Các phương pháp nghiên cứu virus học đối với các bệnh truyền nhiễm. Sao lưu nghiên cứu virus học bằng cỗ máy thời gian

Trong chẩn đoán phòng thí nghiệm nhiễm virus có ba cách tiếp cận chính

1) kiểm tra trực tiếp vật liệu để phát hiện sự hiện diện của kháng nguyên virus hoặc axit nucleic;

2) phân lập và xác định vi rút từ vật liệu lâm sàng;

Các phương pháp chẩn đoán trực tiếp bệnh phẩm lâm sàng

Phương pháp trực tiếp là phương pháp cho phép phát hiện trực tiếp vi rút, kháng nguyên vi rút hoặc axit nucleic của vi rút (NA) trong vật liệu lâm sàng, tức là nhanh nhất (2–24 giờ).

Kính hiển vi điện tử (EM). Sử dụng phương pháp này, bạn có thể tự phát hiện virus.

kính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM), sử dụng kháng thể đặc hiệu đối với virus. Do sự tương tác của kháng thể với virus, các phức hợp được hình thành, dễ phát hiện hơn sau khi tương phản âm tính.

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (RIF). Phương pháp này dựa trên việc sử dụng các kháng thể liên kết với thuốc nhuộm

Phương pháp RIF được sử dụng rộng rãi để giải mã nhanh chóng nguyên nhân gây nhiễm virus đường hô hấp cấp tính khi phân tích vết vân tay từ màng nhầy của đường hô hấp trên.

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA). Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme để xác định kháng nguyên virus về nguyên tắc tương tự như RIF, nhưng dựa trên việc đánh dấu kháng thể bằng enzyme chứ không phải thuốc nhuộm.

Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA). Phương pháp này dựa trên việc dán nhãn kháng thể bằng đồng vị phóng xạ, đảm bảo độ nhạy cao trong việc xác định kháng nguyên virus.

Các phương pháp phân tử. Ban đầu, phương pháp cổ điển để xác định bộ gen virus được coi là phương pháp lai NA có tính đặc hiệu cao, nhưng ngày nay việc phân lập bộ gen virus bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ngày càng được sử dụng nhiều hơn.

Lai phân tử của axit nucleic. Phương pháp này dựa trên sự lai ghép các chuỗi DNA hoặc RNA bổ sung với sự hình thành cấu trúc chuỗi kép và xác định chúng.

PCR dựa trên nguyên tắc sao chép DNA tự nhiên. Bản chất của phương pháp này là lặp lại nhiều chu kỳ tổng hợp (khuếch đại) trình tự DNA đặc hiệu của virus bằng cách sử dụng Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hai mồi cụ thể - được gọi là mồi.

Các phương pháp tế bào học hiện nay có giá trị chẩn đoán hạn chế nhưng vẫn nên được sử dụng cho một số bệnh nhiễm trùng. Các vật liệu khám nghiệm tử thi, sinh thiết và phết tế bào được kiểm tra, sau khi xử lý thích hợp, được nhuộm màu và phân tích dưới kính hiển vi.

Để phân lập thành công virus, vật liệu lâm sàng phải được lấy theo cơ chế bệnh sinh của bệnh nghi ngờ và trong thời gian sớm nhất có thể.

Theo quy định, họ lấy:

- Tại nhiễm trùng đường hô hấp- rửa mũi họng;

– đối với nhiễm trùng enterovirus – rửa và phân (reo-, enterovirus);

– đối với các tổn thương trên da và niêm mạc – vết xước, vết phồng rộp (herpes, thủy đậu);

– đối với nhiễm trùng ngoại ban – rửa (sởi, rubella);

– đối với nhiễm trùng arbovirus – máu, dịch não tủy.

Để phân lập virus, người ta sử dụng nuôi cấy tế bào, động vật thí nghiệm và phôi gà. Quá trình này kéo dài, đôi khi cần thực hiện nhiều bước trước khi vi-rút được phát hiện và xác định bằng một hoặc nhiều phương pháp - phản ứng trung hòa (RN), RIF, ELISA hoặc PCR.

Chẩn đoán huyết thanh

Chẩn đoán huyết thanh học, dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, có thể được sử dụng để xác định cả hai và đóng vai trò xác định nguyên nhân gây nhiễm virus ngay cả khi kết quả phân lập virus âm tính.

RSK là một trong những xét nghiệm huyết thanh truyền thống và được sử dụng để chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm virus. Hai hệ thống tham gia phản ứng: kháng thể từ huyết thanh của bệnh nhân + vi rút tiêu chuẩn và tế bào hồng cầu của cừu + kháng thể chống lại chúng, cũng như bổ thể đã được chuẩn độ. Nếu kháng thể và virus phù hợp, phức hợp này sẽ liên kết với bổ thể và sự phân giải hồng cầu cừu sẽ không xảy ra (phản ứng dương tính). Với RSC âm tính, bổ thể thúc đẩy quá trình ly giải hồng cầu. Nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy không đủ cao và khó chuẩn hóa thuốc thử, phương pháp IF, giống như ELISA, được sử dụng để xác định kháng thể trong huyết thanh.

Phương pháp nghiên cứu virus- phương pháp nghiên cứu sinh học của virus và nhận dạng chúng. Trong virus học, các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi, nhờ đó có thể thiết lập cấu trúc phân tử của các hạt virus, phương pháp xâm nhập của chúng vào tế bào và các đặc điểm sinh sản của virus, cấu trúc chính của axit nucleic và protein của virus. Các phương pháp đang được phát triển để xác định trình tự các thành phần cấu thành axit nucleic của virus và axit amin protein. Có thể liên kết các chức năng của axit nucleic và protein mà chúng mã hóa với trình tự nucleotide và xác định nguyên nhân của các quá trình nội bào có vai trò trong vai trò quan trọng trong nhiễm virus điện tử.

Các phương pháp nghiên cứu virus học còn dựa trên các quá trình miễn dịch (tương tác giữa kháng nguyên với kháng thể), đặc tính sinh học của virus (khả năng ngưng kết hồng cầu, tan máu, hoạt động của enzyme), đặc điểm tương tác của virus với tế bào chủ (bản chất của tác dụng gây bệnh tế bào). , hình thành các thể vùi nội bào, v.v.).

Trong chẩn đoán nhiễm virus, trong nuôi cấy, phân lập và xác định virus, cũng như trong sản xuất chế phẩm vắc xin, phương pháp nuôi cấy mô và tế bào được sử dụng rộng rãi. Sử dụng nuôi cấy tế bào sơ cấp, thứ cấp, ổn định liên tục và lưỡng bội. Nuôi cấy sơ cấp thu được bằng cách phân tán mô bằng enzyme phân giải protein (trypsin, collagenase). Nguồn tế bào có thể là các mô và cơ quan (thường là thận) của phôi người và động vật. Huyền phù tế bào trong môi trường dinh dưỡng được đặt trong cái gọi là nệm, chai hoặc đĩa Petri, tại đây, sau khi bám vào bề mặt của bình, các tế bào bắt đầu nhân lên. Đối với nhiễm virus, người ta thường sử dụng tế bào đơn lớp. Chất lỏng dinh dưỡng được rút ra, dịch huyền phù virus được thêm vào ở những độ pha loãng nhất định và sau khi tiếp xúc với tế bào, môi trường dinh dưỡng tươi, thường không có huyết thanh, được thêm vào.

Tế bào của hầu hết các nền văn hóa sơ cấp có thể được nuôi cấy; nền văn hóa như vậy được gọi là nền văn hóa thứ cấp. Với sự di chuyển tiếp theo của tế bào, một quần thể tế bào giống nguyên bào sợi được hình thành, có khả năng sinh sản nhanh chóng, hầu hết giữ lại bộ nhiễm sắc thể ban đầu. Đây là những cái gọi là tế bào lưỡng bội. Bằng cách nuôi cấy tế bào nối tiếp, thu được nuôi cấy tế bào liên tục ổn định. Trong quá trình di chuyển, các tế bào đồng nhất phân chia nhanh chóng với bộ nhiễm sắc thể dị bội xuất hiện. Các dòng tế bào ổn định có thể là một lớp hoặc huyền phù. Nuôi cấy một lớp phát triển dưới dạng một lớp liên tục trên bề mặt thủy tinh, trong khi nuôi cấy huyền phù phát triển dưới dạng huyền phù trong các bình khác nhau sử dụng các thiết bị trộn. Có hơn 400 dòng tế bào có nguồn gốc từ 40 loài động vật khác nhau (bao gồm linh trưởng, chim, bò sát, lưỡng cư, cá, côn trùng) và con người.

Các mảnh cơ quan và mô riêng lẻ (nuôi cấy cơ quan) có thể được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Những kiểu nuôi cấy này bảo tồn cấu trúc mô, điều này đặc biệt quan trọng đối với việc phân lập và di chuyển các loại vi-rút không sinh sản trong môi trường nuôi cấy mô không phân biệt (ví dụ: vi-rút Corona).

Ở người bị nhiễm bệnh nuôi cấy tế bào virus có thể được phát hiện bằng những thay đổi về hình thái tế bào, tác dụng gây bệnh tế bào, có thể cụ thể, sự xuất hiện của các thể vùi, bằng cách xác định kháng nguyên virus trong tế bào và trong dịch nuôi cấy; xác lập các đặc tính sinh học của dòng virus trong dịch nuôi cấy và chuẩn độ virus trong nuôi cấy mô, phôi gà hoặc động vật nhạy cảm; bằng cách xác định từng axit nucleic của virus trong tế bào bằng phương pháp lai phân tử hoặc tích lũy axit nucleic bằng phương pháp hóa học tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Phân lập virus là một quá trình tốn nhiều công sức và thời gian. Nó được thực hiện để xác định loại hoặc biến thể của vi-rút lưu hành trong quần thể (ví dụ: để xác định huyết thanh của vi-rút a, chủng vi-rút hoang dã hoặc vắc-xin a, v.v.); trong trường hợp cần thực hiện các biện pháp dịch tễ khẩn cấp; khi các loại hoặc biến thể mới của virus xuất hiện; nếu cần thiết, xác nhận chẩn đoán sơ bộ; để chỉ ra virus trong các đối tượng môi trường. Khi phân lập vi rút, khả năng tồn tại của chúng trong cơ thể con người cũng như sự xuất hiện của nhiễm trùng hỗn hợp do hai hoặc nhiều vi rút gây ra sẽ được tính đến. Một quần thể virus đồng nhất về mặt di truyền thu được từ một virion được gọi là bản sao virus và quá trình thu được nó được gọi là nhân bản.

Để phân lập virus, người ta sử dụng phương pháp gây nhiễm cho động vật thí nghiệm nhạy cảm và phôi gà, nhưng hầu hết đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô. Sự hiện diện của virus thường được xác định bởi sự thoái hóa tế bào cụ thể (tác dụng gây bệnh tế bào),

Để phân lập một số loại virus, ví dụ như virus a, phôi gà được sử dụng để phân lập một số loại virus Coxsackie và một số loại arbovirus - chuột sơ sinh. Việc xác định các virus phân lập được thực hiện bằng phản ứng huyết thanh học và các phương pháp khác.

