسط مغذي طازج، عادة بدون مصل.

يمكن إجراء زراعة فرعية لخلايا معظم المزارع الأولية، وتسمى هذه المزرعة بالمزرعة الثانوية. مع مرور المزيد من الخلايا، يتم تشكيل مجموعة من الخلايا الشبيهة بالألياف الليفية، قادرة على التكاثر السريع، ويحتفظ معظمها بالمجموعة الأصلية من الكروموسومات. هذه هي ما يسمى الخلايا ثنائية الصبغية. عن طريق زراعة الخلايا بشكل تسلسلي، يتم الحصول على ثقافات الخلايا المستمرة المستقرة. أثناء الممرات، تظهر الخلايا المتجانسة التي تنقسم بسرعة مع مجموعة من الكروموسومات غير المتجانسة. يمكن أن تكون خطوط الخلايا المستقرة أحادية الطبقة أو معلقة. تنمو المزارع أحادية الطبقة على شكل طبقة متواصلة على السطح الزجاجي، بينما تنمو المزارع المعلقة على شكل معلقات في أوعية مختلفة باستخدام أجهزة الخلط. هناك أكثر من 400 خط خلوي مشتق من 40 نوعًا حيوانيًا مختلفًا (بما في ذلك الرئيسيات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك والحشرات) والبشر.

يمكن زراعة قطع من الأعضاء والأنسجة الفردية (مزارع الأعضاء) في وسائط مغذية صناعية. تحافظ هذه الأنواع من المزارع على بنية الأنسجة، وهو أمر مهم بشكل خاص لعزل ومرور الفيروسات التي لا تتكاثر في مزارع الأنسجة غير المتمايزة (على سبيل المثال، الفيروسات التاجية).

في مزارع الخلايا المصابة، يمكن اكتشاف الفيروسات عن طريق التغيرات في شكل الخلية، وتأثيرات الاعتلال الخلوي، والتي قد تكون محددة، وظهور الشوائب، عن طريق تحديد المستضدات الفيروسية في الخلية وفي سائل المزرعة؛ تحديد الخصائص البيولوجية للذرية الفيروسية في سائل الاستنبات ومعايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة أو أجنة الدجاج أو الحيوانات الحساسة؛ من خلال تحديد الأحماض النووية الفيروسية الفردية في الخلايا عن طريق التهجين الجزيئي أو تراكم الأحماض النووية بالطريقة الكيميائية الخلوية باستخدام المجهر الفلوري.

تعد عملية عزل الفيروسات عملية كثيفة العمالة وتستغرق وقتًا طويلاً. يتم إجراؤها لتحديد نوع أو متغير الفيروس المنتشر بين السكان (على سبيل المثال، لتحديد متغير مصلي لفيروس الأنفلونزا، أو سلالة برية أو لقاح لفيروس شلل الأطفال، وما إلى ذلك)؛ في الحالات التي يكون فيها من الضروري اتخاذ تدابير وبائية عاجلة؛ عند ظهور أنواع أو أشكال جديدة من الفيروسات؛ إذا لزم الأمر، تأكيد التشخيص الأولي. للإشارة إلى الفيروسات في الكائنات البيئية. عند عزل الفيروسات، يؤخذ في الاعتبار احتمالية بقائها في جسم الإنسان، وكذلك حدوث عدوى مختلطة ناجمة عن فيروسين أو أكثر. تسمى المجموعة المتجانسة وراثيا من الفيروس التي يتم الحصول عليها من فيروس واحد بالاستنساخ الفيروسي، وتسمى عملية الحصول عليها بالاستنساخ.

لعزل الفيروسات، يتم استخدام إصابة حيوانات المختبر الحساسة وأجنة الدجاج، ولكن في أغلب الأحيان يتم استخدام زراعة الأنسجة. يتم تحديد وجود الفيروس عادة من خلال انحطاط خلايا معين (تأثير الاعتلال الخلوي)، وتكوين السيمبلاست والمخلى، والكشف عن الشوائب داخل الخلايا، بالإضافة إلى مستضد محدد تم اكتشافه باستخدام التألق المناعي، والامتصاص الدموي، والتراص الدموي (للفيروسات المتراصة للدم)، وما إلى ذلك. . لا يمكن اكتشاف هذه العلامات إلا بعد 2-3 مقاطع من الفيروس.

لعزل عدد من الفيروسات، مثل فيروسات الأنفلونزا، يتم استخدام أجنة الدجاج، ولعزل بعض فيروسات كوكساكي وعدد من الفيروسات المفصلية، يتم استخدام الفئران حديثة الولادة. يتم التعرف على الفيروسات المعزولة باستخدام التفاعلات المصلية وطرق أخرى.

عند العمل مع الفيروسات، يتم تحديد عيارها. عادة ما يتم إجراء معايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة، وتحديد أعلى تخفيف للسائل المحتوي على الفيروس والذي يحدث فيه تنكس الأنسجة، وتتشكل الشوائب والمستضدات الخاصة بالفيروس. يمكن استخدام طريقة البلاك لمعايرة عدد من الفيروسات. اللويحات، أو المستعمرات السلبية للفيروسات، هي بؤر للخلايا التي دمرها الفيروس في مزرعة نسيجية أحادية الطبقة تحت طبقة أجار. يسمح عد المستعمرات بإجراء تحليل كمي للنشاط المعدي للفيروسات على أساس أن جزيء فيروس معدي واحد يشكل لوحة واحدة. يتم الكشف عن لويحات عن طريق تلطيخ الثقافة مع الأصباغ intravital، وعادة ما تكون حمراء محايدة؛ لا تمتص اللويحات الصبغة وبالتالي تظهر على شكل بقع ضوئية على خلفية الخلايا الحية الملطخة. يتم التعبير عن عيار الفيروس بعدد وحدات تشكيل البلاك لكل 1 مل.

يتم عادةً تنقية الفيروسات وتركيزها عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي يليه الطرد المركزي للتركيز أو التدرج في الكثافة. لتنقية الفيروسات، يتم استخدام الطرق المناعية، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني، الممتزات المناعية، وما إلى ذلك.

يشمل التشخيص المختبري للعدوى الفيروسية الكشف عن العامل الممرض أو مكوناته في المواد السريرية؛ عزل الفيروس من هذه المادة؛ التشخيص المصلي. يعتمد اختيار طريقة التشخيص المختبري في كل حالة على حدة على طبيعة المرض وفترة المرض وإمكانيات المختبر. يعتمد التشخيص الحديث للعدوى الفيروسية على طرق صريحة تتيح الحصول على إجابة بعد عدة ساعات من تناول المواد السريرية في المراحل المبكرة بعد المرض، وتشمل هذه الطرق الفحص الإلكتروني والمجهر الإلكتروني المناعي، بالإضافة إلى التألق المناعي، وهي طريقة التهجين الجزيئي. الكشف عن الأجسام المضادة لفئة IgM وما إلى ذلك.

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني للفيروسات ذات اللون السلبي إمكانية التمييز بين الفيروسات وتحديد تركيزها. يقتصر استخدام المجهر الإلكتروني في تشخيص الالتهابات الفيروسية على الحالات التي يكون فيها تركيز الجزيئات الفيروسية في المواد السريرية مرتفعًا جدًا (10 5 في 1) ملوأعلى). عيب هذه الطريقة هو عدم القدرة على التمييز بين الفيروسات التي تنتمي إلى نفس المجموعة التصنيفية. ويتم التغلب على هذا النقص عن طريق استخدام المجهر الإلكتروني المناعي. تعتمد الطريقة على تكوين مجمعات مناعية عن طريق إضافة مصل محدد إلى الجزيئات الفيروسية، مع تركيز الجزيئات الفيروسية في الوقت نفسه، مما يسمح بالتعرف عليها. تُستخدم الطريقة أيضًا للكشف عن الأجسام المضادة. لأغراض التشخيص السريع، يتم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني لمستخلصات الأنسجة والبراز والسوائل من الحويصلات وإفرازات البلعوم الأنفي. يُستخدم المجهر الإلكتروني على نطاق واسع لدراسة تكوّن الفيروس، ويتم توسيع قدراته باستخدام الأجسام المضادة الموسومة.

