Virologiske forskningsmetoder for infektionssygdomme. Virology Research Backup med Time Machine

I laboratoriediagnostik virale infektioner der er tre hovedtilgange

1) direkte undersøgelse af materialet for tilstedeværelsen af ​​viralt antigen eller nukleinsyrer;

2) isolering og identifikation af virussen fra klinisk materiale;

Direkte metoder til diagnosticering af klinisk materiale

Direkte metoder er metoder, der tillader påvisning af et virus, viralt antigen eller viral nukleinsyre (NA) direkte i klinisk materiale, det vil sige de er de hurtigste (2-24 timer).

Elektronmikroskopi (EM). Ved at bruge denne metode kan du opdage selve virussen.

immunelektronmikroskopi (IEM), som bruger specifikke antistoffer mod vira. Som et resultat af interaktionen af ​​antistoffer med vira dannes komplekser, som er lettere at opdage efter negativ kontrast.

Immunfluorescensreaktion (RIF). Metoden er baseret på brugen af ​​antistoffer forbundet med et farvestof

RIF-metoden er meget udbredt til hurtigt at dechifrere ætiologien af ​​akutte luftvejsvirusinfektioner, når man analyserer fingeraftryksudstrygninger fra slimhinden i de øvre luftveje.

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Enzymimmunoassay-metoder til bestemmelse af virale antigener ligner i princippet RIF, men er baseret på mærkning af antistoffer med enzymer frem for farvestoffer.

Radioimmunoassay (RIA). Metoden er baseret på mærkning af antistoffer med radioisotoper, hvilket sikrer høj følsomhed ved bestemmelse af virusantigenet.

Molekylære metoder. Oprindeligt blev den klassiske metode til identifikation af det virale genom anset for at være den meget specifikke metode til NA-hybridisering, men i dag bruges isolering af virale genomer ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) i stigende grad.

Molekylær hybridisering af nukleinsyrer. Metoden er baseret på hybridisering af komplementære strenge af DNA eller RNA med dannelsen af ​​dobbeltstrengede strukturer og på at identificere dem

PCR er baseret på princippet om naturlig DNA-replikation. Essensen af ​​metoden er at gentage flere syntesecyklusser (amplifikation) af en virusspecifik DNA-sekvens ved hjælp af termostabil Taq DNA-polymerase og to specifikke primere - de såkaldte primere.

Cytologiske metoder har i dag begrænset diagnostisk værdi, men bør stadig bruges til en række infektioner. Der undersøges obduktionsmaterialer, biopsier og udstrygninger, som efter passende bearbejdning farves og analyseres i mikroskop.

For at isolere vira med succes, skal klinisk materiale tages i overensstemmelse med patogenesen for den formodede sygdom og på det tidligst mulige tidspunkt.

Som regel tager de:

- kl luftvejsinfektioner- næsesvælgskylning;

– til enterovirale infektioner – vaske og afføring (reo-, enterovirus);

– for læsioner af hud og slimhinder – afskrabninger, indholdet af blærer (herpes, skoldkopper);

– mod eksanteminfektioner – udvaskninger (mæslinger, røde hunde);

– til arbovirale infektioner – blod, cerebrospinalvæske.

For at isolere vira bruges cellekulturer, laboratoriedyr og kyllingeembryoner. Processen er langvarig og kræver nogle gange flere passager, før virussen opdages og identificeres ved hjælp af en eller flere metoder - neutraliseringsreaktion (RN), RIF, ELISA eller PCR.

Serodiagnose

Serologisk diagnose, baseret på antigen-antistof-reaktionen, kan bruges til at bestemme begge dele og spiller en rolle i at bestemme ætiologien af ​​en virusinfektion, selv når virusisoleringsresultaterne er negative.

RSK er en af ​​de traditionelle serologiske tests og bruges til at diagnosticere mange virusinfektioner. To systemer deltager i reaktionen: antistoffer fra patientens serum + standardvirus og fårets røde blodlegemer + antistoffer mod dem, samt titreret komplement. Hvis antistofferne og virussen matcher, binder dette kompleks komplement, og lysering af røde blodlegemer fra får forekommer ikke (positiv reaktion). Med negativ RSC fremmer komplement erytrocytlyse. Ulempen ved metoden er dens utilstrækkelige høje følsomhed og vanskeligheden ved at standardisere reagenser IF-metoden bruges ligesom ELISA til at bestemme antistoffer i serum.

Virologiske forskningsmetoder- metoder til undersøgelse af virussers biologi og deres identifikation. I virologi er molekylærbiologiske metoder i vid udstrækning brugt, ved hjælp af hvilke det var muligt at etablere den molekylære struktur af virale partikler, metoder til deres indtrængning i cellen og træk ved viral reproduktion, den primære struktur af virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder er ved at blive udviklet til at bestemme sekvensen af ​​bestanddelene af virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer. Det bliver muligt at forbinde nukleinsyrernes funktioner og de proteiner, de koder for, med sekvensen af ​​nukleotider og at fastslå årsagerne til de intracellulære processer, der spiller en rolle i vigtig rolle ved virusinfektion.

Virologiske forskningsmetoder er også baseret på immunologiske processer (interaktion af antigen med antistoffer), biologiske egenskaber af virussen (evne til hæmagglutination, hæmolyse, enzymatisk aktivitet), træk ved virussens interaktion med værtscellen (naturen af ​​​​den cytopatiske effekt). dannelse af intracellulære indeslutninger osv.).

Ved diagnosticering af virusinfektioner, ved dyrkning, isolering og identifikation af vira samt ved fremstilling af vaccinepræparater anvendes vævs- og cellekulturmetoden i vid udstrækning. Der anvendes primære, sekundære, stabile kontinuerte og diploide cellekulturer. Primære kulturer opnås ved at dispergere væv med proteolytiske enzymer (trypsin, collagenase). Kilden til celler kan være væv og organer (normalt nyrer) fra menneskelige og dyreembryoner. En suspension af celler i et næringsmedium anbringes i såkaldte madrasser, flasker eller petriskåle, hvor cellerne, efter at de er sat på overfladen af ​​karret, begynder at formere sig. Til virusinfektion bruges normalt et cellemonolag. Næringsvæsken drænes, virussuspensionen tilsættes i visse fortyndinger, og efter kontakt med cellerne tilsættes frisk næringsmedium, normalt uden serum.

Cellerne i de fleste primære kulturer kan subkultureres; sådan en kultur kaldes en sekundær kultur. Ved yderligere passage af celler dannes en population af fibroblastlignende celler, som er i stand til hurtig reproduktion, mest af som bevarer det oprindelige sæt af kromosomer. Disse er de såkaldte diploide celler. Ved serielt dyrkning af celler opnås stabile kontinuerte cellekulturer. Under passager fremkommer hurtigt delende homogene celler med et heteroploid sæt af kromosomer. Stabile cellelinjer kan være enkeltlags eller suspension. Enkeltlagskulturer vokser i form af et sammenhængende lag på glasoverfladen, mens suspensionskulturer vokser i form af suspensioner i forskellige beholdere ved hjælp af blandeanordninger. Der er mere end 400 cellelinjer, der stammer fra 40 forskellige dyrearter (herunder primater, fugle, krybdyr, padder, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker af individuelle organer og væv (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer af kulturer bevarer vævsstrukturen, hvilket er særligt vigtigt for isolering og passage af vira, der ikke formerer sig i udifferentierede vævskulturer (for eksempel coronavirus).

Hos de inficerede cellekulturer vira kan påvises ved ændringer i cellemorfologi, cytopatiske virkninger, som kan være specifikke, fremkomsten af ​​inklusioner, ved at bestemme virale antigener i cellen og i dyrkningsvæsken; etablering af de biologiske egenskaber af viralt afkom i kulturvæske og titrering af vira i vævskulturer, kyllingeembryoner eller følsomme dyr; ved at identificere individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller akkumulering af nukleinsyrer ved den cytokemiske metode ved anvendelse af fluorescerende mikroskopi.

Isolering af vira er en arbejdskrævende og tidskrævende proces. Det udføres for at bestemme typen eller varianten af ​​viruset, der cirkulerer blandt befolkningen (for eksempel for at identificere en serovariant af virus a, en vild eller vaccinestamme af virus a osv.); i tilfælde, hvor det er nødvendigt at gennemføre akutte epidemiologiske foranstaltninger; når nye typer eller varianter af vira dukker op; om nødvendigt bekræfte den foreløbige diagnose; at indikere vira i objekter miljø. Ved isolering af vira tages der hensyn til muligheden for deres persistens i den menneskelige krop samt forekomsten af ​​en blandet infektion forårsaget af to eller flere vira. En genetisk homogen population af viruset opnået fra en virion kaldes en viral klon, og processen med at opnå den kaldes kloning.