Khi làm việc với virus, hiệu giá của chúng được xác định. Việc chuẩn độ virus thường được thực hiện trong nuôi cấy mô, xác định độ pha loãng cao nhất của chất lỏng chứa virus, tại đó xảy ra thoái hóa mô, hình thành các thể vùi và kháng nguyên đặc hiệu với virus. Phương pháp mảng bám có thể được sử dụng để chuẩn độ một số loại virus. Các mảng bám, hoặc các khuẩn lạc âm tính của vi rút, là các ổ tế bào bị vi rút phá hủy trong môi trường nuôi cấy mô một lớp dưới lớp phủ thạch. Việc đếm khuẩn lạc cho phép phân tích định lượng hoạt động lây nhiễm của virus dựa trên tính toán rằng một hạt virus lây nhiễm tạo thành một mảng bám. Các mảng bám được phát hiện bằng cách nhuộm môi trường nuôi cấy bằng thuốc nhuộm nội sinh, thường là màu đỏ trung tính; mảng bám không hấp thụ thuốc nhuộm và do đó có thể nhìn thấy được dưới dạng đốm sáng trên nền của các tế bào sống nhuộm màu. Hiệu giá virus được biểu thị bằng số đơn vị hình thành mảng bám trên 1 ml.

Việc tinh chế và cô đặc virus thường được thực hiện bằng siêu ly tâm vi phân, sau đó là ly tâm gradient nồng độ hoặc mật độ. Để tinh chế virus, người ta sử dụng các phương pháp miễn dịch, sắc ký trao đổi ion, chất hấp thụ miễn dịch, v.v.

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm về nhiễm virus bao gồm việc phát hiện mầm bệnh hoặc các thành phần của nó trong vật liệu lâm sàng; phân lập virus từ vật liệu này; chẩn đoán huyết thanh. Việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm trong từng trường hợp riêng lẻ phụ thuộc vào tính chất của bệnh, thời gian mắc bệnh và khả năng của phòng thí nghiệm. Chẩn đoán hiện đại nhiễm virus dựa trên các phương pháp rõ ràng cho phép người ta có được câu trả lời vài giờ sau khi lấy tài liệu lâm sàng ở giai đoạn đầu sau khi mắc bệnh. Chúng bao gồm kính hiển vi điện tử và điện tử miễn dịch,

Kính hiển vi điện tử của virus nhuộm màu âm tính giúp phân biệt virus và xác định nồng độ của chúng. Việc sử dụng kính hiển vi điện tử trong chẩn đoán nhiễm virus chỉ giới hạn ở những trường hợp nồng độ hạt virus trong mẫu lâm sàng khá cao (10,5 trong 1). ml và cao hơn). Nhược điểm của phương pháp là không có khả năng phân biệt các virus thuộc cùng một nhóm phân loại. Sự thiếu hụt này được khắc phục bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử miễn dịch. Phương pháp này dựa trên sự hình thành các phức hợp miễn dịch bằng cách thêm huyết thanh cụ thể vào các hạt virus, đồng thời cô đặc các hạt virus, cho phép chúng được xác định. Phương pháp này cũng được sử dụng để phát hiện kháng thể. Với mục đích chẩn đoán rõ ràng, việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử các chất chiết xuất từ ​​mô, phân, chất lỏng từ mụn nước và dịch tiết từ vòm họng được thực hiện. Kính hiển vi điện tử được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu hình thái của virus; khả năng của nó được mở rộng khi sử dụng các kháng thể được dán nhãn.

Phương pháp lai phân tử, dựa trên việc phát hiện các axit nucleic đặc hiệu của virus, giúp phát hiện các bản sao đơn lẻ của gen và không có độ nhạy nào bằng. Phản ứng dựa trên sự lai giữa các chuỗi DNA hoặc RNA bổ sung (đầu dò) và hình thành các cấu trúc chuỗi kép. Đầu dò rẻ nhất là DNA tái tổ hợp nhân bản. Đầu dò được dán nhãn tiền chất phóng xạ (thường là phốt pho phóng xạ). Việc sử dụng các phản ứng so màu là đầy hứa hẹn. Có một số phương pháp lai phân tử: lai điểm, lai blot, lai sandwich, lai tại chỗ, v.v..

Các kháng thể thuộc lớp IgM xuất hiện sớm hơn các kháng thể lớp G (vào ngày thứ 3-5 của bệnh) và biến mất sau vài tuần, vì vậy việc phát hiện chúng cho thấy một bệnh nhiễm trùng gần đây. Các kháng thể thuộc lớp IgM được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hoặc sử dụng xét nghiệm miễn dịch enzyme sử dụng kháng huyết thanh kháng m (huyết thanh chống chuỗi nặng lgM).

Các phương pháp huyết thanh học trong virus học dựa trên các phản ứng miễn dịch cổ điển (xem phần 2). Phương pháp nghiên cứu miễn dịch ): phản ứng cố định bổ thể,

Để xác định các kháng nguyên riêng lẻ của virus và kháng thể chống lại chúng trong hỗn hợp phức tạp mà không cần tinh chế protein sơ bộ, phương pháp miễn dịch được sử dụng. Phương pháp này kết hợp phân đoạn protein bằng cách sử dụng điện di trên gel polyacrylamide với việc chỉ định miễn dịch protein sau đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme. Việc tách protein làm giảm yêu cầu về độ tinh khiết hóa học của kháng nguyên và giúp xác định từng cặp kháng nguyên-kháng thể riêng lẻ. Nhiệm vụ này có liên quan, ví dụ, trong chẩn đoán huyết thanh nhiễm HIV, trong đó phản ứng dương tính giả Xét nghiệm miễn dịch enzyme được gây ra bởi sự hiện diện của kháng thể chống lại các kháng nguyên tế bào, hiện diện do không đủ khả năng tinh chế protein của virus. Việc xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân với kháng nguyên virus bên trong và bên ngoài giúp xác định giai đoạn bệnh và khi phân tích quần thể, sự biến đổi của protein virus. Xét nghiệm miễn dịch đối với nhiễm HIV được sử dụng như một xét nghiệm xác nhận để xác định các kháng nguyên virus và kháng thể riêng lẻ đối với chúng. Khi phân tích quần thể, phương pháp này được sử dụng để xác định tính biến đổi của protein virut. Giá trị lớn của phương pháp nằm ở khả năng phân tích các kháng nguyên được tổng hợp bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, xác định kích thước của chúng và sự có mặt của các yếu tố quyết định kháng nguyên.

Thư mục: Bukrinskaya A.G. Virus học, M., 1986; Virus học, Phương pháp, ed. B. Meikhi, chuyển giới. từ tiếng Anh, M., 1988; Sổ tay các phương pháp nghiên cứu vi sinh và virus, ed. M.O. Birgera, M., 1982.

Các phương pháp nghiên cứu virus được sử dụng rộng rãi trong y học để chẩn đoán nhiều bệnh truyền nhiễm và một số bệnh bệnh ung thư có tính chất virus.

Các phương pháp nghiên cứu virus cũng được sử dụng để xác định, nghiên cứu sinh học và khả năng tác động của chúng đến tế bào động vật và con người, điều này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh. bệnh do virus và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp. Ngoài việc xác định nguyên nhân gây bệnh và theo dõi hiệu quả điều trị, các phương pháp nghiên cứu virus học có tầm quan trọng rất lớn trong việc xác định và thực hiện các biện pháp chống dịch.

Phương pháp nghiên cứu trực tiếp về virus học

Các phương pháp nghiên cứu virus học trực tiếp có thể phát hiện trực tiếp virus, axit nucleic của virus hoặc kháng nguyên virus trong vật liệu lâm sàng và do đó là phương pháp nhanh nhất (phương pháp nhanh - lên đến 24 giờ). Những phương pháp này ít thông tin hơn và cần có sự xác nhận của phòng thí nghiệm phương pháp gián tiếp chẩn đoán do thường xuyên nhận được kết quả âm tính giả hoặc kết quả dương tính giả. Các phương pháp nghiên cứu trực tiếp bao gồm:

• kính hiển vi điện tử nhuộm virus bằng phương pháp tương phản âm tính (cho phép bạn xác định sự hiện diện của virus và nồng độ của nó trong vật liệu, với điều kiện là 1 ml chứa ít nhất 105 hạt virus);
• kính hiển vi điện tử miễn dịch, dựa trên sự tương tác của các kháng thể đặc hiệu với virus để tạo thành phức hợp dễ phát hiện hơn với độ tương phản âm so với virus riêng biệt;
• xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) sử dụng các kháng thể được gắn nhãn enzyme liên kết với các kháng nguyên, tạo thành các phức hợp được bộc lộ khi thêm chất nền cho enzyme được sử dụng;
• phản ứng miễn dịch huỳnh quang (RIF) - trực tiếp hoặc gián tiếp - dựa trên việc sử dụng các kháng thể liên quan đến thuốc nhuộm huỳnh quang;
• xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA) dựa trên việc sử dụng kháng thể được đánh dấu phóng xạ và máy đếm gamma;
• phương pháp tế bào học dựa trên việc kiểm tra bằng kính hiển vi các phết nhuộm màu, mẫu sinh thiết và vật liệu khám nghiệm tử thi;
• phương pháp phân tử - lai phân tử của axit nucleic và phản ứng chuỗi polymerase (phương pháp đầu tiên dựa trên việc xác định các chuỗi axit nucleic bổ sung bằng cách sử dụng thẻ, phương pháp thứ hai dựa trên nguyên tắc sao chép trình tự DNA đặc hiệu của virus trong ba giai đoạn).

Có ba phương pháp lai phân tử của axit nucleic - lai điểm, lai blot (dùng để chẩn đoán nhiễm HIV) và lai tại chỗ (trực tiếp trong tế bào bị nhiễm bệnh). PCR (phản ứng chuỗi polymerase) hiện nay được sử dụng ngày càng nhiều trong việc theo dõi và chẩn đoán các bệnh nhiễm virus do phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Phương pháp nghiên cứu virus gián tiếp

Những phương pháp này dựa trên việc phân lập và xác định virus. Đây là những phương pháp tốn nhiều công sức và thời gian hơn, tuy nhiên, chính xác hơn. Vật liệu cho những nghiên cứu như vậy có thể là chất chứa trong mụn nước, mảnh vụn (nếu thủy đậu, tổn thương Herpetic da và niêm mạc), rửa mũi họng (đối với nhiễm trùng đường hô hấp), máu và dịch não tủy (đối với nhiễm arbovirus), phân (đối với nhiễm trùng enterovirus), rửa (đối với bệnh sởi, rubella, v.v.). Do virus chỉ có thể sinh sản trong tế bào sống nên virus được nuôi cấy trong nuôi cấy mô, phôi gà hoặc trên động vật (chuột đồng, chuột bạch, chó, mèo, một số loài khỉ). Việc xác định virus được thực hiện bằng hoạt động bệnh lý tế bào, trong phản ứng hấp thu máu, bằng xét nghiệm màu sắc, bằng kết quả của phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu, bằng những thay đổi hoặc sự vắng mặt của chúng trong phôi gà hoặc nuôi cấy mô, bằng sự sống sót của động vật nhạy cảm.