إن طريقة التهجين الجزيئي، التي تعتمد على اكتشاف الأحماض النووية الخاصة بالفيروس، تجعل من الممكن اكتشاف نسخ مفردة من الجينات ولا مثيل لها في الحساسية. يعتمد التفاعل على تهجين خيوط DNA أو RNA التكميلية (المسبارات) وتشكيل هياكل مزدوجة الجديلة. أرخص مسبار هو استنساخ الحمض النووي المؤتلف. يتم تمييز المسبار بالسلائف المشعة (عادةً الفوسفور المشع). استخدام ردود الفعل اللونية واعدة. هناك عدة خيارات للتهجين الجزيئي: التهجين الموضعي، والتهجين البقعي، والتهجين الساندويتش، والتهجين الموضعي، وما إلى ذلك.

تظهر الأجسام المضادة من فئة IgM في وقت أبكر من الأجسام المضادة من الفئة G (في اليوم الثالث إلى الخامس من المرض) وتختفي بعد بضعة أسابيع، لذلك يشير اكتشافها إلى وجود عدوى حديثة. يتم الكشف عن الأجسام المضادة من فئة lgM عن طريق التألق المناعي أو عن طريق المقايسة المناعية الإنزيمية باستخدام الأمصال المضادة لـ μ (الأمصال ضد السلاسل الثقيلة من lgM).

تعتمد الطرق المصلية في علم الفيروسات على التفاعلات المناعية الكلاسيكية (انظر طرق البحث المناعية) : تفاعلات التثبيت التكميلي، تثبيط التراص الدموي، المعادلة البيولوجية، الانتشار المناعي، التراص الدموي غير المباشر، انحلال الدم الشعاعي، التألق المناعي، المقايسة المناعية الإنزيمية، المقايسة المناعية الإشعاعية. وقد تم تطوير أساليب ميكروية للعديد من التفاعلات، ويجري تحسين تقنياتها باستمرار. تستخدم هذه الطرق للتعرف على الفيروسات باستخدام مجموعة من الأمصال المعروفة وللتشخيص المصلي لتحديد زيادة الأجسام المضادة في المصل الثاني مقارنة بالأول (يؤخذ المصل الأول في الأيام الأولى بعد المرض، والثاني - بعد 2- 3 أسابيع). القيمة التشخيصية لا تقل عن أربعة أضعاف زيادة الأجسام المضادة في المصل الثاني. إذا كان الكشف عن الأجسام المضادة من فئة IgM يشير إلى وجود عدوى حديثة، فإن الأجسام المضادة من فئة IgC تستمر لعدة سنوات، وأحيانًا مدى الحياة.

لتحديد المستضدات الفردية للفيروسات والأجسام المضادة لها في مخاليط معقدة دون تنقية أولية للبروتينات، يتم استخدام التطعيم المناعي. تجمع هذه الطريقة بين تجزئة البروتين باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد مع الإشارة المناعية اللاحقة للبروتينات باستخدام طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية. يقلل فصل البروتين من متطلبات النقاء الكيميائي للمستضد ويجعل من الممكن تحديد أزواج المستضد والأجسام المضادة الفردية. هذه المهمة ذات صلة، على سبيل المثال، في التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري، حيث تحدث تفاعلات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم إيجابية كاذبة بسبب وجود أجسام مضادة للمستضدات الخلوية، والتي تكون موجودة نتيجة لعدم كفاية تنقية البروتينات الفيروسية. إن تحديد الأجسام المضادة في أمصال المريض للمستضدات الفيروسية الداخلية والخارجية يجعل من الممكن تحديد مرحلة المرض، وعند تحليل المجموعات السكانية، تحديد تباين البروتينات الفيروسية. يتم استخدام اللطخة المناعية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري كاختبار تأكيدي لتحديد المستضدات الفيروسية الفردية والأجسام المضادة لها. عند تحليل السكان، يتم استخدام الطريقة لتحديد تباين البروتينات الفيروسية. تكمن القيمة الكبيرة لهذه الطريقة في إمكانية تحليل المستضدات المُصنّعة باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف، وتحديد أحجامها ووجود محددات المستضدات.

20) المكون الهيكلي الرئيسي للفيروسات (الجزيئات الفيروسية الكاملة) عبارة عن قفيصة نووية، أي. حالة البروتين (القفيصة) التي تحتوي على الجينوم الفيروسي (DNA أو RNA). القفيصة النووية لمعظم الفصائل الفيروسية محاطة بغلاف من البروتين الدهني. بين الغلاف والقفيصة النووية لبعض الفيروسات (ortho-، paramyxo-، rhabdo-، phylo- والفيروسات القهقرية) يوجد بروتين مصفوفي غير غليكوزيلاتي يعطي صلابة إضافية للفيريونات. تحتوي الفيروسات الموجودة في معظم العائلات على غلاف يلعب دورًا مهمًا في العدوى. تكتسب الفيروسات غلافها الخارجي عندما تخترق القفيصة النووية غشاء الخلية عن طريق التبرعم. يتم تشفير بروتينات الغلاف بواسطة الفيروس، ويتم أخذ الدهون من غشاء الخلية. تشكل البروتينات السكرية عادةً على شكل ثنائيات وقواطع بيبلوميرات (نتوءات) على سطح الفيروسات (الفيروسات ortho-، paramyxoviruses، rhabdo-، phylo-، Corona-، Bunya-، arena-، retroviruses). ترتبط بروتينات الاندماج الغليكوزيلاتي بالبيبلوميرات وتلعب دورًا رئيسيًا في دخول الفيروس إلى الخلية. تتكون كبسولات وأغلفة الفيروس من نسخ متعددة من نوع واحد أو أكثر من وحدات البروتين الفرعية من خلال عملية التجميع الذاتي. التفاعل في نظام البروتين البروتيني، بسبب الروابط الكيميائية الضعيفة، يؤدي إلى ارتباط الكبسولات المتناظرة. تعتمد الاختلافات بين الفيروسات في شكل وحجم الفيروسات على شكل وحجم وعدد الوحدات الفرعية البروتينية الهيكلية وطبيعة التفاعل بينها. تتكون القفيصة من العديد من الوحدات الفرعية المتميزة شكليًا (القفيصات)، والتي تم تجميعها من عديدات الببتيد الفيروسية بطريقة محددة بدقة، وفقًا لمبادئ هندسية بسيطة نسبيًا. وحدات البروتين الفرعية، التي تتصل ببعضها البعض، تشكل كبسولات من نوعين من التماثل: متساوي القياس وحلزوني. يشبه هيكل القفيصة النووية للفيروسات المغلفة بنية القفيصة النووية للفيروسات غير المغلفة. على سطح غلاف الفيروس، تتميز هياكل البروتين السكري المعبر عنها شكليا - الببلوميرات. تشتمل تركيبة القشرة الفائقة على الدهون (حتى 20-35٪) والكربوهيدرات (حتى 7-8٪) من أصل خلوي. وهو يتألف من طبقة مزدوجة من الدهون الخلوية والبروتينات الخاصة بالفيروسات الموجودة خارج وداخل الطبقة الحيوية الدهنية. يتم تمثيل الطبقة الخارجية لقشرة القفيصة الفائقة ببلوميرات (نتوءات) من نوع واحد أو أكثر، تتكون من واحد أو أكثر من جزيئات البروتين السكري. غالبًا ما يُطلق على القفيصة النووية للفيروسات المغلفة اسم النواة، ويسمى الجزء المركزي من الفيروسات الذي يحتوي على الحمض النووي بالنواة. تتكون القسيمات القسيمية (peplomers) من وحدات هيكلية مبنية من واحدة أو عدة سلاسل بولي ببتيد متجانسة أو غير متجانسة (وحدات فرعية من البروتين). تصنيف الفيروسات القفيصات متساوية القياس ليست مجالات، ولكن متعددات الوجوه العادية (عشرونية الوجوه). أبعادها الخطية متطابقة على طول محاور التماثل. وفقا لكاسبر وكلوغ (1962)، فإن القسيمات القفيصية في القفيصات مرتبة وفقا لتماثل عشروني الوجوه. تتكون هذه الكبسولات من وحدات فرعية متطابقة تشكل المجسم العشروني. ولها 12 رأسًا (زوايا)، و30 وجهًا، و20 سطحًا على شكل مثلثات متساوية الساقين. ووفقا لهذه القاعدة، تتكون قفيصة فيروس شلل الأطفال وفيروس مرض الحمى القلاعية من 60 وحدة هيكلية بروتينية، تتكون كل منها من أربع سلاسل بولي ببتيد. يحل المجسم العشروني على النحو الأمثل مشكلة تعبئة الوحدات الفرعية المتكررة في هيكل مدمج صارم به الحد الأدنى للحجم. فقط تكوينات معينة من الوحدات الفرعية الهيكلية يمكنها تشكيل الأسطح وتشكيل القمم والوجوه للمجسم العشريني الوجوه الفيروسي. على سبيل المثال، تشكل الوحدات الفرعية الهيكلية للفيروس الغدي قسيمات قسيمية سداسية (سداسيات) على الأسطح والحواف، وقسيمات قسيمية خماسية السطوح (بيبتونات) على الأسطح. في بعض الفيروسات، يتشكل كلا النوعين من القسيمات القفيصية بواسطة نفس البوليبتيدات، وفي حالات أخرى - بواسطة بوليبيبتيدات مختلفة. وبما أن الوحدات الفرعية الهيكلية للفيروسات المختلفة تختلف عن بعضها البعض، فإن بعض الفيروسات تبدو أكثر سداسية، والبعض الآخر أكثر كروية. جميع الفيروسات الفقارية المعروفة المحتوية على الحمض النووي، باستثناء فيروسات الجدري، بالإضافة إلى العديد من الفيروسات المحتوية على الحمض النووي الريبي (7 عائلات)، لديها نوع مكعب من التماثل القفيصية. فيروسات Reovirus، على عكس فيروسات الفقاريات الأخرى، لها قفيصة مزدوجة (خارجية وداخلية)، يتكون كل منها من وحدات مورفولوجية. الفيروسات ذات النوع الحلزوني من التناظر لها مظهر هيكل أسطواني يشبه الخيط؛ الحمض النووي الريبي الجينومي الخاص بها له شكل حلزوني ويقع داخل القفيصة. جميع الفيروسات الحيوانية ذات التناظر الحلزوني محاطة بغلاف من البروتين الدهني. تتميز القفيصات النووية الحلزونية بالطول والقطر والخطوة الحلزونية وعدد القفيصيات في كل دورة حلزونية. وهكذا، في فيروس سينداي (الفيروس الباراميكسو)، تكون القفيصة النووية عبارة عن حلزون يبلغ طوله حوالي 1 ميكرومتر، وقطره 20 نانومتر، وقطره 5 نانومتر. تتكون القفيصة من حوالي 2400 وحدة هيكلية، كل منها عبارة عن بروتين الوزن الجزيئي الغرامي 60 د.ك. هناك 11-13 وحدة فرعية لكل دورة من الحلزون. في الفيروسات ذات النوع الحلزوني من تماثل القفيصة النووية، يضمن طي جزيئات البروتين في شكل حلزوني الحد الأقصى من التفاعل بين الوحدات الفرعية للحمض النووي والبروتين. في الفيروسات العشرينية الوجوه، يلتف الحمض النووي داخل الفيروسات ويتفاعل مع واحد أو أكثر من متعددات الببتيد الموجودة داخل القفيصة.