For at isolere vira anvendes infektion af modtagelige forsøgsdyr og kyllingeembryoner, men oftest anvendes vævskultur. Tilstedeværelsen af ​​virussen bestemmes normalt af specifik celledegeneration (cytopatisk effekt),

For at isolere en række vira, for eksempel virus a, bruges kyllingeembryoner, til at isolere nogle Coxsackie-vira og en række arbovirus - nyfødte mus. Identifikation af isolerede vira udføres ved hjælp af serologiske reaktioner og andre metoder.

Når man arbejder med vira, bestemmes deres titer. Titrering af vira udføres sædvanligvis i vævskultur, hvorved den højeste fortynding af den virusholdige væske bestemmes, ved hvilken vævsdegenerering sker, indeslutninger og virusspecifikke antigener dannes. Plaquemetoden kan bruges til at titrere en række vira. Plaques eller negative kolonier af vira er foci af celler ødelagt af virussen i en enkeltlags vævskultur under en agarcoating. Kolonitælling tillader det kvantitativ analyse infektiøs aktivitet af vira baseret på beregningen af, at én infektiøs viruspartikel danner én plak. Plaques påvises ved at farve kulturen med intravitale farvestoffer, sædvanligvis neutral rød; plaques adsorberer ikke farvestoffet og er derfor synlige som lyse pletter på baggrund af farvede levende celler. Virustiteren er udtrykt som antallet af plakdannende enheder pr ml.

Oprensning og koncentration af vira udføres sædvanligvis ved differentiel ultracentrifugering efterfulgt af koncentrations- eller tæthedsgradientcentrifugering. For at rense vira anvendes immunologiske metoder, ionbytterkromatografi, immunosorbenter osv.

Laboratoriediagnose af virale infektioner omfatter påvisning af patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; isolering af virussen fra dette materiale; serodiagnose. Valget af laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfælde afhænger af sygdommens art, sygdomsperioden og laboratoriets muligheder. Moderne diagnostik virale infektioner er baseret på ekspresmetoder, der gør det muligt at få svar flere timer efter indtagelse af klinisk materiale i de tidlige stadier efter sygdommen. Disse omfatter elektron- og immunelektronmikroskopi,

Elektronmikroskopi af negativt farvede vira gør det muligt at differentiere vira og bestemme deres koncentration. Brugen af ​​elektronmikroskopi til diagnosticering af virusinfektioner er begrænset til de tilfælde, hvor koncentrationen af ​​virale partikler i klinisk materiale er ret høj (10 5 i 1 ml og højere). Ulempen ved metoden er den manglende evne til at skelne vira, der tilhører den samme taksonomiske gruppe. Denne mangel overvindes ved brug af immunelektronmikroskopi. Metoden er baseret på dannelsen af ​​immunkomplekser ved at tilsætte specifikt serum til virale partikler, samtidig med at viruspartiklerne koncentreres, så de kan identificeres. Metoden bruges også til at påvise antistoffer. Til udtrykkelige diagnostiske formål udføres elektronmikroskopisk undersøgelse af vævsekstrakter, fæces, væske fra vesikler og sekreter fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er meget udbredt til at studere virussens morfogenese; dens muligheder udvides med brug af mærkede antistoffer.

Den molekylære hybridiseringsmetode, der er baseret på påvisning af virusspecifikke nukleinsyrer, gør det muligt at påvise enkelte kopier af gener og har ingen sidestykke i følsomhed. Reaktionen er baseret på hybridisering af komplementære DNA- eller RNA-strenge (prober) og dannelsen af ​​dobbeltstrengede strukturer. Den billigste probe er klonet rekombinant DNA. Sonden er mærket med radioaktive prækursorer (normalt radioaktivt fosfor). Brugen af ​​kolorimetriske reaktioner er lovende. Der er flere muligheder for molekylær hybridisering: plethybridisering, blot-hybridisering, sandwich-hybridisering, in situ-hybridisering osv.

Antistoffer af IgM-klassen optræder tidligere end klasse G-antistoffer (på 3.-5. sygdomsdagen) og forsvinder efter et par uger, så deres påvisning indikerer en nylig infektion. Antistoffer af IgM-klassen påvises ved immunfluorescens eller ved hjælp af enzymimmunoassay ved anvendelse af anti-m antisera (sera mod IgM tunge kæder).

Serologiske metoder i virologi er baseret på klassiske immunologiske reaktioner (se. Immunologiske forskningsmetoder ): komplementfikseringsreaktioner,

For at identificere individuelle antigener af vira og antistoffer mod dem i komplekse blandinger uden foreløbig oprensning af proteiner, anvendes immunblotting. Metoden kombinerer proteinfraktionering ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese med efterfølgende immunindikation af proteiner ved hjælp af enzymimmunoassaymetoden. Proteinadskillelse reducerer kravene til antigenets kemiske renhed og gør det muligt at identificere individuelle antigen-antistof-par. Denne opgave er relevant, for eksempel i serodiagnose af HIV-infektion, hvor falske positive reaktioner enzymimmunoassay er forårsaget af tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod cellulære antigener, som er til stede som et resultat af utilstrækkelig oprensning af virale proteiner. Identifikation af antistoffer i patientsera mod interne og eksterne virale antigener gør det muligt at bestemme sygdomsstadiet, og ved analyse af populationer, variabiliteten af ​​virale proteiner. Immunblotting for HIV-infektion bruges som en bekræftende test til at identificere individuelle virale antigener og antistoffer mod dem. Ved analyse af populationer bruges metoden til at bestemme variabiliteten af ​​virale proteiner. Metodens store værdi ligger i muligheden for at analysere antigener syntetiseret ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi, fastslå deres størrelser og tilstedeværelsen af ​​antigene determinanter.

Bibliografi: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virology, Methods, red. B. Meikhi, oversættelse. fra English, M., 1988; Håndbog i mikrobiologiske og virologiske forskningsmetoder, red. M.O. Birgera, M., 1982.

Virologiske forskningsmetoder er meget brugt i medicin til at diagnosticere mange smitsomme og nogle onkologiske sygdomme af viral karakter.

Virologiske forskningsmetoder bruges også til at identificere, studere deres biologi og evne til at påvirke dyre- og menneskeceller, hvilket yderligere hjælper med at forstå patogenesen virussygdomme og vælg de rigtige behandlingsmetoder. Ud over at fastslå sygdommens ætiologi og overvåge effektiviteten af ​​terapien er virologiske forskningsmetoder af stor betydning ved bestemmelse og udførelse af anti-epidemiforanstaltninger.

Direkte forskningsmetoder i virologi

Direkte virologiske forskningsmetoder gør det muligt at påvise et virus, viral nukleinsyre eller viralt antigen direkte i klinisk materiale og er derfor de hurtigste (hurtige metoder - op til 24 timer). Disse metoder er mindre informative og kræver laboratoriebekræftelse indirekte metoder diagnose på grund af den hyppige modtagelse af falsk negativ el falske positive resultater. Direkte forskningsmetoder omfatter følgende:

• elektronmikroskopi med virusfarvning ved hjælp af negativ kontrast (giver dig mulighed for at bestemme tilstedeværelsen af ​​en virus og dens koncentration i materialet, forudsat at 1 ml indeholder mindst 105 virale partikler);
• immunelektronmikroskopi, baseret på interaktionen af ​​specifikke antistoffer med vira for at danne komplekser, der er lettere at påvise med negativ kontrast end vira separat;
• enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) under anvendelse af enzymmærkede antistoffer, der binder til antigener, danner komplekser, der afsløres, når et substrat for det anvendte enzym tilsættes;
• immunfluorescensreaktion (RIF) - direkte eller indirekte - er baseret på brugen af ​​antistoffer forbundet med et fluorescerende farvestof;
• radioimmunoassay (RIA) er baseret på brugen af ​​radioaktivt mærkede antistoffer og gammatællere;
• cytologiske metoder er baseret på mikroskopisk undersøgelse af farvede udstrygninger, biopsiprøver og obduktionsmaterialer;
• molekylære metoder - molekylær hybridisering af nukleinsyrer og polymerasekædereaktion (den første er baseret på at identificere komplementære strenge af nukleinsyrer ved hjælp af et tag, den anden er på princippet om replikation af en virusspecifik DNA-sekvens i tre trin).

Der er tre muligheder for molekylær hybridisering af nukleinsyrer - punkthybridisering, blot-hybridisering (bruges til diagnose HIV-infektion) og in situ hybridisering (direkte i inficerede celler). PCR (polymerasekædereaktion) bruges nu i stigende grad til overvågning og diagnosticering af virusinfektioner på grund af denne metodes høje sensitivitet og specificitet.

Indirekte virologiske forskningsmetoder

Disse metoder er baseret på isolering og identifikation af virussen. Disse er mere arbejdskrævende og tidskrævende metoder, dog mere præcise. Materialet til sådanne undersøgelser kan være indholdet af vesikler, afskrabninger (hvis skoldkopper, herpetisk læsion hud og slimhinder), næsesvælgskylning (ved luftvejsinfektioner), blod og cerebrospinalvæske (til arbovirusinfektioner), fæces (ved enterovirale infektioner), skylninger (ved mæslinger, røde hunde osv.). På grund af det faktum, at vira kun kan formere sig i levende celler, dyrkes virussen i vævskultur, et kyllingefoster eller i et dyr (hamster, hvid mus, hund, kat, nogle arter af aber). Indikation af viruset udføres ved cytopatisk virkning, i hæmadsorptionsreaktionen, ved en farvetest, ved resultaterne af hæmagglutinationshæmningsreaktionen, ved ændringer eller deres fravær i kyllingeembryoner eller vævskulturer, ved overlevelse af følsomme dyr.