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được sử dụng trong virus học

Huyết thanh học có nghĩa là phương pháp nghiên cứu virus học dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Trong trường hợp này, huyết thanh máu ghép đôi thường được sử dụng nhất, được thực hiện trong khoảng thời gian vài tuần. Khi hiệu giá kháng thể tăng từ 4 lần trở lên thì phản ứng được coi là dương tính. Để xác định độ đặc hiệu của loại vi-rút, phản ứng trung hòa vi-rút được sử dụng và để xác định độ đặc hiệu của nhóm, phản ứng cố định bổ sung được sử dụng. Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động, ức chế ngưng kết hồng cầu, phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động đảo ngược, RIF và các xét nghiệm miễn dịch enzyme khác nhau cũng được sử dụng rộng rãi.

Gần đây, trong quá trình nghiên cứu kỹ thuật di truyền, một phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng đã được phát triển. Tính đặc hiệu hẹp của các dòng đơn dòng được khắc phục bằng cách sử dụng một số kháng thể đơn dòng đối với các yếu tố quyết định virus khác nhau. Điều này đã làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp nghiên cứu virus học với việc xác định kháng nguyên virus. Hiện nay, có nhiều hệ thống kiểm tra khác nhau đã được tạo ra để chẩn đoán miễn dịch nhiễm virus.

phương pháp nghiên cứu sinh học của virus và nhận dạng chúng. Trong virus học, các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi, nhờ đó có thể thiết lập cấu trúc phân tử của các hạt virus, phương pháp xâm nhập của chúng vào tế bào và các đặc điểm sinh sản của virus, cấu trúc chính của axit nucleic và protein của virus. Các phương pháp đang được phát triển để xác định trình tự các thành phần cấu thành axit nucleic của virus và axit amin protein. Có thể liên kết các chức năng của axit nucleic và protein mà chúng mã hóa với trình tự nucleotide và xác định nguyên nhân của các quá trình nội bào đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của nhiễm virus.

Phương pháp nghiên cứu virus học còn dựa trên các quá trình miễn dịch (tương tác giữa kháng nguyên với kháng thể), đặc tính sinh học của virus (khả năng ngưng kết hồng cầu, tan máu, hoạt động của enzyme), đặc điểm tương tác của virus với tế bào chủ (đặc điểm về tác dụng gây bệnh tế bào). , hình thành các thể vùi nội bào, v.v.).

Trong chẩn đoán nhiễm virus, trong nuôi cấy, phân lập và xác định virus, cũng như trong sản xuất chế phẩm vắc xin, phương pháp nuôi cấy mô và tế bào được sử dụng rộng rãi. Sử dụng nuôi cấy tế bào sơ cấp, thứ cấp, ổn định liên tục và lưỡng bội. Nuôi cấy sơ cấp thu được bằng cách phân tán mô bằng enzyme phân giải protein (trypsin, collagenase). Nguồn tế bào có thể là các mô và cơ quan (thường là thận) của phôi người và động vật. Huyền phù tế bào trong môi trường dinh dưỡng được đặt trong cái gọi là nệm, chai hoặc đĩa Petri, tại đây, sau khi bám vào bề mặt của bình, các tế bào bắt đầu nhân lên. Đối với nhiễm virus, người ta thường sử dụng tế bào đơn lớp. Chất lỏng dinh dưỡng được rút ra, dịch huyền phù virus được thêm vào ở những độ pha loãng nhất định và sau khi tiếp xúc với tế bào, môi trường dinh dưỡng tươi, thường không có huyết thanh, được thêm vào.

Tế bào của hầu hết các nền văn hóa sơ cấp có thể được nuôi cấy; nền văn hóa như vậy được gọi là nền văn hóa thứ cấp. Với sự di chuyển tiếp theo của các tế bào, một quần thể tế bào giống nguyên bào sợi được hình thành, có khả năng sinh sản nhanh chóng, hầu hết chúng vẫn giữ được bộ nhiễm sắc thể ban đầu. Đây được gọi là tế bào lưỡng bội. Bằng cách nuôi cấy tế bào nối tiếp, thu được nuôi cấy tế bào liên tục ổn định. Trong quá trình di chuyển, các tế bào đồng nhất phân chia nhanh chóng với bộ nhiễm sắc thể dị bội xuất hiện. Các dòng tế bào ổn định có thể là một lớp hoặc huyền phù. Nuôi cấy một lớp phát triển dưới dạng một lớp liên tục trên bề mặt thủy tinh, trong khi nuôi cấy huyền phù phát triển dưới dạng huyền phù trong các bình khác nhau sử dụng các thiết bị trộn. Có hơn 400 dòng tế bào có nguồn gốc từ 40 loài động vật khác nhau (bao gồm linh trưởng, chim, bò sát, lưỡng cư, cá, côn trùng) và con người.

Các mảnh cơ quan và mô riêng lẻ (nuôi cấy cơ quan) có thể được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Những kiểu nuôi cấy này bảo tồn cấu trúc mô, điều này đặc biệt quan trọng đối với việc phân lập và di chuyển các loại vi-rút không sinh sản trong môi trường nuôi cấy mô không phân biệt (ví dụ: vi-rút Corona).

Trong môi trường nuôi cấy tế bào bị nhiễm bệnh, vi rút có thể được phát hiện bằng những thay đổi về hình thái tế bào, tác dụng gây bệnh tế bào, có thể đặc hiệu, sự xuất hiện của các thể vùi, bằng cách xác định kháng nguyên vi rút trong tế bào và trong dịch nuôi cấy; xác lập các đặc tính sinh học của dòng virus trong dịch nuôi cấy và chuẩn độ virus trong nuôi cấy mô, phôi gà hoặc động vật nhạy cảm; bằng cách xác định từng axit nucleic của virus trong tế bào bằng phương pháp lai phân tử hoặc tích lũy axit nucleic bằng phương pháp hóa học tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Phân lập virus là một quá trình tốn nhiều công sức và thời gian. Nó được thực hiện để xác định loại hoặc biến thể của vi-rút lưu hành trong quần thể (ví dụ: để xác định huyết thanh của vi-rút cúm, chủng vi-rút hoang dã hoặc vắc-xin của vi-rút bại liệt, v.v.); trong trường hợp cần thực hiện các biện pháp dịch tễ khẩn cấp; khi các loại hoặc biến thể mới của virus xuất hiện; nếu cần thiết, xác nhận chẩn đoán sơ bộ; để phát hiện virus trong các đối tượng môi trường. Khi phân lập vi rút, khả năng tồn tại của chúng trong cơ thể con người cũng như sự xuất hiện của nhiễm trùng hỗn hợp do hai hoặc nhiều vi rút gây ra sẽ được tính đến. Một quần thể virus đồng nhất về mặt di truyền thu được từ một virion được gọi là bản sao virus và quá trình thu được nó được gọi là nhân bản.

Để phân lập virus, người ta sử dụng phương pháp gây nhiễm cho động vật thí nghiệm nhạy cảm và phôi gà, nhưng hầu hết đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô. Sự hiện diện của vi rút thường được xác định bằng sự thoái hóa tế bào cụ thể (tác dụng gây bệnh tế bào), sự hình thành các tế bào đối chứng và hợp bào, phát hiện các thể vùi nội bào, cũng như một kháng nguyên cụ thể được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, hấp thu máu, ngưng kết hồng cầu (đối với vi rút ngưng kết hồng cầu), v.v. . Những dấu hiệu này chỉ có thể được phát hiện sau 2-3 lần lây truyền virus.

Để phân lập một số loại vi-rút, chẳng hạn như vi-rút cúm, phôi gà được sử dụng và để phân lập một số vi-rút Coxsackie và một số loại vi-rút arbo, người ta sử dụng chuột sơ sinh. Việc xác định các virus phân lập được thực hiện bằng phản ứng huyết thanh học và các phương pháp khác.

Khi làm việc với virus, hiệu giá của chúng được xác định. Việc chuẩn độ virus thường được thực hiện trong nuôi cấy mô, xác định độ pha loãng cao nhất của chất lỏng chứa virus, tại đó xảy ra thoái hóa mô, hình thành các thể vùi và kháng nguyên đặc hiệu với virus. Phương pháp mảng bám có thể được sử dụng để chuẩn độ một số loại virus. Các mảng bám, hoặc các khuẩn lạc âm tính của vi rút, là các ổ tế bào bị vi rút phá hủy trong môi trường nuôi cấy mô một lớp dưới lớp phủ thạch. Việc đếm khuẩn lạc cho phép phân tích định lượng hoạt động lây nhiễm của virus trên cơ sở một hạt virus lây nhiễm tạo thành một mảng bám. Các mảng bám được phát hiện bằng cách nhuộm môi trường nuôi cấy bằng thuốc nhuộm nội sinh, thường là màu đỏ trung tính; các mảng bám không hấp thụ thuốc nhuộm và do đó có thể nhìn thấy dưới dạng các đốm sáng trên nền của các tế bào sống bị nhuộm màu. Hiệu giá virus được biểu thị bằng số đơn vị hình thành mảng bám trên 1 ml.

Việc tinh chế và cô đặc virus thường được thực hiện bằng siêu ly tâm vi phân, sau đó là ly tâm gradient nồng độ hoặc mật độ. Để tinh chế virus, người ta sử dụng các phương pháp miễn dịch, sắc ký trao đổi ion, chất hấp thụ miễn dịch, v.v.

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm về nhiễm virus bao gồm việc phát hiện mầm bệnh hoặc các thành phần của nó trong vật liệu lâm sàng; phân lập virus từ vật liệu này; chẩn đoán huyết thanh. Việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm trong từng trường hợp riêng lẻ phụ thuộc vào tính chất của bệnh, thời gian mắc bệnh và khả năng của phòng thí nghiệm. Chẩn đoán hiện đại về nhiễm virus dựa trên các phương pháp rõ ràng cho phép có được câu trả lời vài giờ sau khi lấy tài liệu lâm sàng ở giai đoạn đầu sau khi mắc bệnh. Chúng bao gồm kính hiển vi điện tử và điện tử miễn dịch, cũng như phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phương pháp lai phân tử. , phát hiện kháng thể thuộc lớp IgM, v.v.