مضادات المستقبلات (المستقبلات) الفيروسية- بروتينات الفيريون السطحية، على سبيل المثال، الراصة الدموية، والتي ترتبط بطريقة تكميلية بالمستقبل المقابل للخلية الحساسة.

21) الطرق المناعية في الدراسات الفيروسية.

تختلف الاختبارات المصلية في قدرتها على اكتشاف فئات فردية من الأجسام المضادة. على سبيل المثال، يكتشف اختبار التراص الأجسام المضادة IgG بشكل جيد، ولكنه أقل حساسية للكشف عن الأجسام المضادة IgG. لا يتم اكتشاف تفاعلات تثبيت المتممة وانحلال الدم، التي تتطلب مكملة، بواسطة الأجسام المضادة غير المثبتة للمكملة، مثل الأجسام المضادة IgA والأجسام المضادة IgE. يتضمن تفاعل تحييد الفيروس فقط الأجسام المضادة الموجهة ضد المحددات المستضدية لسطح الفيريون المرتبط بالإمراضية. حساسية أنا م و. يتفوق على جميع الطرق الأخرى لدراسة المستضدات والأجسام المضادة؛ على وجه الخصوص، تتيح المقايسة المناعية الإشعاعية والمقايسة المناعية الإنزيمية اكتشاف وجود البروتين بكميات تقاس بالنانوجرام وحتى البيكوجرام. بمساعدة I. م و. تحديد المجموعة والتحقق من سلامة الدم (التهاب الكبد B والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية). عند زرع الأنسجة والأعضاء I. م. و. تسمح لك بتحديد توافق الأنسجة وطرق الاختبار لقمع عدم التوافق. في الطب الشرعي، يتم استخدام تفاعل كاستيلاني لتحديد نوعية البروتين وتفاعل التراص لتحديد فصيلة الدم.

تستخدم الطرق المناعية على نطاق واسع في التشخيص المختبري للأمراض المعدية. يتم أيضًا تحديد مسببات المرض بناءً على زيادة الأجسام المضادة للعامل الممرض في مصل دم النقاهة مقارنة بالعينة المأخوذة في الأيام الأولى من المرض. بناء على أنا م و. دراسة مناعة السكان ضد العدوى الجماعية، مثل الأنفلونزا، وكذلك تقييم فعالية التطعيمات الوقائية.

اعتمادا على آليتها ومراعاة نتائج I. m. و. ويمكن تقسيمها إلى ردود فعل تعتمد على ظاهرة التراص؛ ردود الفعل على أساس ظاهرة هطول الأمطار. ردود الفعل التي تنطوي على تكملة. تفاعل التعادل؛ التفاعلات باستخدام الطرق الكيميائية والفيزيائية.

ردود الفعل على أساس ظاهرة التراص. التراص هو لصق الخلايا أو الجزيئات الفردية التي تحمل مستضدًا بمساعدة المصل المناعي لهذا المستضد.

يعد تفاعل التراص البكتيري باستخدام المصل المضاد للبكتيريا المناسب أحد أبسط التفاعلات المصلية. تتم إضافة معلق من البكتيريا إلى التخفيفات المختلفة لمصل دم الاختبار وبعد وقت اتصال معين عند درجة حرارة 37° يتم تسجيل أعلى تخفيف يحدث تراص مصل الدم. يستخدم تفاعل التراص البكتيري لتشخيص العديد من الأمراض المعدية: داء البروسيلات، داء التوليميا، التيفوئيد وحمى نظيرة التيفية، الزحار العصوي، والتيفوس.

تفاعل التراص الدموي السلبي أو غير المباشر (RPHA، RNHA). ويستخدم خلايا الدم الحمراء أو المواد الاصطناعية المحايدة (على سبيل المثال، جزيئات اللاتكس)، والتي يتم امتصاص المستضدات (البكتيرية والفيروسية والأنسجة) أو الأجسام المضادة على سطحها. ويحدث تراصها عند إضافة الأمصال أو المستضدات المناسبة.

يستخدم تفاعل التراص الدموي السلبي لتشخيص الأمراض التي تسببها البكتيريا ( حمى التيفودوالحمى نظيرة التيفية، والدوسنتاريا، وداء البروسيلات، والطاعون، والكوليرا، وما إلى ذلك)، والأوالي (الملاريا)، والفيروسات (الأنفلونزا، الالتهابات الفيروسية الغدانية, التهاب الكبد الفيروسيب، الحصبة، التهاب الدماغ الذي ينقله القراد، القرم الحمى النزفيةالخ)، وكذلك لتحديد بعض الهرمونات، وتحديدها فرط الحساسيةصبورا ل الأدويةوالهرمونات مثل البنسلين والأنسولين.