Serologiske diagnostiske metoder anvendt i virologi

Serologisk betyder virologiske forskningsmetoder baseret på antigen-antistof-reaktionen. I dette tilfælde anvendes oftest parrede blodsera, som tages med flere ugers mellemrum. Når antistoftiteren stiger med 4 gange eller mere, betragtes reaktionen som positiv. For at bestemme typespecificiteten af ​​virus anvendes en virusneutraliseringsreaktion, og til bestemmelse af gruppespecificitet anvendes en komplementfikseringsreaktion. Passive hæmagglutinationsreaktioner, hæmagglutinationshæmning, omvendte passive hæmagglutinationsreaktioner, RIF og forskellige enzymimmunoassays er også meget brugt.

Relativt for nylig blev der i løbet af genteknologisk forskning udviklet en metode til fremstilling af monoklonale antistoffer. Den snævre specificitet af monokloner overvindes ved anvendelse af flere monoklonale antistoffer mod forskellige virale determinanter. Dette har øget følsomheden og specificiteten af ​​virologiske forskningsmetoder med bestemmelse af virale antigener. I øjeblikket er der lavet mange forskellige testsystemer til immunologisk diagnostik virale infektioner.

metoder til at studere viras biologi og deres identifikation. I virologi er molekylærbiologiske metoder i vid udstrækning brugt, ved hjælp af hvilke det var muligt at etablere den molekylære struktur af virale partikler, metoder til deres indtrængning i cellen og træk ved viral reproduktion, den primære struktur af virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder er ved at blive udviklet til at bestemme sekvensen af ​​bestanddelene af virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer. Det bliver muligt at forbinde nukleinsyrernes funktioner og de proteiner, de koder for, med nukleotidsekvensen og at fastslå årsagerne til intracellulære processer, der spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​virusinfektion.

Virologiske forskningsmetoder er også baseret på immunologiske processer (interaktion af antigen med antistoffer), biologiske egenskaber af virussen (evne til hæmagglutination, hæmolyse, enzymatisk aktivitet), træk ved virussens interaktion med værtscellen (karakteristisk for cytopatisk effekt, dannelse af intracellulære indeslutninger osv.).

Ved diagnosticering af virusinfektioner, ved dyrkning, isolering og identifikation af vira samt ved fremstilling af vaccinepræparater anvendes vævs- og cellekulturmetoden i vid udstrækning. Der anvendes primære, sekundære, stabile kontinuerte og diploide cellekulturer. Primære kulturer opnås ved at dispergere væv med proteolytiske enzymer (trypsin, collagenase). Kilden til celler kan være væv og organer (normalt nyrer) fra menneskelige og dyreembryoner. En suspension af celler i et næringsmedium anbringes i såkaldte madrasser, flasker eller petriskåle, hvor cellerne, efter at de er sat på overfladen af ​​karret, begynder at formere sig. Til virusinfektion bruges normalt et cellemonolag. Næringsvæsken drænes, virussuspensionen tilsættes i visse fortyndinger, og efter kontakt med cellerne tilsættes frisk næringsmedium, normalt uden serum.

Cellerne i de fleste primære kulturer kan subkultureres; sådan en kultur kaldes en sekundær kultur. Ved yderligere passage af celler dannes en population af fibroblastlignende celler, som er i stand til hurtig reproduktion, hvoraf de fleste bevarer det oprindelige sæt af kromosomer. Disse er såkaldte diploide celler. Ved serielt dyrkning af celler opnås stabile kontinuerte cellekulturer. Under passager fremkommer hurtigt delende homogene celler med et heteroploid sæt af kromosomer. Stabile cellelinjer kan være enkeltlags eller suspension. Enkeltlagskulturer vokser i form af et sammenhængende lag på glasoverfladen, mens suspensionskulturer vokser i form af suspensioner i forskellige beholdere ved hjælp af blandeanordninger. Der er mere end 400 cellelinjer, der stammer fra 40 forskellige dyrearter (herunder primater, fugle, krybdyr, padder, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker af individuelle organer og væv (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer af kulturer bevarer vævsstrukturen, hvilket er særligt vigtigt for isolering og passage af vira, der ikke formerer sig i udifferentierede vævskulturer (for eksempel coronavirus).

I inficerede cellekulturer kan vira påvises ved ændringer i cellemorfologi, cytopatiske virkninger, som kan være specifikke, fremkomsten af ​​inklusioner, ved at bestemme virale antigener i cellen og i dyrkningsvæsken; etablering af de biologiske egenskaber af viralt afkom i kulturvæske og titrering af vira i vævskulturer, kyllingeembryoner eller følsomme dyr; ved at identificere individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller akkumulering af nukleinsyrer ved den cytokemiske metode ved anvendelse af fluorescerende mikroskopi.

Isolering af vira er en arbejdskrævende og tidskrævende proces. Det udføres for at bestemme typen eller varianten af ​​viruset, der cirkulerer blandt befolkningen (f.eks. for at identificere en serovariant af influenzavirussen, en vild- eller vaccinestamme af poliovirusset osv.); i tilfælde, hvor det er nødvendigt at gennemføre akutte epidemiologiske foranstaltninger; når nye typer eller varianter af vira dukker op; om nødvendigt bekræfte den foreløbige diagnose; til indikation af virus i miljøobjekter. Ved isolering af vira tages der hensyn til muligheden for deres persistens i den menneskelige krop samt forekomsten af ​​en blandet infektion forårsaget af to eller flere vira. En genetisk homogen population af viruset opnået fra en virion kaldes en viral klon, og processen med at opnå den kaldes kloning.

For at isolere vira anvendes infektion af modtagelige forsøgsdyr og kyllingeembryoner, men oftest anvendes vævskultur. Tilstedeværelsen af ​​en virus bestemmes sædvanligvis af specifik celledegeneration (cytopatisk effekt), dannelsen af ​​symplaster og syncytier, påvisning af intracellulære indeslutninger, såvel som et specifikt antigen påvist ved hjælp af immunfluorescens, hæmadsorption, hæmagglutination (til hæmagglutinerende vira) osv. . Disse tegn kan kun opdages efter 2-3 passager af virussen.

For at isolere en række vira, såsom influenzavirus, anvendes kyllingeembryoner, og til at isolere nogle Coxsackie-vira og en række arbovirus anvendes nyfødte mus. Identifikation af isolerede vira udføres ved hjælp af serologiske reaktioner og andre metoder.

Når man arbejder med vira, bestemmes deres titer. Titrering af vira udføres sædvanligvis i vævskultur, hvorved den højeste fortynding af den virusholdige væske bestemmes, ved hvilken vævsdegenerering sker, indeslutninger og virusspecifikke antigener dannes. Plaquemetoden kan bruges til at titrere en række vira. Plaques eller negative kolonier af vira er foci af celler ødelagt af virussen i en enkeltlags vævskultur under en agarcoating. Kolonitælling giver mulighed for en kvantitativ analyse af viruss infektiøse aktivitet på grundlag af, at én infektiøs viruspartikel danner én plak. Plaques påvises ved at farve kulturen med intravitale farvestoffer, sædvanligvis neutral rød; Plaques adsorberer ikke farvestoffet og er derfor synlige som lyse pletter på baggrund af farvede levende celler. Virustiteren er udtrykt som antallet af plakdannende enheder pr ml.

Oprensning og koncentration af vira udføres sædvanligvis ved differentiel ultracentrifugering efterfulgt af koncentrations- eller tæthedsgradientcentrifugering. For at rense vira anvendes immunologiske metoder, ionbytterkromatografi, immunosorbenter osv.

Laboratoriediagnose af virale infektioner omfatter påvisning af patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; isolering af virussen fra dette materiale; serodiagnose. Valget af laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfælde afhænger af sygdommens art, sygdomsperioden og laboratoriets muligheder. Moderne diagnostik af virale infektioner er baseret på ekspresmetoder, der gør det muligt at få svar flere timer efter indtagelse af klinisk materiale i de tidlige stadier efter sygdommen. Disse omfatter elektron- og immunelektronmikroskopi samt immunfluorescens, metoden til molekylær hybridisering , påvisning af antistoffer af IgM-klassen mv.