Kính hiển vi điện tử của virus nhuộm màu âm tính giúp phân biệt virus và xác định nồng độ của chúng. Việc sử dụng kính hiển vi điện tử trong chẩn đoán nhiễm virus chỉ giới hạn ở những trường hợp nồng độ hạt virus trong mẫu lâm sàng khá cao (10,5 trong 1). ml và cao hơn). Nhược điểm của phương pháp là không có khả năng phân biệt các virus thuộc cùng một nhóm phân loại. Sự thiếu hụt này được khắc phục bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử miễn dịch. Phương pháp này dựa trên sự hình thành các phức hợp miễn dịch bằng cách thêm huyết thanh cụ thể vào các hạt virus, đồng thời cô đặc các hạt virus, cho phép chúng được xác định. Phương pháp này cũng được sử dụng để phát hiện kháng thể. Với mục đích chẩn đoán rõ ràng, việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử các chất chiết xuất từ ​​mô, phân, chất lỏng từ mụn nước và dịch tiết từ vòm họng được thực hiện. Kính hiển vi điện tử được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu hình thái của virus; khả năng của nó được mở rộng khi sử dụng các kháng thể được dán nhãn.

Phương pháp lai phân tử, dựa trên việc phát hiện các axit nucleic đặc hiệu của virus, giúp phát hiện các bản sao đơn lẻ của gen và không có độ nhạy nào bằng. Phản ứng dựa trên sự lai giữa các chuỗi DNA hoặc RNA bổ sung (đầu dò) và hình thành các cấu trúc chuỗi kép. Đầu dò rẻ nhất là DNA tái tổ hợp nhân bản. Đầu dò được dán nhãn tiền chất phóng xạ (thường là phốt pho phóng xạ). Việc sử dụng các phản ứng so màu là đầy hứa hẹn. Có một số phương pháp lai phân tử: lai điểm, lai blot, lai sandwich, lai tại chỗ, v.v..

Các kháng thể thuộc lớp IgM xuất hiện sớm hơn các kháng thể lớp G (vào ngày thứ 3-5 của bệnh) và biến mất sau vài tuần, vì vậy việc phát hiện chúng cho thấy một bệnh nhiễm trùng gần đây. Các kháng thể thuộc lớp lgM được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hoặc bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme sử dụng kháng huyết thanh kháng μ (huyết thanh chống lại chuỗi nặng của lgM).

Các phương pháp huyết thanh học trong virus học dựa trên các phản ứng miễn dịch cổ điển (xem Phương pháp nghiên cứu miễn dịch học) : phản ứng cố định bổ thể, ức chế ngưng kết hồng cầu, trung hòa sinh học, khuếch tán miễn dịch, ngưng kết hồng cầu gián tiếp, tán huyết xuyên tâm, miễn dịch huỳnh quang, xét nghiệm miễn dịch enzyme, xét nghiệm miễn dịch phóng xạ. Các phương pháp vi mô cho nhiều phản ứng đã được phát triển và kỹ thuật của chúng không ngừng được cải tiến. Các phương pháp này được sử dụng để xác định vi-rút bằng cách sử dụng một bộ huyết thanh đã biết và để chẩn đoán huyết thanh để xác định mức tăng kháng thể trong huyết thanh thứ hai so với huyết thanh đầu tiên (huyết thanh đầu tiên được lấy vào những ngày đầu tiên sau khi mắc bệnh, huyết thanh thứ hai - sau 2- 3 tuần). Giá trị chẩn đoán không dưới mức tăng gấp bốn lần lượng kháng thể trong huyết thanh thứ hai. Nếu việc phát hiện các kháng thể thuộc lớp IgM cho thấy một bệnh nhiễm trùng gần đây, thì các kháng thể thuộc lớp IgC sẽ tồn tại trong vài năm và đôi khi là suốt đời.

Để xác định các kháng nguyên riêng lẻ của virus và kháng thể chống lại chúng trong hỗn hợp phức tạp mà không cần tinh chế protein sơ bộ, phương pháp miễn dịch được sử dụng. Phương pháp này kết hợp phân đoạn protein bằng cách sử dụng điện di trên gel polyacrylamide với việc chỉ định miễn dịch protein sau đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme. Việc tách protein làm giảm yêu cầu về độ tinh khiết hóa học của kháng nguyên và giúp xác định từng cặp kháng nguyên-kháng thể riêng lẻ. Nhiệm vụ này có liên quan, ví dụ, trong chẩn đoán huyết thanh nhiễm HIV, trong đó các phản ứng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme dương tính giả được gây ra bởi sự hiện diện của kháng thể đối với các kháng nguyên tế bào, xuất hiện do không đủ tinh sạch protein virus. Việc xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân với kháng nguyên virus bên trong và bên ngoài giúp xác định giai đoạn bệnh và khi phân tích quần thể, sự biến đổi của protein virus. Xét nghiệm miễn dịch đối với nhiễm HIV được sử dụng như một xét nghiệm xác nhận để xác định các kháng nguyên virus và kháng thể riêng lẻ đối với chúng. Khi phân tích quần thể, phương pháp này được sử dụng để xác định tính biến đổi của protein virut. Giá trị lớn của phương pháp nằm ở khả năng phân tích các kháng nguyên được tổng hợp bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, xác định kích thước của chúng và sự có mặt của các yếu tố quyết định kháng nguyên.

20) Thành phần cấu trúc chính của virion (các hạt virus hoàn chỉnh) là một nucleocapsid, tức là vỏ protein (capsid) chứa bộ gen virus (DNA hoặc RNA). Nuclecapsid của hầu hết các họ virus được bao quanh bởi một lớp vỏ lipoprotein. Giữa lớp vỏ và nucleocapsid của một số virus (ortho-, paramyxo-, rhabdo-, phylo- và retrovirus) có một protein ma trận không bị glycosyl hóa giúp tăng thêm độ cứng cho virion. Hầu hết các họ virus đều có vỏ bọc, vỏ này đóng vai trò quan trọng trong khả năng lây nhiễm. Virion thu được lớp vỏ ngoài khi nucleocapsid xuyên qua màng tế bào bằng cách nảy chồi. Các protein vỏ được virus mã hóa và lipid được lấy từ màng tế bào. Glycoprotein thường ở dạng dimer và Trimer tạo thành peplomer (phần nhô ra) trên bề mặt của virion (ortho-, paramyxovirus, rhabdo-, phylo-, corona-, bunya-, Arena-, retrovirus). Các protein tổng hợp được glycosyl hóa có liên kết với peplomer và đóng vai trò chính trong việc xâm nhập của virus vào tế bào. Vỏ bọc và vỏ bọc virion được hình thành bởi nhiều bản sao của một hoặc nhiều loại tiểu đơn vị protein thông qua quá trình tự lắp ráp. Tương tác trong hệ thống protein-protein do liên kết hóa học yếu dẫn đến sự liên kết của các viên nang đối xứng. Sự khác biệt giữa các virus về hình dạng và kích thước của virion phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và số lượng tiểu đơn vị protein cấu trúc cũng như bản chất của sự tương tác giữa chúng. Capsid bao gồm nhiều tiểu đơn vị riêng biệt về mặt hình thái (capsomere), được tập hợp từ các polypeptide của virus theo cách được xác định chặt chẽ, tuân theo các nguyên tắc hình học tương đối đơn giản. Các tiểu đơn vị protein, kết nối với nhau, tạo thành các viên nang có hai loại đối xứng: đẳng cự và xoắn ốc. Cấu trúc nucleocapsid của virus có vỏ bọc tương tự như cấu trúc nucleocapsid của virus không có vỏ bọc. Trên bề mặt vỏ virus, các cấu trúc glycoprotein được biểu hiện về mặt hình thái - peplomeres - được phân biệt. Thành phần của vỏ supercapsid bao gồm lipid (lên tới 20-35%) và carbohydrate (lên tới 7-8%) có nguồn gốc tế bào. Nó bao gồm một lớp kép lipid tế bào và các protein đặc hiệu của virus nằm bên ngoài và bên trong lớp sinh học lipid. Lớp ngoài của lớp vỏ supercapsid được thể hiện bằng peplomeres (phần nhô ra) thuộc một hoặc nhiều loại, bao gồm một hoặc nhiều phân tử glycoprotein. Nuclecapsid của virus có vỏ bọc thường được gọi là lõi và phần trung tâm của virion chứa axit nucleic được gọi là nucleoid. Capsomeres (peplomer) bao gồm các đơn vị cấu trúc được tạo thành từ một hoặc một số chuỗi polypeptide tương đồng hoặc dị loại (tiểu đơn vị protein). phân loại virus Các viên nang đẳng cự không phải là hình cầu mà là các khối đa diện đều (hình hai mươi mặt). Kích thước tuyến tính của chúng giống hệt nhau dọc theo trục đối xứng. Theo Kaspar và Klug (1962), capsomere trong viên nang được sắp xếp theo kiểu đối xứng 20 mặt. Những viên nang như vậy bao gồm các tiểu đơn vị giống hệt nhau tạo thành một khối hai mươi mặt. Chúng có 12 đỉnh (góc), 30 mặt và 20 mặt dưới dạng tam giác cân. Theo quy tắc này, vỏ bọc của virus bại liệt và virus lở mồm long móng được hình thành bởi 60 đơn vị cấu trúc protein, mỗi đơn vị bao gồm bốn chuỗi polypeptide. Khối hai mươi mặt giải quyết tối ưu vấn đề đóng gói các tiểu đơn vị lặp lại thành một cấu trúc nhỏ gọn chặt chẽ với khối lượng tối thiểu. Chỉ một số cấu hình nhất định của các tiểu đơn vị cấu trúc mới có thể tạo thành các bề mặt và tạo thành các đỉnh và các mặt của khối 20 mặt virus. Ví dụ, các tiểu đơn vị cấu trúc của adenovirus tạo thành các capsomer lục giác (hexon) trên bề mặt và các cạnh, và các capsomer năm mặt (pepton) trên đỉnh. Ở một số loại virus, cả hai loại capsome đều được hình thành bởi cùng một polypeptide, ở những loại khác - bởi các polypeptide khác nhau. Do các tiểu đơn vị cấu trúc của các loại virus khác nhau khác nhau, một số loại virus có hình lục giác hơn, số khác có hình cầu hơn. Tất cả các loại virus ở động vật có xương sống chứa DNA đã biết, ngoại trừ virus đậu mùa, cũng như nhiều loại virus chứa RNA (7 họ), đều có kiểu đối xứng dạng khối. Reovirus, không giống như các loại virus có xương sống khác, có vỏ bọc kép (bên ngoài và bên trong), mỗi vỏ bao gồm các đơn vị hình thái. Virus có kiểu đối xứng xoắn ốc có hình dạng cấu trúc giống như sợi hình trụ; RNA bộ gen của chúng có hình dạng xoắn ốc và nằm bên trong vỏ ớt. Tất cả các virus động vật có đối xứng xoắn ốc đều được bao quanh bởi một lớp vỏ lipoprotein. Các nucleocapsid xoắn ốc được đặc trưng bởi chiều dài, đường kính, bước xoắn và số lượng capsome trên mỗi vòng xoắn. Do đó, ở virus Sendai (paramyxovirus), nucleocapsid là một chuỗi xoắn dài khoảng 1 μm, đường kính 20 nm và bước sóng 5 nm. Capsid bao gồm khoảng 2400 đơn vị cấu trúc, mỗi đơn vị là một protein có trọng lượng phân tử 60kĐ. Có 11-13 tiểu đơn vị cho mỗi vòng xoắn. Ở những virus có kiểu đối xứng nucleocapsid xoắn ốc, việc gấp các phân tử protein thành chuỗi xoắn đảm bảo sự tương tác tối đa giữa axit nucleic và tiểu đơn vị protein. Ở virus 20 mặt, axit nucleic được cuộn bên trong virion và tương tác với một hoặc nhiều polypeptide nằm bên trong vỏ ớt.