يعتمد تفاعل تثبيط التراص الدموي (HAI) على ظاهرة المصل المناعي الذي يمنع (يثبط) تراص الدم في كريات الدم الحمراء بواسطة الفيروسات، ويستخدم للكشف عن الأجسام المضادة للفيروسات ومعايرتها. وهو بمثابة الطريقة الرئيسية للتشخيص المصلي للأنفلونزا والحصبة والحصبة الألمانية، النكاف، التهاب الدماغ الذي ينقله القراد وغيرها من الالتهابات الفيروسية، والعوامل المسببة لها خصائص تراص الدم. على سبيل المثال، من أجل التشخيص المصلي لالتهاب الدماغ الذي ينتقل عن طريق القراد، يتم صب تخفيفات مضاعفة من مصل المريض في محلول بورات قلوي منظم في فتحات اللوحة. ثم تتم إضافة كمية معينة، عادة 8 وحدات AU (وحدات تراص)، من مستضد التهاب الدماغ الذي يحمله القراد وبعد 18 ساعة من التعرض عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، تتم إضافة معلق من خلايا الدم الحمراء المحضرة في محلول حمضي مخزن بالفوسفات. . إذا كان مصل دم المريض يحتوي على أجسام مضادة لفيروس التهاب الدماغ الذي ينقله القراد، فسيتم تحييد المستضد ولا يحدث تراص خلايا الدم الحمراء.

ردود الفعل على أساس ظاهرة هطول الأمطار. يحدث هطول الأمطار نتيجة لتفاعل الأجسام المضادة مع المستضدات القابلة للذوبان. إن أبسط مثال على تفاعل الترسيب هو التكوين في أنبوب اختبار لنطاق ترسيب معتم عند حدود طبقة المستضد على الجسم المضاد. يتم استخدام أنواع مختلفة من تفاعلات الترسيب في الأجار شبه السائل أو المواد الهلامية الاغاروزية على نطاق واسع (طريقة الانتشار المناعي المزدوج وفقًا لـ Ouchterlohn، طريقة الانتشار المناعي الشعاعي، الرحلان المناعي)، وهي ذات طبيعة نوعية وكمية. نتيجة للانتشار الحر للمستضدات والأجسام المضادة في الجل في منطقة النسبة المثلى لها، يتم تشكيل مجمعات محددة - نطاقات هطول الأمطار، والتي يتم اكتشافها بصريا أو عن طريق تلطيخ. ومن السمات الخاصة لهذه الطريقة أن كل زوج من المستضدات والأجسام المضادة يشكل نطاق ترسيب فردي، ولا يعتمد التفاعل على وجود مستضدات وأجسام مضادة أخرى في النظام قيد الدراسة.

ردود الفعل التي تنطوي على مكمل، والذي يستخدم كمصل الدم الطازج خنزير غينيا، تعتمد على قدرة المكون الفرعي المكمل Clq ثم المكونات التكميلية الأخرى على الارتباط بالمجمعات المناعية.

يسمح تفاعل التثبيت المتمم (CFR) بمعايرة المستضدات أو الأجسام المضادة وفقًا لدرجة التثبيت المتمم بواسطة مركب المستضد والجسم المضاد. يتكون هذا التفاعل من مرحلتين: تفاعل المستضد مع مصل دم الاختبار (نظام الاختبار) وتفاعل المصل الانحلالي مع خلايا الدم الحمراء للأغنام (نظام المؤشر). مع رد فعل إيجابي في النظام قيد الدراسة، يحدث تثبيت مكمل، ثم مع إضافة كريات الدم الحمراء الحساسة بواسطة الأجسام المضادة، لا يتم ملاحظة انحلال الدم. يستخدم التفاعل في التشخيص المصلي لمرض الزهري (تفاعل فاسرمان)، والالتهابات الفيروسية والبكتيرية.

يعتمد تفاعل التعادل على قدرة الأجسام المضادة على تحييد وظائف محددة معينة للجزيئات الكبيرة أو المستضدات القابلة للذوبان، على سبيل المثال، نشاط الإنزيم، والسموم البكتيرية، والقدرة على الإمراض الفيروسي. يمكن تقييم تفاعل تحييد السموم من خلال التأثير البيولوجي، على سبيل المثال، يتم معايرة الأمصال المضادة للكزاز والمضادة للبوتولينوم. إن خليط السم والمصل المضاد الذي يُعطى للحيوانات لا يسبب موتها. يتم استخدام إصدارات مختلفة من تفاعل التعادل في علم الفيروسات. عن طريق خلط الفيروسات مع المصل المضاد المناسب وإدخال هذا الخليط في الحيوانات أو في مزارع الخلايا، يتم تحييد القدرة المرضية للفيروسات ولا تمرض الحيوانات، ولا يتم تدمير خلايا المزارع.

التفاعلات باستخدام التسميات الكيميائية والفيزيائية. يتضمن التألق المناعي استخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروكروم، وبشكل أكثر دقة، جزء الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة IgG. يشكل الجسم المضاد المسمى بالفلوروكروم مركبًا من مستضد-جسم مضاد مع مستضد، والذي يصبح متاحًا للمراقبة تحت المجهر في الأشعة فوق البنفسجية التي تثير الفلوروكروم. يستخدم تفاعل التألق المناعي المباشر لدراسة المستضدات الخلوية، والكشف عن الفيروس في الخلايا المصابة، والكشف عن البكتيريا والريكتسيات في المسحات.

يتم استخدام طريقة التألق المناعي غير المباشر على نطاق واسع. يعتمد على اكتشاف مجمع المستضد والجسم المضاد باستخدام مصل مناعي مضيء ضد الأجسام المضادة IgG ويستخدم للكشف ليس فقط عن المستضدات، ولكن أيضًا عن الأجسام المضادة المعايرة.

تعتمد طرق الإنزيم المناعي، أو الإنزيم المناعي، على استخدام الأجسام المضادة المترافقة مع الإنزيمات، وخاصة بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوية. على غرار التألق المناعي، يتم استخدام طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية للكشف عن المستضدات في الخلايا أو معايرة الأجسام المضادة على الخلايا التي تحتوي على المستضد.

تعتمد طريقة المناعة الإشعاعية على استخدام ملصقات النظائر المشعة للمستضدات أو الأجسام المضادة. وهي الطريقة الأكثر حساسية لتحديد المستضدات والأجسام المضادة، وتستخدم لتحديد الهرمونات، المواد الطبيةوالمضادات الحيوية لتشخيص الأمراض البكتيرية والفيروسية والريكتسية والأوالي ودراسة بروتينات الدم ومستضدات الأنسجة.

يتم استخدام اللطخة المناعية للكشف عن الأجسام المضادة للمستضدات الفردية أو "للتعرف" على المستضدات من الأمصال المعروفة. تتكون الطريقة من 3 مراحل: فصل الجزيئات البيولوجية الكبيرة (على سبيل المثال، الفيروس) إلى بروتينات فردية باستخدام الترحيل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد؛ نقل البروتينات المنفصلة من الجل إلى مادة داعمة صلبة (لطخة) عن طريق وضع لوحة جل بولي أكريلاميد على ورق منشط أو نيتروسليلوز (نشاف كهربائي)؛ الكشف عن البروتينات المطلوبة على الركيزة باستخدام المقايسة المناعية الإنزيمية المباشرة أو غير المباشرة. يتم استخدام اللطخة المناعية كوسيلة لتشخيص الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. إن الكشف عن الأجسام المضادة لأحد بروتينات الغلاف الخارجي للفيروس له قيمة تشخيصية.

22) أنواع تماثل الفيروسات (مكعب، حلزوني، مختلط). تفاعل البروتينات والأحماض النووية أثناء تعبئة الجينومات الفيروسية.

اعتمادا على تفاعل القفيصة مع الحمض النووي، يمكن تقسيم الجسيمات الفيروسية إلى عدة أنواع من التماثل:

1). نوع مكعب من التماثل.