Elektronmikroskopi af negativt farvede vira gør det muligt at differentiere vira og bestemme deres koncentration. Brugen af ​​elektronmikroskopi til diagnosticering af virusinfektioner er begrænset til de tilfælde, hvor koncentrationen af ​​virale partikler i klinisk materiale er ret høj (10 5 i 1 ml og højere). Ulempen ved metoden er den manglende evne til at skelne vira, der tilhører den samme taksonomiske gruppe. Denne mangel overvindes ved brug af immunelektronmikroskopi. Metoden er baseret på dannelsen af ​​immunkomplekser ved at tilsætte specifikt serum til virale partikler, samtidig med at viruspartiklerne koncentreres, så de kan identificeres. Metoden bruges også til at påvise antistoffer. Til udtrykkelige diagnostiske formål udføres elektronmikroskopisk undersøgelse af vævsekstrakter, fæces, væske fra vesikler og sekreter fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er meget udbredt til at studere virussens morfogenese; dens muligheder udvides med brug af mærkede antistoffer.

Den molekylære hybridiseringsmetode, der er baseret på påvisning af virusspecifikke nukleinsyrer, gør det muligt at påvise enkelte kopier af gener og har ingen sidestykke i følsomhed. Reaktionen er baseret på hybridisering af komplementære DNA- eller RNA-strenge (prober) og dannelsen af ​​dobbeltstrengede strukturer. Den billigste probe er klonet rekombinant DNA. Sonden er mærket med radioaktive prækursorer (normalt radioaktivt fosfor). Brugen af ​​kolorimetriske reaktioner er lovende. Der er flere muligheder for molekylær hybridisering: plethybridisering, blot-hybridisering, sandwich-hybridisering, in situ-hybridisering osv.

Antistoffer af IgM-klassen optræder tidligere end klasse G-antistoffer (på 3.-5. sygdomsdagen) og forsvinder efter et par uger, så deres påvisning indikerer en nylig infektion. Antistoffer af lgM-klassen påvises ved immunfluorescens eller ved enzymimmunoassay ved anvendelse af anti-μ-antisera (sera mod de tunge kæder af lgM).

Serologiske metoder i virologi er baseret på klassiske immunologiske reaktioner (se Immunologiske forskningsmetoder) : komplementfikseringsreaktioner, hæmagglutinationshæmning, biologisk neutralisering, immundiffusion, indirekte hæmagglutination, radial hæmolyse, immunfluorescens, enzymimmunoassay, radioimmunoassay. Der er udviklet mikrometoder til mange reaktioner, og deres teknikker bliver konstant forbedret. Disse metoder bruges til at identificere vira ved hjælp af et sæt kendte sera og til serodiagnose for at bestemme stigningen i antistoffer i det andet serum sammenlignet med det første (det første serum tages de første dage efter sygdommen, det andet - efter 2- 3 uger). En diagnostisk værdi er ikke mindre end en firedobling af antistoffer i det andet serum. Hvis påvisningen af ​​antistoffer af IgM-klassen indikerer en nylig infektion, så varer antistoffer af IgC-klassen i flere år, og nogle gange livet ud.

For at identificere individuelle antigener af vira og antistoffer mod dem i komplekse blandinger uden foreløbig oprensning af proteiner, anvendes immunblotting. Metoden kombinerer proteinfraktionering ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese med efterfølgende immunindikation af proteiner ved hjælp af enzymimmunoassaymetoden. Proteinadskillelse reducerer kravene til antigenets kemiske renhed og gør det muligt at identificere individuelle antigen-antistof-par. Denne opgave er f.eks. relevant ved serodiagnose af HIV-infektion, hvor falsk-positive enzym-bundne immunosorbent assay-reaktioner er forårsaget af tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod cellulære antigener, som er til stede som følge af utilstrækkelig oprensning af virale proteiner. Identifikation af antistoffer i patientsera mod interne og eksterne virale antigener gør det muligt at bestemme sygdomsstadiet, og ved analyse af populationer, variabiliteten af ​​virale proteiner. Immunblotting for HIV-infektion bruges som en bekræftende test til at identificere individuelle virale antigener og antistoffer mod dem. Ved analyse af populationer bruges metoden til at bestemme variabiliteten af ​​virale proteiner. Metodens store værdi ligger i muligheden for at analysere antigener syntetiseret ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi, fastslå deres størrelser og tilstedeværelsen af ​​antigene determinanter.

20) Den vigtigste strukturelle komponent i virioner (komplette virale partikler) er et nukleocapsid, dvs. proteintilfældet (kapsid), der indeholder det virale genom (DNA eller RNA). Nukleokapsiden af ​​de fleste virale familier er omgivet af en lipoproteinkappe. Mellem kappen og nukleokapsiden af ​​nogle vira (ortho-, paramyxo-, rhabdo-, phylo- og retrovira) er der et ikke-glykosyleret matrixprotein, der giver yderligere stivhed til virionerne. Virus i de fleste familier har en kuvert, som spiller en vigtig rolle i smittefaren. Virioner erhverver deres ydre skal, når nukleocapsidet trænger ind i cellemembranen ved knopskydning. Kappeproteinerne kodes af virussen, og lipider tages fra cellemembranen. Glycoproteiner normalt i form af dimerer og trimerer danner peplomerer (fremspring) på overfladen af ​​virioner (ortho-, paramyxovirus, rhabdo-, phylo-, corona-, bunya-, arena-, retrovira). Glycosylerede fusionsproteiner er forbundet med peplomerer og spiller en nøglerolle i viral indtræden i cellen. Virion-kapsider og -kapper dannes af flere kopier af en eller flere typer proteinunderenheder gennem en proces med selvsamling. Interaktion i protein-protein-systemet, på grund af svage kemiske bindinger, fører til association af symmetriske capsider. Forskelle mellem vira i form og størrelse af virioner afhænger af formen, størrelsen og antallet af strukturelle proteinunderenheder og arten af ​​interaktionen mellem dem. Capsidet består af mange morfologisk adskilte underenheder (capsomerer), samlet af virale polypeptider på en strengt defineret måde i overensstemmelse med relativt simple geometriske principper. Proteinunderenheder, der forbinder med hinanden, danner kapsider af to typer symmetri: isometrisk og spiralformet. Strukturen af ​​nukleokapsiden af ​​indkapslede vira svarer til strukturen af ​​nukleokapsiden af ​​ikke-indkapslede vira. På overfladen af ​​virusskallen skelnes morfologisk udtrykte glycoproteinstrukturer - peplomerer -. Sammensætningen af ​​supercapsidskallen inkluderer lipider (op til 20-35%) og kulhydrater (op til 7-8%) af cellulær oprindelse. Den består af et dobbelt lag af cellulære lipider og virusspecifikke proteiner placeret uden for og inde i lipidbiolaget. Det ydre lag af supercapsidskallen er repræsenteret af peplomerer (fremspring) af en eller flere typer, bestående af et eller flere glycoproteinmolekyler. Nukleokapsiden af ​​indkapslede vira kaldes ofte kernen, og den centrale del af virioner, der indeholder nukleinsyren, kaldes nukleoiden. Capsomerer (peplomerer) består af strukturelle enheder bygget af en eller flere homologe eller heterologe polypeptidkæder (proteinunderenheder). klassificering af vira Isometriske kapsider er ikke kugler, men regulære polyedre (icosaeder). Deres lineære dimensioner er identiske langs symmetriakserne. Ifølge Kaspar og Klug (1962) er capsomerer i capsider arrangeret efter icosahedral symmetri. Sådanne kapsider består af identiske underenheder, der danner et icosahedron. De har 12 hjørner (hjørner), 30 flader og 20 flader i form af ligebenede trekanter. I overensstemmelse med denne regel dannes kapsiden af ​​poliovirus og mund- og klovsygevirus af 60 proteinstrukturenheder, som hver består af fire polypeptidkæder. Ikosaederet løser optimalt problemet med at pakke gentagende underenheder ind i en streng kompakt struktur med minimum volumen. Kun visse konfigurationer af strukturelle underenheder kan danne overflader og danne hjørner og flader af det virale icosahedron. For eksempel danner de strukturelle underenheder af adenovirus hexagonale kapsomerer (hexoner) på overflader og kanter og pentaedriske capsomerer (peptoner) på toppene. I nogle vira dannes begge typer capsomerer af de samme polypeptider, i andre - af forskellige polypeptider. Da de strukturelle underenheder af forskellige vira adskiller sig fra hinanden, forekommer nogle vira mere sekskantede, andre mere sfæriske. Alle kendte DNA-holdige hvirveldyrvira, med undtagelse af koppevirus, samt mange RNA-holdige vira (7 familier), har en kubisk type kapsidsymmetri. Reovira har i modsætning til andre hvirveldyrvirus et dobbelt kapsid (ydre og indre), hver bestående af morfologiske enheder. Vira med en spiralformet symmetri har udseendet af en cylindrisk trådlignende struktur; deres genomiske RNA har form af en helix og er placeret inde i kapsiden. Alle dyrevira med spiralformet symmetri er omgivet af en lipoproteinkappe. Helix-nukleokapsider er karakteriseret ved længde, diameter, helix-pitch og antallet af capsomerer pr. helix-omdrejning. I Sendai-virussen (paramyxovirus) er nukleocapsidet således en helix på ca. 1 μm lang, 20 nm i diameter og 5 nm i pitch. Capsiden består af cirka 2400 strukturelle enheder, som hver er et protein med molekylær vægt 60 kD. Der er 11-13 underenheder for hver drejning af helixen. I vira med en spiralformet nukleocapsidsymmetri sikrer foldningen af ​​proteinmolekyler til en helix maksimal interaktion mellem nukleinsyren og proteinunderenhederne. I icosahedrale vira er nukleinsyren snoet inde i virionerne og interagerer med et eller flere polypeptider placeret inde i kapsiden.