Thuốc kháng thụ thể (thụ thể) Virus- các protein virion bề mặt, ví dụ, hemagglutinin, liên kết theo cách bổ sung với thụ thể tương ứng của tế bào nhạy cảm.

21) Phương pháp miễn dịch học trong nghiên cứu virus học.

Các xét nghiệm huyết thanh học khác nhau về khả năng phát hiện từng loại kháng thể. Ví dụ, xét nghiệm ngưng kết phát hiện tốt kháng thể IgG nhưng kém nhạy hơn trong việc phát hiện kháng thể IgG. Các phản ứng cố định bổ thể và tan máu cần có sự bổ sung, không được phát hiện bởi các kháng thể không cố định bổ thể, chẳng hạn như kháng thể IgA và kháng thể IgE. Phản ứng trung hòa virus chỉ liên quan đến các kháng thể chống lại các yếu tố quyết định kháng nguyên trên bề mặt virion có liên quan đến khả năng gây bệnh. Độ nhạy I. m. và. vượt qua tất cả các phương pháp khác để nghiên cứu kháng nguyên và kháng thể; đặc biệt, xét nghiệm miễn dịch phóng xạ và xét nghiệm miễn dịch enzyme giúp phát hiện sự hiện diện của protein với số lượng được đo bằng nanogram và thậm chí cả picogram. Với sự giúp đỡ của I. m. và. xác định nhóm và kiểm tra độ an toàn của máu (nhiễm viêm gan B và HIV). Khi cấy ghép các mô và cơ quan, I. m. và. cho phép bạn xác định khả năng tương thích của mô và các phương pháp thử nghiệm để ngăn chặn sự không tương thích. Trong y học pháp y, phản ứng Castellani được sử dụng để xác định tính đặc hiệu loài của protein và phản ứng ngưng kết để xác định nhóm máu.

Phương pháp miễn dịch được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán phòng thí nghiệm các bệnh truyền nhiễm. Nguyên nhân của bệnh cũng được xác định dựa trên sự gia tăng kháng thể chống lại mầm bệnh trong huyết thanh của người khỏi bệnh so với mẫu lấy trong những ngày đầu của bệnh. Dựa trên I. m. và. nghiên cứu khả năng miễn dịch của người dân đối với các bệnh nhiễm trùng hàng loạt, chẳng hạn như cúm, đồng thời đánh giá hiệu quả của việc tiêm chủng phòng ngừa.

Tùy thuộc vào cơ chế của chúng và có tính đến kết quả của I. m. và. có thể chia thành các phản ứng dựa vào hiện tượng ngưng kết; phản ứng dựa trên hiện tượng kết tủa; phản ứng liên quan đến bổ thể; phản ứng trung hòa; phản ứng bằng các phương pháp vật lý và hóa học.

Phản ứng dựa trên hiện tượng ngưng kết. Sự ngưng kết là sự kết dính của các tế bào hoặc các hạt riêng lẻ mang kháng nguyên với sự trợ giúp của huyết thanh miễn dịch với kháng nguyên này.

Phản ứng ngưng kết vi khuẩn sử dụng huyết thanh kháng khuẩn thích hợp là một trong những phản ứng huyết thanh học đơn giản nhất. Huyền phù vi khuẩn được thêm vào các độ pha loãng khác nhau của huyết thanh xét nghiệm và sau một thời gian tiếp xúc nhất định ở t°37°, nó được ghi lại ở độ pha loãng cao nhất xảy ra ngưng kết huyết thanh. Phản ứng ngưng kết vi khuẩn được sử dụng để chẩn đoán nhiều bệnh truyền nhiễm: bệnh brucellosis, bệnh tularemia, sốt thương hàn và phó thương hàn, bệnh lỵ trực khuẩn, bệnh sốt phát ban.

Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động hoặc gián tiếp (RPHA, RNHA). Nó sử dụng các tế bào hồng cầu hoặc vật liệu tổng hợp trung tính (ví dụ, các hạt latex), trên bề mặt mà các kháng nguyên (vi khuẩn, virus, mô) hoặc kháng thể được hấp thụ. Sự ngưng kết của chúng xảy ra khi huyết thanh hoặc kháng nguyên thích hợp được thêm vào.

Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động được sử dụng để chẩn đoán các bệnh do vi khuẩn gây ra ( sốt thương hàn và sốt phó thương hàn, kiết lỵ, bệnh brucellosis, bệnh dịch hạch, dịch tả, v.v.), động vật nguyên sinh (sốt rét) và vi rút (cúm, nhiễm adenovirus, viêm gan siêu vi B, sởi, viêm não do ve truyền, Crimean sốt xuất huyết v.v.), cũng như để xác định một số hormone, xác định mẫn cảm kiên nhẫn để các loại thuốc và các hormone như penicillin và insulin.

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HAI) dựa trên hiện tượng huyết thanh miễn dịch ngăn chặn (ức chế) quá trình ngưng kết hồng cầu của virus và được sử dụng để phát hiện và chuẩn độ các kháng thể kháng virus. Đây là phương pháp chính để chẩn đoán huyết thanh bệnh cúm, sởi, rubella, bệnh quai bị, viêm não do ve gây ra và các bệnh nhiễm trùng do virus khác, các tác nhân gây bệnh có đặc tính làm ngưng kết máu. ví dụ, để chẩn đoán huyết thanh viêm não do ve gây ra, pha loãng huyết thanh bệnh nhân gấp đôi trong dung dịch đệm borat kiềm được đổ vào các giếng của bảng. Sau đó, một lượng nhất định, thường là 8 AU (đơn vị ngưng kết), kháng nguyên viêm não do bọ ve truyền được thêm vào và sau 18 giờ tiếp xúc ở t°4°, huyền phù tế bào hồng cầu ngỗng được chuẩn bị trong dung dịch đệm photphat có tính axit được thêm vào. . Nếu huyết thanh của bệnh nhân có chứa kháng thể chống lại virus viêm não do ve truyền thì kháng nguyên sẽ bị vô hiệu hóa và hiện tượng ngưng kết hồng cầu không xảy ra.

Phản ứng dựa trên hiện tượng kết tủa. Kết tủa xảy ra do sự tương tác của kháng thể với kháng nguyên hòa tan. Ví dụ đơn giản nhất về phản ứng kết tủa là sự hình thành trong ống nghiệm một dải kết tủa mờ đục ở ranh giới phân lớp của kháng nguyên trên kháng thể. Nhiều loại phản ứng kết tủa trong thạch bán lỏng hoặc gel agarose được sử dụng rộng rãi (phương pháp khuếch tán miễn dịch kép theo Ouchterlohn, phương pháp khuếch tán miễn dịch xuyên tâm, điện di miễn dịch), cả về chất lượng và định lượng. Do sự khuếch tán tự do của các kháng nguyên và kháng thể trong gel trong vùng có tỷ lệ tối ưu của chúng, các phức hợp cụ thể được hình thành - các dải kết tủa, được phát hiện bằng mắt thường hoặc bằng cách nhuộm màu. Điểm đặc biệt của phương pháp là mỗi cặp kháng nguyên-kháng thể tạo thành một dải kết tủa riêng lẻ và phản ứng không phụ thuộc vào sự hiện diện của các kháng nguyên và kháng thể khác trong hệ thống đang nghiên cứu.

Phản ứng liên quan đến bổ thể, được sử dụng làm huyết thanh máu tươi chuột bạch, dựa trên khả năng của tiểu thành phần bổ thể Clq và sau đó là các thành phần bổ thể khác gắn vào các phức hợp miễn dịch.

Phản ứng cố định bổ thể (CFR) cho phép chuẩn độ kháng nguyên hoặc kháng thể tùy theo mức độ cố định bổ thể của phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Phản ứng này gồm hai giai đoạn: sự tương tác của kháng nguyên với huyết thanh xét nghiệm (hệ thống xét nghiệm) và sự tương tác của huyết thanh tan máu với hồng cầu cừu (hệ thống chỉ thị). Với phản ứng dương tính trong hệ thống đang nghiên cứu, quá trình cố định bổ thể xảy ra, và sau đó khi bổ sung hồng cầu được kháng thể nhạy cảm, sẽ không xảy ra hiện tượng tan máu. Phản ứng này được sử dụng để chẩn đoán huyết thanh bệnh giang mai (phản ứng Wassermann), nhiễm virus và vi khuẩn.

Phản ứng trung hòa dựa trên khả năng của kháng thể vô hiệu hóa một số chức năng cụ thể của kháng nguyên đại phân tử hoặc kháng nguyên hòa tan, ví dụ như hoạt động của enzyme, độc tố vi khuẩn và khả năng gây bệnh của virus. Phản ứng trung hòa độc tố có thể được đánh giá bằng tác dụng sinh học, ví dụ, huyết thanh chống uốn ván và chống botulinum được chuẩn độ. Hỗn hợp độc tố và kháng huyết thanh dùng cho động vật không gây tử vong cho động vật. Các phiên bản khác nhau của phản ứng trung hòa được sử dụng trong virus học. Bằng cách trộn vi-rút với kháng huyết thanh thích hợp và đưa hỗn hợp này vào động vật hoặc nuôi cấy tế bào, khả năng gây bệnh của vi-rút sẽ bị vô hiệu hóa và động vật không bị bệnh cũng như tế bào nuôi cấy không bị phá hủy.

Phản ứng sử dụng nhãn hóa học và vật lý. Miễn dịch huỳnh quang liên quan đến việc sử dụng các kháng thể có nhãn fluorochrome, chính xác hơn là phần globulin miễn dịch Kháng thể IgG. Một kháng thể được đánh dấu fluorochrome tạo thành một phức hợp kháng nguyên-kháng thể với một kháng nguyên, có thể quan sát được dưới kính hiển vi dưới tia UV kích thích fluorochrome. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp được sử dụng để nghiên cứu các kháng nguyên tế bào, phát hiện virus trong tế bào bị nhiễm bệnh và phát hiện vi khuẩn và rickettsiae trong phết tế bào.

Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp được sử dụng rộng rãi hơn. dựa trên việc phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể bằng cách sử dụng huyết thanh miễn dịch phát quang chống lại kháng thể IgG và được sử dụng để phát hiện không chỉ kháng nguyên mà còn chuẩn độ kháng thể.

Phương pháp enzym miễn dịch, hay phương pháp miễn dịch enzym, dựa trên việc sử dụng các kháng thể kết hợp với enzym, chủ yếu là peroxidase cải ngựa hoặc phosphatase kiềm. Tương tự như miễn dịch huỳnh quang, phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong tế bào hoặc chuẩn độ kháng thể trên tế bào chứa kháng nguyên.

Phương pháp miễn dịch phóng xạ dựa trên việc sử dụng nhãn đồng vị phóng xạ của kháng nguyên hoặc kháng thể. Đây là phương pháp nhạy nhất để xác định kháng nguyên và kháng thể, được sử dụng để xác định hormone, dược chất và kháng sinh, để chẩn đoán các bệnh do vi khuẩn, virus, rickettsia, đơn bào, nghiên cứu protein máu, kháng nguyên mô.

Kỹ thuật thấm miễn dịch được sử dụng để phát hiện các kháng thể đối với từng kháng nguyên hoặc để “nhận biết” các kháng nguyên từ huyết thanh đã biết. Phương pháp này bao gồm 3 giai đoạn: tách các đại phân tử sinh học (ví dụ virus) thành từng protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide; chuyển các protein đã tách từ gel sang chất hỗ trợ rắn (blot) bằng cách đặt tấm gel polyacrylamide trên giấy hoạt tính hoặc nitrocellulose (điện hóa); phát hiện các protein mong muốn trên cơ chất bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme trực tiếp hoặc gián tiếp. Xét nghiệm miễn dịch được sử dụng như một phương pháp chẩn đoán nhiễm HIV. Việc phát hiện kháng thể đối với một trong các protein ở lớp vỏ ngoài của virus có giá trị chẩn đoán.

22) Các dạng đối xứng của virus (khối, xoắn ốc, hỗn hợp). Sự tương tác giữa protein và axit nucleic trong quá trình đóng gói bộ gen của virus.

Tùy thuộc vào sự tương tác của vỏ ớt với axit nucleic, các hạt virus có thể được chia thành nhiều loại đối xứng:

1). Kiểu đối xứng khối.

Capsid khối là các icoside có khoảng 20 bề mặt hình tam giác và 12 đỉnh. Chúng tạo thành một cấu trúc giống như hình cầu, nhưng thực tế nó là một khối đa diện. Trong một số trường hợp, các dạng lipoprotein đặc biệt gọi là gai được gắn vào các đỉnh của các khối đa diện như vậy. Vai trò của những gai này có lẽ bị giảm đi do sự tương tác của virion hoặc các hạt virus với các khu vực tương ứng của tế bào chủ nhạy cảm với chúng. Với sự đối xứng hình khối, axit nucleic của virus được đóng gói chặt chẽ (cuộn thành một quả bóng) và các phân tử protein bao quanh nó, tạo thành một khối đa diện (icosahedron). Một khối đa diện là một khối đa diện có hai mươi mặt tam giác, có hình khối đối xứng và hình dạng gần như hình cầu. Virus 20 mặt bao gồm virus herpes simplex, reovirus, v.v..

2). Kiểu đối xứng xoắn ốc. Capsid xoắn ốc có cấu trúc đơn giản hơn một chút. Những thứ kia. Capsomer tạo nên lớp vỏ bọc NA xoắn ốc và cũng tạo thành lớp vỏ protein khá ổn định của những virus này. Và khi sử dụng kính hiển vi điện tử có độ phân giải cao và phương pháp chuẩn bị thích hợp, người ta có thể nhìn thấy cấu trúc xoắn ốc trên virus. Với tính chất đối xứng xoắn ốc của vỏ capsid, axit nucleic của virus tạo thành hình xoắn ốc (hoặc xoắn ốc), rỗng bên trong và các tiểu đơn vị protein (capsomeres) cũng được sắp xếp xung quanh nó theo hình xoắn ốc (capsid hình ống). Một ví dụ về vi-rút có cấu trúc đối xứng dạng xoắn ốc là vi-rút khảm thuốc lá, có hình que, dài 300 nm và đường kính 15 nm. Hạt virus chứa một phân tử RNA có kích thước khoảng 6.000 nucleotide. Capsid bao gồm 2000 tiểu đơn vị protein giống hệt nhau được sắp xếp theo hình xoắn ốc.

3). Kiểu đối xứng hỗn hợp hoặc phức tạp. Theo quy luật, kiểu đối xứng này được phát hiện chủ yếu ở các virus vi khuẩn. Và ví dụ kinh điển là những thể thực khuẩn đó coli hoặc phage ôn đới. Đây là những cấu trúc phức tạp có phần đầu chứa hàm lượng nucleic bên trong, các loại phần phụ khác nhau, bộ phận đuôi và các thiết bị có mức độ phức tạp khác nhau. Và mỗi thành phần của các hạt như vậy đều có một chức năng cụ thể được thực hiện trong quá trình tương tác của virus với tế bào. Nói cách khác, một kiểu đối xứng phức tạp là sự kết hợp của đối xứng bậc ba, phần đầu là một khối đa diện icosider và các hình dạng hình que là các quá trình đuôi. Mặc dù trong số các virus vi khuẩn cũng có những virion có tổ chức khá đơn giản là các nucleocapsid nguyên thủy, có hình cầu hoặc hình khối. Virus vi khuẩn phức tạp nhất so với virus thực vật và virus động vật.

24) Sự tương tác của phage với tế bào. Các phage độc ​​và ôn hòa.

Sự hấp phụ.

Sự tương tác bắt đầu bằng việc gắn các hạt virus vào bề mặt tế bào. Quá trình này có thể thực hiện được khi có sự hiện diện của các thụ thể thích hợp trên bề mặt tế bào và các chất chống thụ thể trên bề mặt hạt virus.

Virus sử dụng các thụ thể tế bào được thiết kế để vận chuyển chất cần thiết: các hạt dinh dưỡng, hormone, các yếu tố tăng trưởng, v.v.

Thụ thể: protein, thành phần carbohydrate của protein và lipid, lipid. Các thụ thể cụ thể quyết định số phận tiếp theo của hạt virus (vận chuyển, phân phối đến các khu vực của tế bào chất hoặc nhân). Virus cũng có thể bám vào các thụ thể không đặc hiệu và thậm chí xâm nhập vào tế bào. Tuy nhiên, quá trình này không gây ra sự phát triển của nhiễm trùng.

Đầu tiên, một liên kết đơn giữa chất kháng thụ thể và thụ thể được hình thành. Sự kết nối như vậy rất mong manh và có thể bị phá vỡ. Để hình thành sự hấp phụ không thể đảo ngược, cần phải có sự gắn kết đa hóa trị. Liên kết ổn định xảy ra do sự chuyển động tự do của các phân tử thụ thể trong màng. Khi virus tương tác với tế bào, người ta quan sát thấy sự gia tăng tính lưu động của lipid và sự hình thành các trường thụ thể trong khu vực tương tác giữa virus và tế bào. Các thụ thể của một số virus chỉ có thể hiện diện trong một số lượng tế bào chủ nhất định. Điều này quyết định độ nhạy cảm của cơ thể với loại virus này. Do đó, DNA và RNA của virus có khả năng lây nhiễm trên phạm vi rộng hơn các tế bào chủ.

Thuốc kháng thụ thể có thể được tìm thấy trong các bào quan độc nhất của virus: cấu trúc phần phụ ở thực khuẩn T, sợi ở adenovirus, gai trên bề mặt màng virus, corona ở virus corona.

Thâm nhập.

2 cơ chế - nhập bào thụ thể và phản ứng tổng hợp màng.

Nhập bào thụ thể:

Cơ chế thông thường cho sự xâm nhập của chất dinh dưỡng và chất điều hòa vào tế bào. Xảy ra ở những khu vực chuyên biệt - nơi có những hố đặc biệt được phủ clathrin, dưới đáy hố có những cơ quan thụ cảm đặc hiệu. Các hố cung cấp sự xâm lấn nhanh chóng và hình thành các không bào được phủ clathrin (không quá 10 phút trôi qua kể từ thời điểm hấp phụ; có thể hình thành tới 2000 không bào trong một phút). Không bào hợp nhất với không bào tế bào chất lớn hơn, tạo thành các thụ thể (không còn chứa clathrin), từ đó hợp nhất với lysosome.

Sự kết hợp của màng tế bào và virus:

Ở virus có vỏ bọc, sự dung hợp xảy ra do sự tương tác điểm của protein virus với lipid của màng tế bào, do đó vỏ lipoprotein của virus tích hợp với màng tế bào. Ở virus không có vỏ bọc, một trong những protein bề mặt cũng tương tác với lipid màng tế bào và thành phần bên trong đi qua màng (ở paramyxovirus - F-protein, ở orthomyxovirus - tiểu đơn vị ngưng kết hồng cầu HA2). Cấu trúc của protein bề mặt bị ảnh hưởng bởi độ pH.

Dải.

Trong quá trình này, hoạt động lây nhiễm biến mất, sự nhạy cảm với nuclease thường xuất hiện và xuất hiện khả năng kháng kháng thể. Sản phẩm cuối cùng của quá trình cởi quần áo là axit nucleic liên kết với protein bên trong virus. Công đoạn cởi quần áo còn hạn chế khả năng lây nhiễm (virus không thể cởi quần áo trong từng tế bào). Quá trình cởi quần áo xảy ra ở các khu vực chuyên biệt của tế bào: lysosome, bộ máy Golgi, không gian hạt nhân.

Cởi quần áo xảy ra do một số phản ứng. Ví dụ, ở picornavirus, quá trình lột quần áo xảy ra với sự hình thành các hạt dưới vi rút trung gian có kích thước từ 156 đến 12S. Ở adenovirus ở tế bào chất và các lỗ nhân và có ít nhất 3 giai đoạn:

Hình thành các hạt dưới virus với mật độ cao hơn virion;

Hình thành lõi thiếu 3 protein virut;

Sự hình thành phức hợp DNA-protein trong đó DNA được liên kết cộng hóa trị với protein cuối cùng.

Đặc điểm của phage độc ​​và phage ôn hòa.

Khi một vi khuẩn bị nhiễm một thể thực khuẩn, cái gọi là nhiễm trùng tiêu hủy xảy ra, tức là một sự nhiễm trùng kết thúc bằng sự phân giải tế bào chủ, nhưng đây chỉ là đặc điểm của cái gọi là các thể thực khuẩn có độc lực, sự tương tác của chúng với các thể thực khuẩn. tế bào dẫn đến chết tế bào và hình thành thế hệ phage.