الكبسولات المكعبة عبارة عن إيكوسايدرات لها حوالي 20 سطحًا مثلثًا و12 رأسًا. إنها تشكل هيكلًا يشبه التكوين الكروي، ولكنه في الحقيقة متعدد السطوح. في بعض الحالات، تكون تكوينات البروتين الدهني الخاصة التي تسمى الأشواك مرتبطة برؤوس متعددات الوجوه ذات العشرين وجهًا. من المفترض أن يقتصر دور هذه المسامير على تفاعل الفيروسات أو الجزيئات الفيروسية مع المناطق المقابلة من الخلايا المضيفة الحساسة لها. مع التناظر المكعب، يتم تعبئة الحمض النووي الفيروسي بإحكام (ملفوف على شكل كرة)، وتحيط به جزيئات البروتين، وتشكل متعدد السطوح (عشروني الوجوه). العشروني الوجوه هو متعدد السطوح له عشرين وجهًا مثلثًا، وله تماثل مكعب وشكل كروي تقريبًا. تشمل الفيروسات العشرونية الوجوه فيروس الهربس البسيط، والفيروسات الرجعية، وما إلى ذلك.

2). نوع دوامة من التماثل. الكبسولات الحلزونية أبسط إلى حد ما في البنية. أولئك. تغطي القفيصة التي تشكل القفيصة NA الحلزونية وتشكل أيضًا غلافًا بروتينيًا مستقرًا إلى حد ما لهذه الفيروسات. وعند استخدام المجاهر الإلكترونية عالية الدقة وطرق التحضير المناسبة، يمكن رؤية الهياكل الحلزونية على الفيروسات. مع التماثل الحلزوني للقفيصة، يشكل الحمض النووي الفيروسي شكلًا حلزونيًا (أو حلزونيًا)، مجوفًا من الداخل، كما يتم ترتيب وحدات البروتين الفرعية (القفيصية) حوله في شكل حلزوني (القفيصة الأنبوبية). مثال على الفيروسات ذات القفيصة الحلزونية المتماثلة هو فيروس فسيفساء التبغ، وهو على شكل قضيب ويبلغ طوله 300 نانومتر وقطره 15 نانومتر. يحتوي الجسيم الفيروسي على جزيء RNA واحد يبلغ حجمه حوالي 6000 نيوكليوتيد. تتكون القفيصة من 2000 وحدة فرعية من البروتين متطابقة مرتبة في شكل حلزوني.

3). نوع مختلط أو معقد من التماثل. وكقاعدة عامة، يتم اكتشاف هذا النوع من التماثل بشكل رئيسي بين الفيروسات البكتيرية. والأمثلة الكلاسيكية هي تلك العاثيات القولونيةأو العاثيات المعتدلة. هذه تشكيلات معقدة لها رأس ذو محتوى نووي داخلي، وأنواع مختلفة من الزوائد، وعملية ذيلية، وأجهزة بدرجات متفاوتة من التعقيد. ويتمتع كل مكون من هذه الجزيئات بوظيفة محددة تتحقق أثناء تفاعل الفيروس مع الخلية. بمعنى آخر، النوع المعقد من التناظر هو مزيج من التناظر المكعب، والرأس عبارة عن متعدد السطوح إيكوسيدر والتكوينات على شكل قضيب هي عمليات الذيل. على الرغم من وجود فيروسات منظمة بكل بساطة بين الفيروسات البكتيرية، وهي عبارة عن كبسولات نووية بدائية، كروية أو مكعبة الشكل. تعتبر الفيروسات البكتيرية هي الأكثر تعقيدا مقارنة بالفيروسات النباتية والفيروسات الحيوانية.

24) تفاعل العاثيات مع الخلية. العاثيات الخبيثة والمعتدلة.

الامتزاز.

يبدأ التفاعل بالتصاق الجزيئات الفيروسية بسطح الخلية. وتصبح العملية ممكنة في وجود مستقبلات مناسبة على سطح الخلية ومضادات للمستقبلات على سطح الجسيم الفيروسي.

تستخدم الفيروسات مستقبلات خلوية مصممة للنقل المواد الضرورية: جزيئات المغذيات، الهرمونات، عوامل النمو، الخ.

المستقبلات: البروتينات والكربوهيدرات المكونة للبروتينات والدهون والدهون. تحدد مستقبلات محددة المصير الإضافي للجسيم الفيروسي (النقل والتوصيل إلى مناطق السيتوبلازم أو النواة). ويمكن للفيروس أيضًا أن يرتبط بمستقبلات غير محددة، بل ويخترق الخلية. ومع ذلك، فإن هذه العملية لا تسبب تطور العدوى.

أولاً، يتم تشكيل رابطة واحدة بين المستقبل المضاد والمستقبل. مثل هذا الاتصال هش ويمكن كسره. لتكوين امتزاز لا رجعة فيه، يعد الارتباط متعدد التكافؤ ضروريًا. يحدث الارتباط المستقر بسبب الحركة الحرة لجزيئات المستقبلات في الغشاء. عندما يتفاعل الفيروس مع الخلية، يتم ملاحظة زيادة في سيولة الدهون وتكوين حقول مستقبلات في منطقة التفاعل بين الفيروس والخلية. يمكن أن تتواجد مستقبلات بعض الفيروسات فقط في مجموعة محدودة من الخلايا المضيفة. وهذا ما يحدد حساسية الجسم لهذا الفيروس. وبالتالي، فإن الحمض النووي الفيروسي والحمض النووي الريبي (RNA) لديهما القدرة على إصابة نطاق أوسع من الخلايا المضيفة.

يمكن العثور على مضادات المستقبلات في عضيات فيروسية فريدة من نوعها: هياكل الزوائد في العاثيات التائية، والألياف في الفيروسات الغدية، والأشواك على سطح الأغشية الفيروسية، والإكليل في فيروسات كورونا.

اختراق.

2 آليات – الالتقام المستقبلي واندماج الأغشية.

الالتقام المستقبلي:

الآلية المعتادة لدخول العناصر الغذائية والمواد التنظيمية إلى الخلية. يحدث في مناطق متخصصة – حيث توجد حفر خاصة مغطاة بالكلاثرين، وفي أسفل الحفرة توجد مستقبلات محددة. توفر الحفر غزوًا سريعًا وتكوين فجوات مغلفة بالكلاثرين (لا يمر أكثر من 10 دقائق من لحظة الامتزاز؛ ويمكن أن يتشكل ما يصل إلى 2000 فجوة في دقيقة واحدة). تندمج الفجوات مع فجوات سيتوبلازمية أكبر لتشكل المستقبلات (التي لم تعد تحتوي على الكلاثرين)، والتي تندمج بدورها مع الليزوزومات.

اندماج الأغشية الفيروسية والخلوية:

في الفيروسات المغلفة، يحدث الاندماج بسبب التفاعلات النقطية للبروتين الفيروسي مع الدهون الموجودة في غشاء الخلية، ونتيجة لذلك يتكامل غلاف البروتين الدهني الفيروسي مع غشاء الخلية. في الفيروسات غير المغلفة، يتفاعل أحد البروتينات السطحية أيضًا مع الدهون أغشية الخلاياويمر المكون الداخلي عبر الغشاء (في الفيروسات المخاطانية - البروتين F، في الفيروسات المخاطية - الوحدة الفرعية للتراص الدموي HA2). يتأثر تشكيل البروتينات السطحية بدرجة الحموضة.

يجرد.

خلال هذه العملية، يختفي النشاط المعدي، وغالبًا ما تظهر الحساسية تجاه النيوكلياز، وتنشأ مقاومة للأجسام المضادة. المنتج النهائي لخلع الملابس هو الأحماض النووية المرتبطة بالبروتين الفيروسي الداخلي. كما تحد مرحلة خلع الملابس من احتمالية الإصابة بالعدوى (الفيروسات غير قادرة على خلع ملابسها في كل خلية). يحدث التعري في مناطق متخصصة من الخلية: الجسيمات الحالة، جهاز جولجي، الفضاء المحيط بالنواة.