Antireceptorer (receptorer) Viral- overfladevirionproteiner, for eksempel hæmagglutinin, som på en komplementær måde binder til den tilsvarende receptor i den modtagelige celle.

21) Immunologiske metoder i virologiske undersøgelser.

Serologiske tests varierer i deres evne til at påvise individuelle klasser af antistoffer. Agglutinationstesten påviser f.eks. IgG-antistoffer godt, men er mindre følsom for påvisning af IgG-antistoffer. Komplementfiksering og hæmolysereaktioner, som kræver komplement, påvises ikke af ikke-komplementfikserende antistoffer, såsom IgA-antistoffer og IgE-antistoffer. Virusneutraliseringsreaktionen involverer kun antistoffer rettet mod antigene determinanter af virionoverfladen forbundet med patogenicitet. Følsomhed I. m. og. overgår alle andre metoder til at studere antigener og antistoffer; især radioimmunoassays og enzymimmunoassays gør det muligt at påvise tilstedeværelsen af ​​protein i mængder målt i nanogram og endda pikogram. Med hjælp fra I. m. og. bestemme gruppen og kontrollere blodets sikkerhed (hepatitis B og HIV-infektion). Ved transplantation af væv og organer, I. m. og. giver dig mulighed for at bestemme vævskompatibilitet og testmetoder til at undertrykke inkompatibilitet. I retsmedicin bruges Castellani-reaktionen til at bestemme artsspecificiteten af ​​et protein og agglutinationsreaktionen til at bestemme blodgruppen.

Immunologiske metoder er meget udbredt i laboratoriediagnostik af infektionssygdomme. Sygdommens ætiologi er også etableret baseret på stigningen i antistoffer mod patogenet i det rekonvalescente blodserum sammenlignet med en prøve taget i de første dage af sygdommen. Baseret på I. m. og. studere befolkningens immunitet over for masseinfektioner, såsom influenza, og også evaluere effektiviteten af ​​forebyggende vaccinationer.

Afhængigt af deres mekanisme og under hensyntagen til resultaterne af I. m. og. kan opdeles i reaktioner baseret på fænomenet agglutination; reaktioner baseret på fænomenet nedbør; reaktioner, der involverer komplement; neutraliseringsreaktion; reaktioner ved hjælp af kemiske og fysiske metoder.

Reaktioner baseret på fænomenet agglutination. Agglutination er limning af celler eller individuelle partikler, der bærer et antigen ved hjælp af immunserum til dette antigen.

Den bakterielle agglutinationsreaktion ved anvendelse af det passende antibakterielle serum er en af ​​de enkleste serologiske reaktioner. En suspension af bakterier tilsættes forskellige fortyndinger af testblodserumet, og efter en vis kontakttid ved t°37° registreres det, ved hvilken højeste fortynding af blodserumagglutination der forekommer. Den bakterielle agglutinationsreaktion bruges til at diagnosticere mange infektionssygdomme: brucellose, tularæmi, tyfus og paratyfus, bacillær dysenteri, tyfus.

Passiv eller indirekte hæmagglutinationsreaktion (RPHA, RNHA). Det bruger røde blodlegemer eller neutrale syntetiske materialer (for eksempel latexpartikler), på hvis overflade antigener (bakterier, virale, væv) eller antistoffer sorberes. Deres agglutination opstår, når passende sera eller antigener tilsættes.

Den passive hæmagglutinationsreaktion bruges til at diagnosticere sygdomme forårsaget af bakterier ( tyfus og paratyfus, dysenteri, brucellose, pest, kolera osv.), protozoer (malaria) og vira (influenza, adenovirale infektioner, viral hepatitis B, mæslinger, flåtbåren hjernebetændelse, Krim hæmoragisk feber osv.), samt til at bestemme nogle hormoner, identificere overfølsomhed patient til lægemidler og hormoner som penicillin og insulin.

Hæmagglutinationshæmningsreaktionen (HAI) er baseret på fænomenet immunserum, der forhindrer (hæmmer) hæmagglutination af erytrocytter af vira og bruges til at påvise og titrere antivirale antistoffer. Det tjener som den vigtigste metode til serodiagnose af influenza, mæslinger, røde hunde, fåresyge, flåtbåren hjernebetændelse og andre virale infektioner, hvis forårsagende stoffer har hæmagglutinerende egenskaber. for eksempel, til serodiagnose af flåtbåren encephalitis, hældes to gange fortyndinger af patientens serum i en alkalisk boratbufferopløsning i panelets brønde. Derefter tilsættes en vis mængde, sædvanligvis 8 AU (agglutinerende enheder), flåtbåren encephalitis-antigen, og efter 18 timers eksponering ved t°4° tilsættes en suspension af røde blodlegemer fra gås fremstillet i en sur phosphat-pufret opløsning . Hvis patientens blodserum indeholder antistoffer mod den flåtbårne encephalitisvirus, neutraliseres antigenet, og røde blodlegemer agglutineres ikke.

Reaktioner baseret på fænomenet nedbør. Udfældning sker som et resultat af interaktionen af ​​antistoffer med opløselige antigener. Det enkleste eksempel på en udfældningsreaktion er dannelsen i et reagensglas af et uigennemsigtigt udfældningsbånd ved grænsen af ​​lagdelingen af ​​antigenet på antistoffet. Forskellige typer af udfældningsreaktioner i semi-flydende agar eller agarosegeler er meget udbredt (dobbelt immundiffusionsmetode ifølge Ouchterlohn, radial immundiffusionsmetode, immunoeletroforese), som er både kvalitative og kvantitative af natur. Som et resultat af den frie diffusion af antigener og antistoffer i gelen i zonen med deres optimale forhold, dannes specifikke komplekser - udfældningsbånd, som detekteres visuelt eller ved farvning. Et særligt træk ved metoden er, at hvert antigen-antistof-par danner et individuelt præcipitationsbånd, og reaktionen afhænger ikke af tilstedeværelsen af ​​andre antigener og antistoffer i det undersøgte system.

Reaktioner, der involverer komplement, som bruges som frisk blodserum marsvin, er baseret på komplement-subkomponenten Clq og derefter andre komplementkomponenters evne til at binde sig til immunkomplekser.

Komplementfikseringsreaktionen (CFR) tillader titrering af antigener eller antistoffer i overensstemmelse med graden af ​​komplementfiksering af antigen-antistofkomplekset. Denne reaktion består af to faser: interaktionen af ​​antigenet med testblodserumet (testsystemet) og interaktionen af ​​hæmolytisk serum med røde blodlegemer fra får (indikatorsystem). Med en positiv reaktion i det undersøgte system forekommer komplementfiksering, og derefter med tilsætning af erytrocytter sensibiliseret af antistoffer observeres hæmolyse ikke. Reaktionen bruges til serodiagnose af syfilis (Wassermann-reaktion), virale og bakterielle infektioner.

Neutraliseringsreaktionen er baseret på antistoffers evne til at neutralisere visse specifikke funktioner af makromolekylære eller opløselige antigener, for eksempel enzymaktivitet, bakterielle toksiner og viral patogenicitet. Reaktionen af ​​toksinneutralisering kan vurderes ved den biologiske effekt, for eksempel titreres anti-stivkrampe- og anti-botulinumserum. En blanding af toksin og antiserum indgivet til dyr forårsager ikke deres død. Forskellige versioner af neutraliseringsreaktionen anvendes i virologi. Ved at blande vira med det passende antiserum og indføre denne blanding i dyr eller i cellekulturer, neutraliseres virusenes patogenicitet, og dyrene bliver ikke syge, og kulturernes celler ødelægges ikke.

Reaktioner ved hjælp af kemiske og fysiske mærker. Immunfluorescens involverer brugen af ​​fluorokrom-mærkede antistoffer, mere præcist, immunoglobulinfraktionen IgG antistoffer. Et antistof mærket med et fluorokrom danner et antigen-antistofkompleks med et antigen, som bliver tilgængeligt for observation under et mikroskop i UV-stråler, der exciterer fluorokromet. Den direkte immunfluorescensreaktion bruges til at studere cellulære antigener, detektere virus i inficerede celler og detektere bakterier og rickettsiae i udstrygninger.

Metoden til indirekte immunfluorescens er mere udbredt. baseret på påvisning af antigen-antistof-komplekset ved hjælp af luminescerende immunserum mod IgG-antistoffer og bruges til at påvise ikke kun antigener, men også titrere antistoffer.