Trong trường hợp này, các giai đoạn sau được phân biệt tùy theo sự tương tác của phage với tế bào: trộn phage với nuôi cấy tế bào (bội số lây nhiễm là 1 phage trên 10 tế bào) và nồng độ phải đủ cao để cho phép các phage để liên lạc với tế bào. Để nó không xảy ra tái nhiễm– sau khi lây nhiễm tối đa 5 phút, khi các thể thực khuẩn bị hấp phụ, hỗn hợp tế bào và thể thực khuẩn này sẽ được pha loãng. Có một giai đoạn tiềm ẩn trong đó số lượng phage không tăng, sau đó là một khoảng thời gian giải phóng rất ngắn, khi số lượng hạt phage tăng mạnh, khi tế bào bị ly giải và thế hệ phage được giải phóng, sau đó là số lượng phage vẫn ở mức tương tự vì không xảy ra tái nhiễm. Dựa trên đường cong này, chúng ta có thể phân biệt các giai đoạn sau: thời kỳ “tăng trưởng” sinh dưỡng (giai đoạn tiềm ẩn), thời kỳ giải phóng và tính năng suất phage trên 1 tế bào bị nhiễm bệnh. Trong thời kỳ tiềm ẩn, không thể phát hiện bất cứ thứ gì tương tự như các hạt phage ở vi khuẩn và không thể phân lập được từ các tế bào nằm trong đó. giai đoạn tiêm ẩn khởi phát lây nhiễm. Chỉ các hạt phage trưởng thành mới có khả năng gây nhiễm trùng vi khuẩn. Do đó, các phage độc ​​lực luôn gây ra cái chết của vi khuẩn và gây ra nhiễm trùng, điều này được thể hiện qua việc sản xuất các hạt virus mới có khả năng lây nhiễm sang các tế bào tiếp theo và các tế bào khác nhạy cảm với chúng.

Không giống như các thể độc lực, việc nhiễm các phage ôn đới không dẫn đến sự phân giải tế bào vi khuẩn, nhưng sự hình thành một trạng thái cùng tồn tại đặc biệt của phage với tế bào vi khuẩn được thực hiện. Sự cùng tồn tại này được thể hiện ở chỗ một thể thực khuẩn ban đầu nhất định hiện diện trong tế bào vi khuẩn mà không có bất kỳ điều kiện bất lợi nào đối với nó và được bảo tồn từ thế hệ này sang thế hệ khác. Ở những giai đoạn nhất định của sự cùng tồn tại như vậy, thể thực khuẩn được kích hoạt trong tế bào và đi vào trạng thái của chu kỳ phát triển tiêu hủy, gây ra sự ly giải tế bào và giải phóng thế hệ thể thực khuẩn. Các thể thực khuẩn như vậy được gọi là thể thực khuẩn tiềm ẩn hoặc thể thực khuẩn ôn đới, và trạng thái tồn tại vừa phải với thể thực khuẩn đó là thể thực thể, và vi khuẩn chứa thể thực khuẩn tiềm ẩn như vậy là vi khuẩn tiềm ẩn. Thuật ngữ vi khuẩn tiềm ẩn xuất phát từ thực tế là các nền văn hóa đã từng được phát hiện trong đó một thể thực khuẩn xuất hiện một cách tự nhiên và vi khuẩn này bắt đầu được coi là ô nhiễm môi trường nuôi cấy, nghĩa là nó xâm nhập vào môi trường nuôi cấy. virus vi khuẩn, và những nền văn hóa như vậy được gọi là lysogen, nghĩa là chúng tạo ra sự ly giải.

phương pháp nghiên cứu sinh học của virus và nhận dạng chúng. Trong virus học, các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi, nhờ đó có thể thiết lập cấu trúc phân tử của các hạt virus, phương pháp xâm nhập của chúng vào tế bào và các đặc điểm sinh sản của virus, cấu trúc chính của axit nucleic và protein của virus. Các phương pháp đang được phát triển để xác định trình tự các thành phần cấu thành axit nucleic của virus và axit amin protein. Có thể liên kết các chức năng của axit nucleic và protein mà chúng mã hóa với trình tự nucleotide và xác định nguyên nhân của các quá trình nội bào đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của nhiễm virus.

Các phương pháp nghiên cứu virus học còn dựa trên các quá trình miễn dịch (tương tác giữa kháng nguyên với kháng thể), đặc tính sinh học của virus (khả năng ngưng kết hồng cầu, tan máu, hoạt động của enzyme), đặc điểm tương tác của virus với tế bào chủ (bản chất của tác dụng gây bệnh tế bào). , hình thành các thể vùi nội bào, v.v.).

Trong chẩn đoán nhiễm virus, trong nuôi cấy, phân lập và xác định virus, cũng như trong sản xuất chế phẩm vắc xin, phương pháp nuôi cấy mô và tế bào được sử dụng rộng rãi. Sử dụng nuôi cấy tế bào sơ cấp, thứ cấp, ổn định liên tục và lưỡng bội. Nuôi cấy sơ cấp thu được bằng cách phân tán mô bằng enzyme phân giải protein (trypsin, collagenase). Nguồn tế bào có thể là các mô và cơ quan (thường là thận) của phôi người và động vật. Huyền phù tế bào trong môi trường dinh dưỡng được đặt trong cái gọi là nệm, chai hoặc đĩa Petri, tại đây, sau khi bám vào bề mặt của bình, các tế bào bắt đầu nhân lên. Đối với nhiễm virus, người ta thường sử dụng tế bào đơn lớp. Chất lỏng dinh dưỡng được rút ra, dịch huyền phù virus được thêm vào ở những độ pha loãng nhất định và sau khi tiếp xúc với tế bào, môi trường dinh dưỡng tươi, thường không có huyết thanh, được thêm vào.

Tế bào của hầu hết các nền văn hóa sơ cấp có thể được nuôi cấy; nền văn hóa như vậy được gọi là nền văn hóa thứ cấp. Với sự di chuyển tiếp theo của các tế bào, một quần thể tế bào giống nguyên bào sợi được hình thành, có khả năng sinh sản nhanh chóng, hầu hết chúng vẫn giữ được bộ nhiễm sắc thể ban đầu. Đây được gọi là tế bào lưỡng bội. Bằng cách nuôi cấy tế bào nối tiếp, thu được nuôi cấy tế bào liên tục ổn định. Trong quá trình di chuyển, các tế bào đồng nhất phân chia nhanh chóng với bộ nhiễm sắc thể dị bội xuất hiện. Các dòng tế bào ổn định có thể là một lớp hoặc huyền phù. Nuôi cấy một lớp phát triển dưới dạng một lớp liên tục trên bề mặt thủy tinh, trong khi nuôi cấy huyền phù phát triển dưới dạng huyền phù trong các bình khác nhau sử dụng các thiết bị trộn. Có hơn 400 dòng tế bào có nguồn gốc từ 40 loài động vật khác nhau (bao gồm linh trưởng, chim, bò sát, lưỡng cư, cá, côn trùng) và con người.

Các mảnh cơ quan và mô riêng lẻ (nuôi cấy cơ quan) có thể được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo. Những kiểu nuôi cấy này bảo tồn cấu trúc mô, điều này đặc biệt quan trọng đối với việc phân lập và di chuyển các loại vi-rút không sinh sản trong môi trường nuôi cấy mô không phân biệt (ví dụ: vi-rút Corona).

Trong môi trường nuôi cấy tế bào bị nhiễm bệnh, vi rút có thể được phát hiện bằng những thay đổi về hình thái tế bào, tác dụng gây bệnh tế bào, có thể đặc hiệu, sự xuất hiện của các thể vùi, bằng cách xác định kháng nguyên vi rút trong tế bào và trong dịch nuôi cấy; xác lập các đặc tính sinh học của dòng virus trong dịch nuôi cấy và chuẩn độ virus trong nuôi cấy mô, phôi gà hoặc động vật nhạy cảm; bằng cách xác định từng axit nucleic của virus trong tế bào bằng phương pháp lai phân tử hoặc tích lũy axit nucleic bằng phương pháp hóa học tế bào bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Phân lập virus là một quá trình tốn nhiều công sức và thời gian. Nó được thực hiện để xác định loại hoặc biến thể của vi-rút lưu hành trong quần thể (ví dụ: để xác định huyết thanh của vi-rút cúm, chủng vi-rút hoang dã hoặc vắc-xin của vi-rút bại liệt, v.v.); trong trường hợp cần thực hiện các biện pháp dịch tễ khẩn cấp; khi các loại hoặc biến thể mới của virus xuất hiện; nếu cần thiết, xác nhận chẩn đoán sơ bộ; để phát hiện virus trong các đối tượng môi trường. Khi phân lập vi rút, khả năng tồn tại của chúng trong cơ thể con người cũng như sự xuất hiện của nhiễm trùng hỗn hợp do hai hoặc nhiều vi rút gây ra sẽ được tính đến. Một quần thể virus đồng nhất về mặt di truyền thu được từ một virion được gọi là bản sao virus và quá trình thu được nó được gọi là nhân bản.

Để phân lập virus, người ta sử dụng phương pháp gây nhiễm cho động vật thí nghiệm nhạy cảm và phôi gà, nhưng hầu hết đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô. Sự hiện diện của vi rút thường được xác định bằng sự thoái hóa tế bào cụ thể (tác dụng gây bệnh tế bào), sự hình thành các tế bào đối chứng và hợp bào, phát hiện các thể vùi nội bào, cũng như một kháng nguyên cụ thể được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang, hấp thu máu, ngưng kết hồng cầu (đối với vi rút ngưng kết hồng cầu), v.v. . Những dấu hiệu này chỉ có thể được phát hiện sau 2-3 lần lây truyền virus.

Để phân lập một số loại vi-rút, chẳng hạn như vi-rút cúm, phôi gà được sử dụng và để phân lập một số vi-rút Coxsackie và một số loại vi-rút arbo, người ta sử dụng chuột sơ sinh. Việc xác định các virus phân lập được thực hiện bằng phản ứng huyết thanh học và các phương pháp khác.

Khi làm việc với virus, hiệu giá của chúng được xác định. Việc chuẩn độ virus thường được thực hiện trong nuôi cấy mô, xác định độ pha loãng cao nhất của chất lỏng chứa virus, tại đó xảy ra thoái hóa mô, hình thành các thể vùi và kháng nguyên đặc hiệu với virus. Phương pháp mảng bám có thể được sử dụng để chuẩn độ một số loại virus. Các mảng bám, hoặc các khuẩn lạc âm tính của vi rút, là các ổ tế bào bị vi rút phá hủy trong môi trường nuôi cấy mô một lớp dưới lớp phủ thạch. Việc đếm khuẩn lạc cho phép phân tích định lượng hoạt động lây nhiễm của virus trên cơ sở một hạt virus lây nhiễm tạo thành một mảng bám. Các mảng bám được phát hiện bằng cách nhuộm môi trường nuôi cấy bằng thuốc nhuộm nội sinh, thường là màu đỏ trung tính; các mảng bám không hấp thụ thuốc nhuộm và do đó có thể nhìn thấy dưới dạng các đốm sáng trên nền của các tế bào sống bị nhuộm màu. Hiệu giá virus được biểu thị bằng số đơn vị hình thành mảng bám trên 1 ml.