يحدث خلع الملابس نتيجة لعدد من ردود الفعل. على سبيل المثال، في الفيروسات البيكورناوية، يحدث الخلع مع تكوين جزيئات تحت الفيروسية متوسطة بأحجام تتراوح من 156 إلى 12S. في الفيروسات الغدية في السيتوبلازم والمسام النووية ولها ثلاث مراحل على الأقل:

تكوين جزيئات تحت الفيروس ذات كثافة أعلى من كثافة الفيروسات؛

تكوين النوى التي تفتقر إلى 3 بروتينات فيروسية؛

تكوين مركب بروتيني DNA يرتبط فيه DNA تساهميًا ببروتين طرفي.

خصائص العاثيات الخبيثة والمعتدلة.

عندما تصاب البكتيريا بالعاثية، يحدث ما يسمى بالعدوى التحللية، أي عدوى تنتهي بتحلل الخلية المضيفة، ولكن هذا مميز فقط لما يسمى بالعاثيات الخبيثة، والتي يتفاعل تفاعلها مع العاثيات. تؤدي الخلية إلى موت الخلايا وتكوين ذرية العاثيات.

وفي هذه الحالة يتم تمييز المراحل التالية حسب تفاعلات العاثيات مع الخلية: خلط العاثيات مع مزرعة الخلية (تعدد العدوى هو عاثية واحدة لكل 10 خلايا)، ويجب أن يكون التركيز عالياً بما يكفي للسماح بالعاثيات للاتصال بالخلايا. حتى لا يحدث ذلك إعادة العدوى– بعد الإصابة لمدة أقصاها 5 دقائق، عندما يتم امتصاص العاثيات، يتم تخفيف هذا الخليط من الخلايا والعاثية. هناك فترة كامنة لا يزيد خلالها عدد العاثيات، ثم فترة إطلاق قصيرة جدًا، عندما يزيد عدد جزيئات العاثيات بشكل حاد، عندما يتم تفكيك الخلية وإطلاق ذرية العاثيات، ثم عدد العاثيات يبقى على نفس المستوى، لأنه لا تحدث الإصابة مرة أخرى. استناداً إلى هذا المنحنى، يمكننا التمييز بين هذه المراحل: الفترة الخضرية "للنمو" (الفترة الكامنة)، وفترة الإطلاق، وحساب إنتاج الملتهمة لكل خلية مصابة. خلال فترة الكمون لا يمكن اكتشاف أي شيء يشبه جزيئات العاثيات في البكتيريا ولا يمكن عزلها من هذه الخلايا الموجودة في الفترة الكامنةبداية معدية. فقط جزيئات العاثيات الناضجة هي القادرة على التسبب في عدوى البكتيريا. وبالتالي، تتسبب العاثيات الخبيثة دائمًا في موت البكتيريا وتنتج العدوى، والتي تظهر في إنتاج جزيئات فيروسية جديدة قادرة على إصابة الخلايا التالية والخلايا الأخرى الحساسة لها.

على عكس الفيروسات الخبيثة، فإن الإصابة بالعاثيات المعتدلة لا تؤدي إلى تحلل الخلايا البكتيرية، ولكن يتم تحقيق تكوين حالة خاصة من التعايش بين العاثيات والخلية البكتيرية. يتم التعبير عن هذا التعايش في حقيقة وجود بداية معينة للعاثية في الخلية البكتيرية دون أي ظروف غير مواتية لها ويتم الحفاظ عليها من جيل إلى جيل. في مراحل معينة من هذا التعايش، يتم تنشيط العاثيات في الخلية وتدخل في حالة دورة التطور التحللي، مما يسبب تحلل الخلية وإطلاق ذرية العاثيات. تسمى هذه العاثيات بالعاثيات اللايسوجينية أو العاثيات المعتدلة، وحالة الوجود المعتدل مع العاثيات هي اللايسوجينية، والبكتيريا التي تحتوي على مثل هذه العاثيات المخفية هي البكتيريا اللايسوجينية. مصطلح البكتيريا اللايسوجينية جاء من حقيقة أنه تم اكتشاف مزارع ظهرت فيها العاثيات تلقائيًا، وبدأ اعتبار هذه العاثيات بمثابة تلوث للثقافة، أي أنها تدخل إلى المزرعة فيروس بكتيري، وتسمى هذه الثقافات lysogenic، أي أنها تولد التحلل.

طرق دراسة بيولوجيا الفيروسات وتحديد هويتها. في علم الفيروسات، يتم استخدام أساليب البيولوجيا الجزيئية على نطاق واسع، والتي من خلالها كان من الممكن إنشاء التركيب الجزيئي للجزيئات الفيروسية، وطرق اختراقها في الخلية وميزات التكاثر الفيروسي، والبنية الأولية للأحماض النووية الفيروسية والبروتينات. يجري تطوير طرق لتحديد تسلسل العناصر المكونة للأحماض النووية الفيروسية والأحماض الأمينية البروتينية. يصبح من الممكن ربط وظائف الأحماض النووية والبروتينات التي تشفرها مع تسلسل النيوكليوتيدات وتحديد أسباب العمليات داخل الخلايا التي تلعب دورًا مهمًا في التسبب في العدوى الفيروسية.

تعتمد طرق البحث الفيروسي أيضًا على العمليات المناعية (تفاعل المستضد مع الأجسام المضادة)، والخصائص البيولوجية للفيروس (القدرة على التراص الدموي، وانحلال الدم، والنشاط الأنزيمي)، وخصائص تفاعل الفيروس مع الخلية المضيفة (طبيعة تأثير الاعتلال الخلوي). ، وتشكيل شوائب داخل الخلايا، وما إلى ذلك).

في تشخيص الالتهابات الفيروسية، في زراعة وعزل وتحديد الفيروسات، وكذلك في إنتاج مستحضرات اللقاحات، يتم استخدام طريقة زراعة الأنسجة والخلايا على نطاق واسع. يتم استخدام مزارع الخلايا الأولية والثانوية والمستقرة والمستمرة وثنائية الصبغية. يتم الحصول على الثقافات الأولية عن طريق تفريق الأنسجة مع الإنزيمات المحللة للبروتين (التربسين، كولاجيناز). يمكن أن يكون مصدر الخلايا هو الأنسجة والأعضاء (عادة الكلى) للأجنة البشرية والحيوانية. يتم وضع الخلايا المعلقة في وسط غذائي في ما يسمى بالمراتب أو الزجاجات أو أطباق بيتري، حيث تبدأ الخلايا في التكاثر بعد التصاقها بسطح الوعاء. بالنسبة لعدوى الفيروس، عادة ما يتم استخدام طبقة أحادية الخلية. يتم تصريف السائل المغذي، ويضاف المعلق الفيروسي في تخفيفات معينة، وبعد الاتصال بالخلايا، يضاف وسط مغذي طازج، عادة بدون مصل.

يمكن إجراء زراعة فرعية لخلايا معظم المزارع الأولية، وتسمى هذه المزرعة بالمزرعة الثانوية. مع مرور المزيد من الخلايا، يتم تشكيل مجموعة من الخلايا الشبيهة بالألياف الليفية، قادرة على التكاثر السريع، ويحتفظ معظمها بالمجموعة الأصلية من الكروموسومات. هذه هي ما يسمى الخلايا ثنائية الصبغية. عن طريق زراعة الخلايا بشكل تسلسلي، يتم الحصول على ثقافات الخلايا المستمرة المستقرة. أثناء الممرات، تظهر الخلايا المتجانسة التي تنقسم بسرعة مع مجموعة من الكروموسومات غير المتجانسة. يمكن أن تكون خطوط الخلايا المستقرة أحادية الطبقة أو معلقة. تنمو المزارع أحادية الطبقة على شكل طبقة متواصلة على السطح الزجاجي، بينما تنمو المزارع المعلقة على شكل معلقات في أوعية مختلفة باستخدام أجهزة الخلط. هناك أكثر من 400 خط خلوي مشتق من 40 نوعًا حيوانيًا مختلفًا (بما في ذلك الرئيسيات والطيور والزواحف والبرمائيات والأسماك والحشرات) والبشر.