Immunoenzym, eller enzymimmunologiske, metoder er baseret på brugen af ​​antistoffer konjugeret med enzymer, hovedsageligt peberrodsperoxidase eller alkalisk fosfatase. I lighed med immunfluorescens bruges enzymimmunoassay-metoden til at påvise antigener i celler eller titrere antistoffer på antigenholdige celler.

Den radioimmunologiske metode er baseret på brugen af ​​radioisotopmærker af antigener eller antistoffer. Det er den mest følsomme metode til bestemmelse af antigener og antistoffer, der bruges til at bestemme hormoner, medicinske stoffer og antibiotika, til diagnosticering af bakterielle, virale, rickettsiale, protozosygdomme, undersøgelse af blodproteiner, vævsantigener.

Immunoblotting bruges til at påvise antistoffer mod individuelle antigener eller til at "genkende" antigener fra kendte sera. Metoden består af 3 trin: separation af biologiske makromolekyler (for eksempel en virus) til individuelle proteiner ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese; overførsel af separerede proteiner fra gelen til en fast understøtning (blot) ved at placere en polyacrylamidgelplade på aktiveret papir eller nitrocellulose (elektroblotting); påvisning af de ønskede proteiner på substratet under anvendelse af direkte eller indirekte enzymimmunoassay. Immunblotting bruges som en diagnostisk metode til HIV-infektion. Påvisningen af ​​antistoffer mod et af proteinerne i virussens ydre skal har diagnostisk værdi.

22) Typer af symmetri af vira (kubisk, spiral, blandet). Interaktion mellem proteiner og nukleinsyrer under pakning af virale genomer.

Afhængigt af interaktionen mellem capsidet og nukleinsyren kan virale partikler opdeles i flere typer symmetri:

1). Kubisk type symmetri.

Kubiske kapsider er icosidere med cirka 20 trekantede overflader og 12 hjørner. De danner en struktur, der ligner en sfærisk formation, men i virkeligheden er det et polyeder. I nogle tilfælde er specielle lipoproteinformationer kaldet rygsøjler knyttet til hjørnerne af sådanne icosaedriske polyedre. Disse pigges rolle er formodentlig reduceret til interaktionen af ​​virioner eller virale partikler med de tilsvarende områder af værtsceller, der er følsomme over for dem. Med kubisk symmetri er den virale nukleinsyre pakket tæt (viklet sammen til en kugle), og proteinmolekyler omgiver den og danner et polyeder (icosahedron). Et icosahedron er et polyeder med tyve trekantede flader, med kubisk symmetri og tilnærmelsesvis sfærisk form. Icosahedrale vira omfatter herpes simplex-virus, reovira osv.

2). Spiral type af symmetri. Spiralformede kapsider er noget enklere i strukturen. De der. Capsomererne, der udgør capsidet, dækker det spiralformede NA og danner også en ret stabil proteinskal af disse vira. Og når man bruger højopløselige elektronmikroskoper og passende forberedelsesmetoder, kan man se spiralformede strukturer på vira. Med kapsidens spiralformede symmetri danner den virale nukleinsyre en spiral (eller spiralformet) figur, hul indvendig, og proteinunderenhederne (capsomererne) er også arrangeret omkring den i en spiral (rørformet kapsid). Et eksempel på en virus med en spiralformet kapsidsymmetri er tobaksmosaikviruset, som er stavformet og 300 nm langt med en diameter på 15 nm. Den virale partikel indeholder et RNA-molekyle på omkring 6.000 nukleotider i størrelse. Capsidet består af 2000 identiske proteinunderenheder arrangeret i en spiral.

3). Blandet eller kompleks type symmetri. Som regel påvises denne type symmetri hovedsageligt blandt bakterielle vira. Og klassiske eksempler er disse fager coli eller tempererede fager. Disse er komplekse formationer, der har et hoved med indre nukleinindhold, forskellige slags vedhæng, en haleproces og enheder af varierende grad af kompleksitet. Og hver komponent af sådanne partikler er udstyret med en specifik funktion, der realiseres under virussens interaktion med cellen. Med andre ord er en kompleks type symmetri en kombination af kubisk symmetri, hovedet er et icosider polyhedron og de stavformede formationer er haleprocesserne. Selvom der blandt bakterievira også er ganske enkelt organiserede virioner, der er primitive nukleokapsider, sfæriske eller kubiske i form. Bakterievira er de mest komplekse sammenlignet med plantevirus og dyrevira.

24) Interaktion af fag med celle. Virulente og tempererede fager.

Adsorption.

Interaktionen begynder med vedhæftning af virale partikler til celleoverfladen. Processen bliver mulig i nærværelse af passende receptorer på overfladen af ​​cellen og anti-receptorer på overfladen af ​​den virale partikel.

Virus bruger cellereceptorer designet til at transportere nødvendige stoffer: næringsstofpartikler, hormoner, vækstfaktorer mv.

Receptorer: proteiner, kulhydratkomponent af proteiner og lipider, lipider. Specifikke receptorer bestemmer den videre skæbne for den virale partikel (transport, levering til områder af cytoplasmaet eller kernen). Virusset kan også binde sig til uspecifikke receptorer og endda trænge ind i cellen. Denne proces forårsager dog ikke udviklingen af ​​infektion.

Først dannes en enkelt binding mellem antireceptoren og receptoren. En sådan forbindelse er skrøbelig og kan brydes. For dannelse af irreversibel adsorption er multivalent vedhæftning nødvendig. Stabil binding opstår på grund af den frie bevægelse af receptormolekyler i membranen. Når en virus interagerer med en celle, observeres en stigning i lipidfluiditet og dannelsen af ​​receptorfelter i interaktionsområdet mellem virussen og cellen. Receptorer for nogle vira kan kun være til stede i et begrænset sæt værtsceller. Dette bestemmer kroppens følsomhed over for denne virus. Viralt DNA og RNA har således evnen til at inficere en bredere række af værtsceller.

Antireceptorer kan findes i unikke virale organeller: vedhængsstrukturer i T-bakteriofager, fibre i adenovira, pigge på overfladen af ​​virale membraner, corona i coronavirus.

Trænge ind.

2 mekanismer – receptorendocytose og membranfusion.

Receptor endocytose:

Den sædvanlige mekanisme for indtrængen af ​​næringsstoffer og regulerende stoffer i cellen. Forekommer i specialiserede områder - hvor der er specielle gruber dækket med clathrin; i bunden af ​​pit er der specifikke receptorer. Gruberne giver hurtig invagination og dannelse af clathrin-coatede vakuoler (der går ikke mere end 10 minutter fra tidspunktet for adsorption; op til 2000 vakuoler kan dannes på et minut). Vakuoler smelter sammen med større cytoplasmatiske vakuoler og danner receptorosomer (der ikke længere indeholder clathrin), som igen smelter sammen med lysosomer.

Fusion af virale og cellulære membraner:

I kappevira er fusion forårsaget af punktinteraktioner af det virale protein med lipiderne i cellemembranen, som et resultat af hvilket den virale lipoproteinkappe integreres med cellemembranen. I ikke-indkapslede vira interagerer et af overfladeproteinerne også med lipider cellemembraner og den indre komponent passerer gennem membranen (i paramyxovirus - F-protein, i orthomyxovirus - HA2 hæmagglutinerende underenhed). Konformationen af ​​overfladeproteiner er påvirket af pH.

Strip.

Under denne proces forsvinder infektiøs aktivitet, følsomhed over for nukleaser opstår ofte, og der opstår resistens mod antistoffer. Slutproduktet af afklædning er nukleinsyrer bundet til det interne virale protein. Afklædningsstadiet begrænser også muligheden for infektion (virus er ikke i stand til at klæde sig af i hver celle). Afklædning sker i specialiserede områder af cellen: lysosomer, Golgi-apparat, perinukleært rum.

Afklædning sker som følge af en række reaktioner. For eksempel, i picornavirus, sker afklædning med dannelsen af ​​mellemliggende subvirale partikler med størrelser fra 156 til 12S. I adenovira i cytoplasma og nukleare porer og har mindst 3 stadier:

Dannelse af subvirale partikler med en højere tæthed end virioner;

Dannelse af kerner, der mangler 3 virale proteiner;

Dannelse af et DNA-proteinkompleks, hvor DNA er kovalet bundet til et terminalt protein.

Karakteristika af virulente og tempererede fager.

Når en bakterie er inficeret med en fag, opstår der en såkaldt lytisk infektion, dvs. en infektion, der ender med lysis af værtscellen, men dette er kun karakteristisk for de såkaldte virulente fager, hvis interaktion med celle fører til celledød og dannelse af fagafkom.