Việc tinh chế và cô đặc virus thường được thực hiện bằng siêu ly tâm vi phân, sau đó là ly tâm gradient nồng độ hoặc mật độ. Để tinh chế virus, người ta sử dụng các phương pháp miễn dịch, sắc ký trao đổi ion, chất hấp thụ miễn dịch, v.v.

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm về nhiễm virus bao gồm việc phát hiện mầm bệnh hoặc các thành phần của nó trong vật liệu lâm sàng; phân lập virus từ vật liệu này; chẩn đoán huyết thanh. Việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm trong từng trường hợp riêng lẻ phụ thuộc vào tính chất của bệnh, thời gian mắc bệnh và khả năng của phòng thí nghiệm. Chẩn đoán hiện đại về nhiễm virus dựa trên các phương pháp rõ ràng cho phép có được câu trả lời vài giờ sau khi lấy tài liệu lâm sàng ở giai đoạn đầu sau khi mắc bệnh. Chúng bao gồm kính hiển vi điện tử và điện tử miễn dịch, cũng như phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phương pháp lai phân tử. , phát hiện kháng thể thuộc lớp IgM, v.v.

Kính hiển vi điện tử của virus nhuộm màu âm tính giúp phân biệt virus và xác định nồng độ của chúng. Việc sử dụng kính hiển vi điện tử trong chẩn đoán nhiễm virus chỉ giới hạn ở những trường hợp nồng độ hạt virus trong mẫu lâm sàng khá cao (10,5 trong 1). ml và cao hơn). Nhược điểm của phương pháp là không có khả năng phân biệt các virus thuộc cùng một nhóm phân loại. Sự thiếu hụt này được khắc phục bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử miễn dịch. Phương pháp này dựa trên sự hình thành các phức hợp miễn dịch bằng cách thêm huyết thanh cụ thể vào các hạt virus, đồng thời cô đặc các hạt virus, cho phép chúng được xác định. Phương pháp này cũng được sử dụng để phát hiện kháng thể. Với mục đích chẩn đoán rõ ràng, việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử các chất chiết xuất từ ​​mô, phân, chất lỏng từ mụn nước và dịch tiết từ vòm họng được thực hiện. Kính hiển vi điện tử được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu hình thái của virus; khả năng của nó được mở rộng khi sử dụng các kháng thể được dán nhãn.

Phương pháp lai phân tử, dựa trên việc phát hiện các axit nucleic đặc hiệu của virus, giúp phát hiện các bản sao đơn lẻ của gen và không có độ nhạy nào bằng. Phản ứng dựa trên sự lai giữa các chuỗi DNA hoặc RNA bổ sung (đầu dò) và hình thành các cấu trúc chuỗi kép. Đầu dò rẻ nhất là DNA tái tổ hợp nhân bản. Đầu dò được dán nhãn tiền chất phóng xạ (thường là phốt pho phóng xạ). Việc sử dụng các phản ứng so màu là đầy hứa hẹn. Có một số phương pháp lai phân tử: lai điểm, lai blot, lai sandwich, lai tại chỗ, v.v..

Các kháng thể thuộc lớp IgM xuất hiện sớm hơn các kháng thể lớp G (vào ngày thứ 3-5 của bệnh) và biến mất sau vài tuần, vì vậy việc phát hiện chúng cho thấy một bệnh nhiễm trùng gần đây. Các kháng thể thuộc lớp lgM được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hoặc bằng xét nghiệm miễn dịch enzyme sử dụng kháng huyết thanh kháng μ (huyết thanh chống lại chuỗi nặng của lgM).

Các phương pháp huyết thanh học trong virus học dựa trên các phản ứng miễn dịch cổ điển (xem Phương pháp nghiên cứu miễn dịch học) : phản ứng cố định bổ thể, ức chế ngưng kết hồng cầu, trung hòa sinh học, khuếch tán miễn dịch, ngưng kết hồng cầu gián tiếp, tán huyết xuyên tâm, miễn dịch huỳnh quang, xét nghiệm miễn dịch enzyme, xét nghiệm miễn dịch phóng xạ. Các phương pháp vi mô cho nhiều phản ứng đã được phát triển và kỹ thuật của chúng không ngừng được cải tiến. Các phương pháp này được sử dụng để xác định vi-rút bằng cách sử dụng một bộ huyết thanh đã biết và để chẩn đoán huyết thanh để xác định mức tăng kháng thể trong huyết thanh thứ hai so với huyết thanh đầu tiên (huyết thanh đầu tiên được lấy vào những ngày đầu tiên sau khi mắc bệnh, huyết thanh thứ hai - sau 2- 3 tuần). Giá trị chẩn đoán không dưới mức tăng gấp bốn lần lượng kháng thể trong huyết thanh thứ hai. Nếu việc phát hiện các kháng thể thuộc lớp IgM cho thấy một bệnh nhiễm trùng gần đây, thì các kháng thể thuộc lớp IgC sẽ tồn tại trong vài năm và đôi khi là suốt đời.

Để xác định các kháng nguyên riêng lẻ của virus và kháng thể chống lại chúng trong hỗn hợp phức tạp mà không cần tinh chế protein sơ bộ, phương pháp miễn dịch được sử dụng. Phương pháp này kết hợp phân đoạn protein bằng cách sử dụng điện di trên gel polyacrylamide với việc chỉ định miễn dịch protein sau đó bằng phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme. Việc tách protein làm giảm yêu cầu về độ tinh khiết hóa học của kháng nguyên và giúp xác định từng cặp kháng nguyên-kháng thể riêng lẻ. Nhiệm vụ này có liên quan, ví dụ, trong chẩn đoán huyết thanh nhiễm HIV, trong đó các phản ứng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme dương tính giả được gây ra bởi sự hiện diện của kháng thể đối với các kháng nguyên tế bào, xuất hiện do không đủ tinh sạch protein virus. Việc xác định kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân với kháng nguyên virus bên trong và bên ngoài giúp xác định giai đoạn bệnh và khi phân tích quần thể, sự biến đổi của protein virus. Xét nghiệm miễn dịch đối với nhiễm HIV được sử dụng như một xét nghiệm xác nhận để xác định các kháng nguyên virus và kháng thể riêng lẻ đối với chúng. Khi phân tích quần thể, phương pháp này được sử dụng để xác định tính biến đổi của protein virut. Giá trị lớn của phương pháp nằm ở khả năng phân tích các kháng nguyên được tổng hợp bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, xác định kích thước của chúng và sự có mặt của các yếu tố quyết định kháng nguyên.

Thư mục: Bukrinskaya A.G. Virus học, M., 1986; Virus học, Phương pháp, ed. B. Meikhi, chuyển giới. từ tiếng Anh, M., 1988; Sổ tay các phương pháp nghiên cứu vi sinh và virus, ed. M.O. Birgera, M., 1982.

• - các phương pháp trung hòa chất thải có chứa các chất hữu cơ, dựa trên việc đốt nóng chúng nhờ hoạt động sống còn của các vi sinh vật hiếu khí ưa nhiệt...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp mô hóa học phát hiện enzyme dựa trên phản ứng hình thành kết tủa canxi hoặc magie photphat tại các vị trí định vị Hoạt động enzym khi ủ các phần mô bằng chất hữu cơ...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp xác định mô bào trong chế phẩm Mô thần kinh Và các cơ quan khác nhau sử dụng dung dịch bạc amoniac hoặc bạc pyridin-soda...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp đánh giá các giả định về bản chất của di truyền, dựa trên so sánh tỷ lệ người bệnh và người khỏe mạnh được quan sát và mong đợi trong các gia đình có bệnh di truyền, có tính đến phương pháp...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - Dùng để nghiên cứu cấu trúc, chức năng của tế bào, mô của con người, động vật và thực vật trong điều kiện bình thường, bệnh lý và thí nghiệm...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - Phương pháp xác định các chất hóa học trong mặt cắt mô học. Một phần không thể thiếu của G. m. và. là những phương pháp hóa học tế bào tiết lộ chất hóa học trong các tế bào của vết bẩn và dấu vân tay đã chuẩn bị sẵn...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp xác định định tính và định lượng glucose trong máu và nước tiểu, dựa trên quá trình oxy hóa glucose bằng oxy trong khí quyển với sự có mặt của enzyme glucose oxyase...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp chẩn đoán nghiên cứu dựa trên sự tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp xác định cấu trúc sợi mô liên kết và thần kinh đệm trong các chế phẩm mô học, dựa trên màu sắc đa dạng của chúng...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - 1) phương pháp nhuộm các chế phẩm mô học của lớp hạ bì bằng hemalone Mayer, dung dịch phèn kali và rhodamine; nhân tế bào bị nhuộm màu Màu xanh, eleidin - màu đỏ...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - trong y học - một tập hợp các phương pháp nghiên cứu và phân tích định lượng về trạng thái và hành vi của các đối tượng và hệ thống liên quan đến y học và chăm sóc sức khỏe...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - cách nghiên cứu các vật thể khác nhau bằng kính hiển vi...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - dựa trên việc sử dụng các định luật quang học liên quan đến bản chất, sự lan truyền và tương tác với vật chất của bức xạ điện từ trong vùng quang học...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - phương pháp nghiên cứu, đánh giá chất lượng các đối tượng môi trường bằng giác quan...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - tên gọi chung của một số phương pháp ngâm tẩm chế phẩm mô học bằng bạc để xác định sợi thần kinh đệm và các sợi argyrophilic khác...

  Bách khoa toàn thư y tế

• - Do Điều tra viên và Tòa án chỉ định để giải quyết những vấn đề đặc biệt phát sinh trong quá trình điều tra tội phạm và xét xử vụ án dân sự. Chúng cũng được thực hiện theo gợi ý của các bác sĩ pháp y...

  Bách khoa toàn thư y tế

Sách "Phương pháp nghiên cứu virus"

Cơn thịnh nộ chống lại cỗ máy giết người nhân danh (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Album đầu tiên của nhóm Los Angeles Rage Against The Machine kết hợp giữa hip-hop và hard rock, tạo hương vị cho chúng bằng những tuyên ngôn chính trị thời sự và thật thú vị là một lượng đáng kể nhịp điệu funk dày đặc. Trong bài hát “Killing in the Name” nằm trong đĩa đơn đầu tiên,

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Máy tình dục (1970)

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) Đến cuối những năm 1960, James Brown bắt đầu thử nghiệm. Tâm hồn đau thương với The Famous Flames đã nhường chỗ cho niềm vui rộn ràng với The J.B.'s. Một trong những cột mốc quan trọng nhất của kỷ nguyên funk đang đến gần là "Sex Machine", phiên bản dài 10 phút.

Cơn thịnh nộ chống lại cỗ máy