يمكن زراعة قطع من الأعضاء والأنسجة الفردية (مزارع الأعضاء) في وسائط مغذية صناعية. تحافظ هذه الأنواع من المزارع على بنية الأنسجة، وهو أمر مهم بشكل خاص لعزل ومرور الفيروسات التي لا تتكاثر في مزارع الأنسجة غير المتمايزة (على سبيل المثال، الفيروسات التاجية).

في مزارع الخلايا المصابة، يمكن اكتشاف الفيروسات عن طريق التغيرات في شكل الخلية، وتأثيرات الاعتلال الخلوي، والتي قد تكون محددة، وظهور الشوائب، عن طريق تحديد المستضدات الفيروسية في الخلية وفي سائل المزرعة؛ تحديد الخصائص البيولوجية للذرية الفيروسية في سائل الاستنبات ومعايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة أو أجنة الدجاج أو الحيوانات الحساسة؛ من خلال تحديد الأحماض النووية الفيروسية الفردية في الخلايا عن طريق التهجين الجزيئي أو تراكم الأحماض النووية بالطريقة الكيميائية الخلوية باستخدام المجهر الفلوري.

تعد عملية عزل الفيروسات عملية كثيفة العمالة وتستغرق وقتًا طويلاً. يتم إجراؤها لتحديد نوع أو متغير الفيروس المنتشر بين السكان (على سبيل المثال، لتحديد متغير مصلي لفيروس الأنفلونزا، أو سلالة برية أو لقاح لفيروس شلل الأطفال، وما إلى ذلك)؛ في الحالات التي يكون فيها من الضروري اتخاذ تدابير وبائية عاجلة؛ عند ظهور أنواع أو أشكال جديدة من الفيروسات؛ إذا لزم الأمر، تأكيد التشخيص الأولي. للإشارة إلى الفيروسات في الكائنات البيئية. عند عزل الفيروسات، يؤخذ في الاعتبار احتمالية بقائها في جسم الإنسان، وكذلك حدوث عدوى مختلطة ناجمة عن فيروسين أو أكثر. تسمى المجموعة المتجانسة وراثيا من الفيروس التي يتم الحصول عليها من فيروس واحد بالاستنساخ الفيروسي، وتسمى عملية الحصول عليها بالاستنساخ.

لعزل الفيروسات، يتم استخدام إصابة حيوانات المختبر الحساسة وأجنة الدجاج، ولكن في أغلب الأحيان يتم استخدام زراعة الأنسجة. يتم تحديد وجود الفيروس عادة من خلال انحطاط خلايا معين (تأثير الاعتلال الخلوي)، وتكوين السيمبلاست والمخلى، والكشف عن الشوائب داخل الخلايا، بالإضافة إلى مستضد محدد تم اكتشافه باستخدام التألق المناعي، والامتصاص الدموي، والتراص الدموي (للفيروسات المتراصة للدم)، وما إلى ذلك. . لا يمكن اكتشاف هذه العلامات إلا بعد 2-3 مقاطع من الفيروس.

لعزل عدد من الفيروسات، مثل فيروسات الأنفلونزا، يتم استخدام أجنة الدجاج، ولعزل بعض فيروسات كوكساكي وعدد من الفيروسات المفصلية، يتم استخدام الفئران حديثة الولادة. يتم التعرف على الفيروسات المعزولة باستخدام التفاعلات المصلية وطرق أخرى.

عند العمل مع الفيروسات، يتم تحديد عيارها. عادة ما يتم إجراء معايرة الفيروسات في زراعة الأنسجة، وتحديد أعلى تخفيف للسائل المحتوي على الفيروس والذي يحدث فيه تنكس الأنسجة، وتتشكل الشوائب والمستضدات الخاصة بالفيروس. يمكن استخدام طريقة البلاك لمعايرة عدد من الفيروسات. اللويحات، أو المستعمرات السلبية للفيروسات، هي بؤر للخلايا التي دمرها الفيروس في مزرعة نسيجية أحادية الطبقة تحت طبقة أجار. يسمح عد المستعمرات بإجراء تحليل كمي للنشاط المعدي للفيروسات على أساس أن جزيء فيروس معدي واحد يشكل لوحة واحدة. يتم الكشف عن لويحات عن طريق تلطيخ الثقافة مع الأصباغ intravital، وعادة ما تكون حمراء محايدة؛ لا تمتص اللويحات الصبغة وبالتالي تظهر على شكل بقع ضوئية على خلفية الخلايا الحية الملطخة. يتم التعبير عن عيار الفيروس بعدد وحدات تشكيل البلاك لكل 1 مل.

يتم عادةً تنقية الفيروسات وتركيزها عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي يليه الطرد المركزي للتركيز أو التدرج في الكثافة. لتنقية الفيروسات، يتم استخدام الطرق المناعية، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني، الممتزات المناعية، وما إلى ذلك.

يشمل التشخيص المختبري للعدوى الفيروسية الكشف عن العامل الممرض أو مكوناته في المواد السريرية؛ عزل الفيروس من هذه المادة؛ التشخيص المصلي. يعتمد اختيار طريقة التشخيص المختبري في كل حالة على حدة على طبيعة المرض وفترة المرض وإمكانيات المختبر. يعتمد التشخيص الحديث للعدوى الفيروسية على طرق صريحة تتيح الحصول على إجابة بعد عدة ساعات من تناول المواد السريرية في المراحل المبكرة بعد المرض، وتشمل هذه الطرق الفحص الإلكتروني والمجهر الإلكتروني المناعي، بالإضافة إلى التألق المناعي، وهي طريقة التهجين الجزيئي. الكشف عن الأجسام المضادة لفئة IgM وما إلى ذلك.

يتيح الفحص المجهري الإلكتروني للفيروسات ذات اللون السلبي إمكانية التمييز بين الفيروسات وتحديد تركيزها. يقتصر استخدام المجهر الإلكتروني في تشخيص الالتهابات الفيروسية على الحالات التي يكون فيها تركيز الجزيئات الفيروسية في المواد السريرية مرتفعًا جدًا (10 5 في 1) ملوأعلى). عيب هذه الطريقة هو عدم القدرة على التمييز بين الفيروسات التي تنتمي إلى نفس المجموعة التصنيفية. ويتم التغلب على هذا النقص عن طريق استخدام المجهر الإلكتروني المناعي. تعتمد الطريقة على تكوين مجمعات مناعية عن طريق إضافة مصل محدد إلى الجزيئات الفيروسية، مع تركيز الجزيئات الفيروسية في الوقت نفسه، مما يسمح بالتعرف عليها. تُستخدم الطريقة أيضًا للكشف عن الأجسام المضادة. لأغراض التشخيص السريع، يتم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني لمستخلصات الأنسجة والبراز والسوائل من الحويصلات وإفرازات البلعوم الأنفي. يُستخدم المجهر الإلكتروني على نطاق واسع لدراسة تكوّن الفيروس، ويتم توسيع قدراته باستخدام الأجسام المضادة الموسومة.

إن طريقة التهجين الجزيئي، التي تعتمد على اكتشاف الأحماض النووية الخاصة بالفيروس، تجعل من الممكن اكتشاف نسخ مفردة من الجينات ولا مثيل لها في الحساسية. يعتمد التفاعل على تهجين خيوط DNA أو RNA التكميلية (المسبارات) وتشكيل هياكل مزدوجة الجديلة. أرخص مسبار هو استنساخ الحمض النووي المؤتلف. يتم تمييز المسبار بالسلائف المشعة (عادةً الفوسفور المشع). استخدام ردود الفعل اللونية واعدة. هناك عدة خيارات للتهجين الجزيئي: التهجين الموضعي، والتهجين البقعي، والتهجين الساندويتش، والتهجين الموضعي، وما إلى ذلك.

تظهر الأجسام المضادة من فئة IgM في وقت أبكر من الأجسام المضادة من الفئة G (في اليوم الثالث إلى الخامس من المرض) وتختفي بعد بضعة أسابيع، لذلك يشير اكتشافها إلى وجود عدوى حديثة. يتم الكشف عن الأجسام المضادة من فئة lgM عن طريق التألق المناعي أو عن طريق المقايسة المناعية الإنزيمية باستخدام الأمصال المضادة لـ μ (الأمصال ضد السلاسل الثقيلة من lgM).