I dette tilfælde skelnes de følgende stadier i forhold til fagens interaktioner med cellen: blanding af fagen med cellekulturen (infektionsmangfoldighed er 1 fag pr. 10 celler), og koncentrationen skal være høj nok til at tillade fagerne at kontakte cellerne. Så det ikke sker geninfektion– efter infektion i højst 5 minutter, når fagerne er adsorberet, fortyndes denne blanding af celler og fag. Der er en latent periode, hvor antallet af fager ikke stiger, derefter en meget kort frigivelsesperiode, når antallet af fagpartikler stiger kraftigt, når cellen lyseres og fagafkommet frigives, og derefter antallet af fager. forbliver på samme niveau, fordi geninfektion ikke forekommer. Baseret på denne kurve kan vi skelne mellem disse faser: den vegetative periode med "vækst" (latent periode), frigivelsesperioden og beregne fagudbyttet pr. 1 inficeret celle. I den latente periode er det ikke muligt at påvise noget, der ligner fagpartikler i bakterier, og det er ikke muligt at isolere fra sådanne celler placeret i latent periode infektiøs debut. Kun modne fagpartikler er i stand til at forårsage infektion af bakterier. Virulente fager forårsager således altid bakteriers død og producerer en infektion, som afsløres i produktionen af ​​nye virale partikler, der er i stand til at inficere de følgende og andre celler, der er følsomme over for dem.

I modsætning til virulente fører infektion med tempererede fager ikke til lysis af bakterieceller, men dannelsen af ​​en særlig tilstand af sameksistens af fagen med bakteriecellen realiseres. Denne sameksistens kommer til udtryk i, at en vis begyndelse af fagen er til stede i bakteriecellen uden nogen ugunstige betingelser for den og bevares fra generation til generation. På visse stadier af en sådan sameksistens aktiveres fagen i cellen og går ind i en tilstand af den lytiske udviklingscyklus, hvilket forårsager cellelyse og frigivelse af fagafkom. Sådanne fager kaldes lysogene eller tempererede fager, og tilstanden af ​​moderat eksistens med fagen er lysogeni, og bakterier, der indeholder en sådan skjult fag, er lysogene bakterier. Udtrykket lysogene bakterier kom fra det faktum, at der engang blev opdaget kulturer, hvor en fag spontant dukkede op, og denne bakteriofag begyndte at blive betragtet som forurening af kulturen, det vil sige, at den kommer ind i kulturen bakteriel virus, og sådanne kulturer kaldes lysogene, det vil sige, de genererer lysis.

metoder til at studere viras biologi og deres identifikation. I virologi er molekylærbiologiske metoder i vid udstrækning brugt, ved hjælp af hvilke det var muligt at etablere den molekylære struktur af virale partikler, metoder til deres indtrængning i cellen og træk ved viral reproduktion, den primære struktur af virale nukleinsyrer og proteiner. Metoder er ved at blive udviklet til at bestemme sekvensen af ​​bestanddelene af virale nukleinsyrer og proteinaminosyrer. Det bliver muligt at forbinde nukleinsyrernes funktioner og de proteiner, de koder for, med nukleotidsekvensen og at fastslå årsagerne til intracellulære processer, der spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​virusinfektion.

Virologiske forskningsmetoder er også baseret på immunologiske processer (interaktion af antigen med antistoffer), biologiske egenskaber af virussen (evne til hæmagglutination, hæmolyse, enzymatisk aktivitet), træk ved virussens interaktion med værtscellen (naturen af ​​​​den cytopatiske effekt). dannelse af intracellulære indeslutninger osv.).

Ved diagnosticering af virusinfektioner, ved dyrkning, isolering og identifikation af vira samt ved fremstilling af vaccinepræparater anvendes vævs- og cellekulturmetoden i vid udstrækning. Der anvendes primære, sekundære, stabile kontinuerte og diploide cellekulturer. Primære kulturer opnås ved at dispergere væv med proteolytiske enzymer (trypsin, collagenase). Kilden til celler kan være væv og organer (normalt nyrer) fra menneskelige og dyreembryoner. En suspension af celler i et næringsmedium anbringes i såkaldte madrasser, flasker eller petriskåle, hvor cellerne, efter at de er sat på overfladen af ​​karret, begynder at formere sig. Til virusinfektion bruges normalt et cellemonolag. Næringsvæsken drænes, virussuspensionen tilsættes i visse fortyndinger, og efter kontakt med cellerne tilsættes frisk næringsmedium, normalt uden serum.

Cellerne i de fleste primære kulturer kan subkultureres; sådan en kultur kaldes en sekundær kultur. Ved yderligere passage af celler dannes en population af fibroblastlignende celler, som er i stand til hurtig reproduktion, hvoraf de fleste bevarer det oprindelige sæt af kromosomer. Disse er såkaldte diploide celler. Ved serielt dyrkning af celler opnås stabile kontinuerte cellekulturer. Under passager fremkommer hurtigt delende homogene celler med et heteroploid sæt af kromosomer. Stabile cellelinjer kan være enkeltlags eller suspension. Enkeltlagskulturer vokser i form af et sammenhængende lag på glasoverfladen, mens suspensionskulturer vokser i form af suspensioner i forskellige beholdere ved hjælp af blandeanordninger. Der er mere end 400 cellelinjer, der stammer fra 40 forskellige dyrearter (herunder primater, fugle, krybdyr, padder, fisk, insekter) og mennesker.

Stykker af individuelle organer og væv (organkulturer) kan dyrkes i kunstige næringsmedier. Disse typer af kulturer bevarer vævsstrukturen, hvilket er særligt vigtigt for isolering og passage af vira, der ikke formerer sig i udifferentierede vævskulturer (for eksempel coronavirus).

I inficerede cellekulturer kan vira påvises ved ændringer i cellemorfologi, cytopatiske virkninger, som kan være specifikke, fremkomsten af ​​inklusioner, ved at bestemme virale antigener i cellen og i dyrkningsvæsken; etablering af de biologiske egenskaber af viralt afkom i kulturvæske og titrering af vira i vævskulturer, kyllingeembryoner eller følsomme dyr; ved at identificere individuelle virale nukleinsyrer i celler ved molekylær hybridisering eller akkumulering af nukleinsyrer ved den cytokemiske metode ved anvendelse af fluorescerende mikroskopi.

Isolering af vira er en arbejdskrævende og tidskrævende proces. Det udføres for at bestemme typen eller varianten af ​​viruset, der cirkulerer blandt befolkningen (f.eks. for at identificere en serovariant af influenzavirussen, en vild- eller vaccinestamme af poliovirusset osv.); i tilfælde, hvor det er nødvendigt at gennemføre akutte epidemiologiske foranstaltninger; når nye typer eller varianter af vira dukker op; om nødvendigt bekræfte den foreløbige diagnose; til indikation af virus i miljøobjekter. Ved isolering af vira tages der hensyn til muligheden for deres persistens i den menneskelige krop samt forekomsten af ​​en blandet infektion forårsaget af to eller flere vira. En genetisk homogen population af viruset opnået fra en virion kaldes en viral klon, og processen med at opnå den kaldes kloning.

For at isolere vira anvendes infektion af modtagelige forsøgsdyr og kyllingeembryoner, men oftest anvendes vævskultur. Tilstedeværelsen af ​​en virus bestemmes sædvanligvis af specifik celledegeneration (cytopatisk effekt), dannelsen af ​​symplaster og syncytier, påvisning af intracellulære indeslutninger, såvel som et specifikt antigen påvist ved hjælp af immunfluorescens, hæmadsorption, hæmagglutination (til hæmagglutinerende vira) osv. . Disse tegn kan kun opdages efter 2-3 passager af virussen.

For at isolere en række vira, såsom influenzavirus, anvendes kyllingeembryoner, og til at isolere nogle Coxsackie-vira og en række arbovirus anvendes nyfødte mus. Identifikation af isolerede vira udføres ved hjælp af serologiske reaktioner og andre metoder.

Når man arbejder med vira, bestemmes deres titer. Titrering af vira udføres sædvanligvis i vævskultur, hvorved den højeste fortynding af den virusholdige væske bestemmes, ved hvilken vævsdegenerering sker, indeslutninger og virusspecifikke antigener dannes. Plaquemetoden kan bruges til at titrere en række vira. Plaques eller negative kolonier af vira er foci af celler ødelagt af virussen i en enkeltlags vævskultur under en agarcoating. Kolonitælling giver mulighed for en kvantitativ analyse af viruss infektiøse aktivitet på grundlag af, at én infektiøs viruspartikel danner én plak. Plaques påvises ved at farve kulturen med intravitale farvestoffer, sædvanligvis neutral rød; Plaques adsorberer ikke farvestoffet og er derfor synlige som lyse pletter på baggrund af farvede levende celler. Virustiteren er udtrykt som antallet af plakdannende enheder pr ml.

Oprensning og koncentration af vira udføres sædvanligvis ved differentiel ultracentrifugering efterfulgt af koncentrations- eller tæthedsgradientcentrifugering. For at rense vira anvendes immunologiske metoder, ionbytterkromatografi, immunosorbenter osv.

Laboratoriediagnose af virale infektioner omfatter påvisning af patogenet eller dets komponenter i klinisk materiale; isolering af virussen fra dette materiale; serodiagnose. Valget af laboratoriediagnostisk metode i hvert enkelt tilfælde afhænger af sygdommens art, sygdomsperioden og laboratoriets muligheder. Moderne diagnostik af virale infektioner er baseret på ekspresmetoder, der gør det muligt at få svar flere timer efter indtagelse af klinisk materiale i de tidlige stadier efter sygdommen. Disse omfatter elektron- og immunelektronmikroskopi samt immunfluorescens, metoden til molekylær hybridisering , påvisning af antistoffer af IgM-klassen mv.

Elektronmikroskopi af negativt farvede vira gør det muligt at differentiere vira og bestemme deres koncentration. Brugen af ​​elektronmikroskopi til diagnosticering af virusinfektioner er begrænset til de tilfælde, hvor koncentrationen af ​​virale partikler i klinisk materiale er ret høj (10 5 i 1 ml og højere). Ulempen ved metoden er den manglende evne til at skelne vira, der tilhører den samme taksonomiske gruppe. Denne mangel overvindes ved brug af immunelektronmikroskopi. Metoden er baseret på dannelsen af ​​immunkomplekser ved at tilsætte specifikt serum til virale partikler, samtidig med at viruspartiklerne koncentreres, så de kan identificeres. Metoden bruges også til at påvise antistoffer. Til udtrykkelige diagnostiske formål udføres elektronmikroskopisk undersøgelse af vævsekstrakter, fæces, væske fra vesikler og sekreter fra nasopharynx. Elektronmikroskopi er meget udbredt til at studere virussens morfogenese; dens muligheder udvides med brug af mærkede antistoffer.

Den molekylære hybridiseringsmetode, der er baseret på påvisning af virusspecifikke nukleinsyrer, gør det muligt at påvise enkelte kopier af gener og har ingen sidestykke i følsomhed. Reaktionen er baseret på hybridisering af komplementære DNA- eller RNA-strenge (prober) og dannelsen af ​​dobbeltstrengede strukturer. Den billigste probe er klonet rekombinant DNA. Sonden er mærket med radioaktive prækursorer (normalt radioaktivt fosfor). Brugen af ​​kolorimetriske reaktioner er lovende. Der er flere muligheder for molekylær hybridisering: plethybridisering, blot-hybridisering, sandwich-hybridisering, in situ-hybridisering osv.

Antistoffer af IgM-klassen optræder tidligere end klasse G-antistoffer (på 3.-5. sygdomsdagen) og forsvinder efter et par uger, så deres påvisning indikerer en nylig infektion. Antistoffer af lgM-klassen påvises ved immunfluorescens eller ved enzymimmunoassay ved anvendelse af anti-μ-antisera (sera mod de tunge kæder af lgM).

Serologiske metoder i virologi er baseret på klassiske immunologiske reaktioner (se Immunologiske forskningsmetoder) : komplementfikseringsreaktioner, hæmagglutinationshæmning, biologisk neutralisering, immundiffusion, indirekte hæmagglutination, radial hæmolyse, immunfluorescens, enzymimmunoassay, radioimmunoassay. Der er udviklet mikrometoder til mange reaktioner, og deres teknikker bliver konstant forbedret. Disse metoder bruges til at identificere vira ved hjælp af et sæt kendte sera og til serodiagnose for at bestemme stigningen i antistoffer i det andet serum sammenlignet med det første (det første serum tages de første dage efter sygdommen, det andet - efter 2- 3 uger). En diagnostisk værdi er ikke mindre end en firedobling af antistoffer i det andet serum. Hvis påvisningen af ​​antistoffer af IgM-klassen indikerer en nylig infektion, så varer antistoffer af IgC-klassen i flere år, og nogle gange livet ud.

For at identificere individuelle antigener af vira og antistoffer mod dem i komplekse blandinger uden foreløbig oprensning af proteiner, anvendes immunblotting. Metoden kombinerer proteinfraktionering ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese med efterfølgende immunindikation af proteiner ved hjælp af enzymimmunoassaymetoden. Proteinadskillelse reducerer kravene til antigenets kemiske renhed og gør det muligt at identificere individuelle antigen-antistof-par. Denne opgave er f.eks. relevant ved serodiagnose af HIV-infektion, hvor falsk-positive enzym-bundne immunosorbent assay-reaktioner er forårsaget af tilstedeværelsen af ​​antistoffer mod cellulære antigener, som er til stede som følge af utilstrækkelig oprensning af virale proteiner. Identifikation af antistoffer i patientsera mod interne og eksterne virale antigener gør det muligt at bestemme sygdomsstadiet, og ved analyse af populationer, variabiliteten af ​​virale proteiner. Immunblotting for HIV-infektion bruges som en bekræftende test til at identificere individuelle virale antigener og antistoffer mod dem. Ved analyse af populationer bruges metoden til at bestemme variabiliteten af ​​virale proteiner. Metodens store værdi ligger i muligheden for at analysere antigener syntetiseret ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi, fastslå deres størrelser og tilstedeværelsen af ​​antigene determinanter.

Bibliografi: Bukrinskaya A.G. Virology, M., 1986; Virology, Methods, red. B. Meikhi, oversættelse. fra English, M., 1988; Håndbog i mikrobiologiske og virologiske forskningsmetoder, red. M.O. Birgera, M., 1982.

• - metoder til neutralisering af affald, der indeholder organiske stoffer, baseret på deres opvarmning som følge af den vitale aktivitet af termofile aerobe mikroorganismer...

  Medicinsk encyklopædi

• - histokemiske metoder påvisning af enzymer baseret på reaktionen ved dannelse af calcium- eller magnesiumphosphatudfældninger på lokaliseringssteder enzymatisk aktivitet ved inkubering af vævssnit med organisk...

  Medicinsk encyklopædi

• - metoder til identifikation af histiocytter i præparater nervevæv Og forskellige organer ved at bruge ammoniaksølv eller pyridin-sodasølvopløsninger...

  Medicinsk encyklopædi

• - metoder til vurdering af antagelser om arten af ​​arv, baseret på en sammenligning af de observerede og forventede forhold mellem syge og raske i familier belastet med arvelige sygdomme, under hensyntagen til metoden...

  Medicinsk encyklopædi

• - bruges til at studere strukturen og funktionen af ​​celler og væv hos mennesker, dyr og planteorganismer under normale, patologiske og eksperimentelle forhold...

  Medicinsk encyklopædi

• - metoder til identifikation af kemiske stoffer i histologiske snit. En integreret del af G. m. og. er cytokemiske metoder, der afslører kemiske stoffer i cellerne af forberedte udstrygninger og print...

  Medicinsk encyklopædi

• - Metoder til kvantitativ og kvalitativ bestemmelse af glukose i blod og urin, baseret på oxidation af glukose med atmosfærisk oxygen i nærvær af enzymet glucoseoxidase...

  Medicinsk encyklopædi

• - diagnostiske metoder undersøgelser baseret på den specifikke interaktion mellem antigener og antistoffer...

  Medicinsk encyklopædi

• - metoder til identifikation af fibrøse strukturer bindevæv og neuroglia i histologiske præparater, baseret på deres flerfarvede farve...

  Medicinsk encyklopædi

• - 1) metode til farvning af histologiske præparater af dermis ved hjælp af Mayers hemalone, en opløsning af kaliumalun og rhodamin; cellekerner farves Blå farve, eleidin - i rød...

  Medicinsk encyklopædi

• - i medicin - et sæt metoder til kvantitativ undersøgelse og analyse af tilstanden og adfærden af ​​genstande og systemer relateret til medicin og sundhedspleje...

  Medicinsk encyklopædi

• - måder at studere forskellige objekter ved hjælp af et mikroskop...

  Medicinsk encyklopædi

• - er baseret på brugen af ​​optikkens love vedrørende arten, udbredelsen og interaktionen med stof af elektromagnetisk stråling i det optiske område...

  Medicinsk encyklopædi

• - metoder til at studere og vurdere kvaliteten af ​​miljøobjekter ved hjælp af sanserne...

  Medicinsk encyklopædi

• - den generelle betegnelse for en række metoder til imprægnering af histologiske præparater med sølv for at identificere glia og andre argyrofile fibre...

  Medicinsk encyklopædi

• - udpeget af efterforskeren og retten til at løse særlige spørgsmål, der opstår under efterforskningen af ​​forbrydelser og behandlingen af ​​civile sager. De udføres også efter forslag fra retslæger...

  Medicinsk encyklopædi

"Virologiske forskningsmetoder" i bøger

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Det første album fra Los Angeles-gruppen Rage Against The Machine kombinerede hiphop og hård rock, og smagte dem med aktuelle politiske manifester og, behageligt, en betragtelig dosis tæt funk-rytme. I sangen "Killing in the Name", inkluderet i den første single,

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970)

James Brown Get Up (I Feel Like Being A) Sex Machine (1970) I slutningen af ​​1960'erne begyndte James Brown at eksperimentere. Hjerteskærende soul med The Famous Flames gav plads til klingende funk med The J.B.'s. En af de vigtigste milepæle i den kommende funk-æra var "Sex Machine", som i en ti minutters version

Raseri imod maskinen