تعتمد الطرق المصلية في علم الفيروسات على التفاعلات المناعية الكلاسيكية (انظر طرق البحث المناعية) : تفاعلات التثبيت التكميلي، تثبيط التراص الدموي، المعادلة البيولوجية، الانتشار المناعي، التراص الدموي غير المباشر، انحلال الدم الشعاعي، التألق المناعي، المقايسة المناعية الإنزيمية، المقايسة المناعية الإشعاعية. وقد تم تطوير أساليب ميكروية للعديد من التفاعلات، ويجري تحسين تقنياتها باستمرار. تستخدم هذه الطرق للتعرف على الفيروسات باستخدام مجموعة من الأمصال المعروفة وللتشخيص المصلي لتحديد زيادة الأجسام المضادة في المصل الثاني مقارنة بالأول (يؤخذ المصل الأول في الأيام الأولى بعد المرض، والثاني - بعد 2- 3 أسابيع). القيمة التشخيصية لا تقل عن أربعة أضعاف زيادة الأجسام المضادة في المصل الثاني. إذا كان الكشف عن الأجسام المضادة من فئة IgM يشير إلى وجود عدوى حديثة، فإن الأجسام المضادة من فئة IgC تستمر لعدة سنوات، وأحيانًا مدى الحياة.

لتحديد المستضدات الفردية للفيروسات والأجسام المضادة لها في مخاليط معقدة دون تنقية أولية للبروتينات، يتم استخدام التطعيم المناعي. تجمع هذه الطريقة بين تجزئة البروتين باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد مع الإشارة المناعية اللاحقة للبروتينات باستخدام طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية. يقلل فصل البروتين من متطلبات النقاء الكيميائي للمستضد ويجعل من الممكن تحديد أزواج المستضد والأجسام المضادة الفردية. هذه المهمة ذات صلة، على سبيل المثال، في التشخيص المصلي لعدوى فيروس العوز المناعي البشري، حيث تحدث تفاعلات مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم إيجابية كاذبة بسبب وجود أجسام مضادة للمستضدات الخلوية، والتي تكون موجودة نتيجة لعدم كفاية تنقية البروتينات الفيروسية. إن تحديد الأجسام المضادة في أمصال المريض للمستضدات الفيروسية الداخلية والخارجية يجعل من الممكن تحديد مرحلة المرض، وعند تحليل المجموعات السكانية، تحديد تباين البروتينات الفيروسية. يتم استخدام اللطخة المناعية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري كاختبار تأكيدي لتحديد المستضدات الفيروسية الفردية والأجسام المضادة لها. عند تحليل السكان، يتم استخدام الطريقة لتحديد تباين البروتينات الفيروسية. تكمن القيمة الكبيرة لهذه الطريقة في إمكانية تحليل المستضدات المُصنّعة باستخدام تقنية الحمض النووي المؤتلف، وتحديد أحجامها ووجود محددات المستضدات.

فهرس:بوكرينسكايا أ. علم الفيروسات، م.، 1986؛ علم الفيروسات، الأساليب، أد. ب. ميخي، العابر. من الإنجليزية، م.، 1988؛ دليل طرق البحث الميكروبيولوجية والفيروسية، أد. شهر. بيرجيرا، م.، 1982.

• - طرق تحييد النفايات المحتوية على مواد عضوية، على أساس تسخينها نتيجة للنشاط الحيوي للكائنات الحية الدقيقة الهوائية المحبة للحرارة...

  الموسوعة الطبية

• - الطرق النسيجية الكيميائيةالكشف عن الإنزيمات بناءً على تفاعل تكوين رواسب فوسفات الكالسيوم أو المغنيسيوم في مواقع التوطين النشاط الأنزيميعند احتضان أقسام الأنسجة مع العضوية ...

  الموسوعة الطبية

• - طرق التعرف على المنسجات في المستحضرات الأنسجة العصبيةو مختلف الأجهزةباستخدام محاليل الفضة الأمونيا أو الفضة البيريدين...

  الموسوعة الطبية

• - طرق تقييم الافتراضات حول طبيعة الميراث، بناءً على مقارنة النسب الملحوظة والمتوقعة للمرضى والأصحاء في الأسر المثقلة بالأمراض الوراثية، مع مراعاة الطريقة...

  الموسوعة الطبية

• - تستخدم لدراسة تركيب ووظيفة الخلايا والأنسجة لدى الإنسان والحيوان والكائنات النباتية في الظروف الطبيعية والمرضية والتجريبية...

  الموسوعة الطبية

• - طرق التعرف على المواد الكيميائية في المقاطع النسيجية. جزء لا يتجزأ من G. م و. هي الطرق الكيميائية الخلوية التي تكشف المواد الكيميائيةفي خلايا المسحات والمطبوعات المجهزة...

  الموسوعة الطبية

• - طرق التحديد الكمي والنوعي للجلوكوز في الدم والبول بناءً على أكسدة الجلوكوز بواسطة الأكسجين الجوي في وجود إنزيم الجلوكوز أوكسيديز...

  الموسوعة الطبية

• - طرق التشخيصدراسات تعتمد على التفاعل النوعي بين المستضدات والأجسام المضادة.

  الموسوعة الطبية

• - طرق تحديد الهياكل الليفية النسيج الضاموالدبقية العصبية في المستحضرات النسيجية اعتماداً على تعدد ألوانها...

  الموسوعة الطبية

• - 1) طريقة صبغ المستحضرات النسيجية للأدمة باستخدام هيمالون ماير، وهو محلول شب البوتاسيوم والرودامين؛ نواة الخلية ملطخة لون ازرق، إيليدين - باللون الأحمر ...

  الموسوعة الطبية

• - في الطب - مجموعة من أساليب الدراسة الكمية والتحليل لحالة وسلوك الأشياء والأنظمة المتعلقة بالطب والرعاية الصحية...

  الموسوعة الطبية

• - طرق دراسة الأجسام المختلفة باستخدام المجهر...

  الموسوعة الطبية

• - تقوم على استخدام قوانين البصريات المتعلقة بطبيعة وانتشار وتفاعل مادة الإشعاع الكهرومغناطيسي في المدى البصري...

  الموسوعة الطبية

• - طرق دراسة وتقييم جودة الأشياء البيئية باستخدام الحواس...

  الموسوعة الطبية

• - الاسم العام لعدد من طرق تشريب المستحضرات النسيجية بالفضة للتعرف على الألياف الدبقية وغيرها من الألياف المحبة للأرجيروفيل...

  الموسوعة الطبية

• - يعينه المحقق والمحكمة لحل القضايا الخاصة التي تنشأ أثناء التحقيق في الجرائم والنظر في الدعاوى المدنية. كما يتم إجراؤها بناء على اقتراح الأطباء الشرعيين...

  الموسوعة الطبية

"طرق البحث الفيروسي" في الكتب

الغضب ضد آلة القتل بالاسم (1992)

الغضب ضد الآلة القتل بالاسم (1992) الألبوم الأول لمجموعة الغضب ضد الآلة في لوس أنجلوس جمع بين موسيقى الهيب هوب والروك الصلب، وأضفى عليها نكهة البيانات السياسية الموضعية، وبكل سرور، جرعة كبيرة من إيقاع الفانك الكثيف. في أغنية "Killing in the Name" المضمنة في الأغنية الأولى،

جيمس براون انهض (أشعر وكأنني أكون أ) آلة الجنس (1970)

جيمس براون انهض (أشعر وكأنني أكون أ) آلة الجنس (1970) بحلول نهاية الستينيات، بدأ جيمس براون بإجراء التجارب. أفسحت الروح المفجعة مع The Famous Flames المجال لموسيقى الفانك مع The J.B.'s. من أهم المعالم البارزة في اقتراب عصر الفانك كانت أغنية "Sex Machine"، والتي تم عرضها في نسخة مدتها عشر دقائق

الغضب ضد الآلة