Wirusologiczne metody badań chorób zakaźnych. Badania wirusologiczne Kopia zapasowa za pomocą Time Machine

W diagnostyce laboratoryjnej infekcje wirusowe istnieją trzy główne podejścia

1) bezpośrednie badanie materiału na obecność antygenu wirusowego lub kwasów nukleinowych;

2) izolacja i identyfikacja wirusa z materiału klinicznego;

Bezpośrednie metody diagnozowania materiału klinicznego

Metody bezpośrednie to metody, które pozwalają na wykrycie wirusa, antygenu wirusa lub wirusowego kwasu nukleinowego (NA) bezpośrednio w materiale klinicznym, czyli są najszybsze (2-24 godziny).

Mikroskopia elektronowa (EM). Za pomocą tej metody można wykryć prawdziwego wirusa.

immunologiczna mikroskopia elektronowa (IEM), która wykorzystuje specyficzne przeciwciała przeciwko wirusom. W wyniku interakcji przeciwciał z wirusami powstają kompleksy, które po zabarwieniu negatywnym są łatwiej wykrywalne.

Reakcja immunofluorescencyjna (RIF). Metoda opiera się na wykorzystaniu przeciwciał związanych z barwnikiem

Metoda RIF jest szeroko stosowana do szybkiego rozszyfrowania etiologii ostrych infekcji wirusowych dróg oddechowych na podstawie analizy rozmazów z błony śluzowej górnych dróg oddechowych.

Test immunoenzymatyczny (ELISA). Metody ELISA służące do oznaczania antygenów wirusowych są w zasadzie podobne do RIF, ale opierają się na znakowaniu przeciwciał enzymami, a nie barwnikami.

Test radioimmunologiczny (RIA). Metoda opiera się na znakowaniu przeciwciał radioizotopami, co zapewnia wysoką czułość w oznaczaniu antygenu wirusa.

Metody molekularne. Początkowo wysoce specyficzną metodę hybrydyzacji NA uważano za klasyczną metodę wykrywania genomu wirusa, obecnie coraz częściej stosuje się izolację genomów wirusa za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Hybrydyzacja molekularna kwasów nukleinowych. Metoda polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA z utworzeniem struktur dwuniciowych i ich detekcji.

PCR opiera się na zasadzie naturalnej replikacji DNA. Istota metody polega na wielokrotnym powtarzaniu cykli syntezy (amplifikacji) specyficznej dla wirusa sekwencji DNA przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA Taq i dwóch specyficznych starterów, tzw. starterów.

Metody cytologiczne mają obecnie ograniczoną wartość diagnostyczną, ale nadal powinny być stosowane w wielu zakażeniach. Badane są materiały z sekcji zwłok, biopsje, rozmazy, które po odpowiedniej obróbce są barwione i analizowane pod mikroskopem.

Aby izolacja wirusów przebiegła pomyślnie, należy jak najszybciej pobrać materiał kliniczny zgodnie z patogenezą podejrzewanej choroby.

Z reguły weź:

- Na infekcje dróg oddechowych- płukanie nosowo-gardłowe;

- z infekcjami enterowirusowymi - uderzenia gorąca i kał (reo-, enterowirusy);

- ze zmianami skórnymi i błonami śluzowymi - zeskrobiny, zawartość pęcherzyków (opryszczka, ospa wietrzna);

- przy infekcjach wykwitowych - wymazy (odra, różyczka);

- w infekcjach arbowirusami - krew, płyn mózgowo-rdzeniowy.

Do izolacji wirusów wykorzystuje się hodowle komórkowe, zwierzęta laboratoryjne i zarodki kurze. Proces jest długotrwały i wymaga czasami kilku pasaży, zanim wirus zostanie wykryty i zidentyfikowany jedną lub kilkoma metodami – w teście neutralizacji (RN), RIF, ELISA czy PCR.

Serodiagnostyka

Diagnostyka serologiczna oparta na reakcji antygen-przeciwciało pozwala określić oba te czynniki i odgrywa rolę w ustaleniu etiologii infekcji wirusowej nawet przy ujemnych wynikach izolacji wirusa.

RSK jest jednym z tradycyjnych testów serologicznych i służy do diagnozowania wielu infekcji wirusowych. W reakcji biorą udział dwa układy: przeciwciała surowicy pacjenta + standardowy wirus i erytrocyty owiec + przeciwciała przeciwko nim oraz miareczkowany dopełniacz. Jeśli przeciwciała i wirus pasują, kompleks ten wiąże dopełniacz i nie następuje liza erytrocytów owiec (reakcja pozytywna). Przy ujemnym wyniku RSC dopełniacz przyczynia się do lizy erytrocytów. Wadą tej metody jest niewystarczająco wysoka czułość i trudność standaryzacji odczynników.Metoda IF, podobnie jak ELISA, służy do oznaczania przeciwciał w surowicy.

Metody badań wirusologicznych- metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, sposób ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusów, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn zachodzących procesów wewnątrzkomórkowych ważna rola w infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się także na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemoliza, aktywność enzymatyczna), cechach oddziaływania wirusa z komórką gospodarza (charakter cytopatycznego efekt, tworzenie wtrętów wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości hodowli pierwotnych można hodować wtórnie i określa się je mianem hodowli wtórnych. Wraz z dalszym pasażem komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, większość który zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tzw komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Fragmenty poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowle komórkowe wirusy można wykryć poprzez zmianę morfologii komórki, działanie cytopatyczne, które może być specyficzne, pojawienie się wtrętów, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; oznaczanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów jest procesem pracochłonnym i długotrwałym. Przeprowadza się je w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa a, szczepu dzikiego lub szczepionkowego wirusa a itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wskazywania wirusów w obiektach środowisko. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. O obecności wirusa zazwyczaj decyduje specyficzna degeneracja komórek (efekt cytopatyczny),

Do izolacji szeregu wirusów, na przykład wirusów a, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów - nowonarodzonych myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, tworzą się wtręty i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Pozwala na to liczenie kolonii analiza ilościowa zakaźną aktywność wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki identyfikuje się poprzez barwienie kultury barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są postrzegane jako jasne plamy na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów przeprowadza się zwykle poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Nowoczesna diagnostyka zakażenia wirusowe opiera się na metodach ekspresowych, które pozwalają uzyskać odpowiedź już w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach po chorobie, do których zalicza się mikroskopia elektronowa i immunologiczna,

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie pozwala na różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Wadę tę eliminuje się stosując immunologiczną mikroskopię elektronową. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy równoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co umożliwia ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu ekspresowej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Do badania morfogenezy wirusa szeroko wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której możliwości poszerza się dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sond) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy lgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, zatem ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencji lub za pomocą test immunologiczny enzymatyczny stosując surowice anty-m (surowice przeciwko łańcuchom ciężkim IgM).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz. Metody badań immunologicznych ): reakcje wiązania dopełniacza

Do identyfikacji poszczególnych antygenów wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wcześniejszego oczyszczania białek stosuje się immunoblot. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem białek metodą immunoenzymatyczną. Rozdzielenie białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. To zadanie jest istotne na przykład w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie pozytywne reakcje enzymatycznego testu immunologicznego wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w analizie populacji – zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu wykrycia poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Wirusologia, M., 1986; Wirusologia, Metody, wyd. B. Meikhi, tłum. z języka angielskiego, M., 1988; Podręcznik metod badań mikrobiologicznych i wirusologicznych, wyd. MO Birger, M., 1982.

Wirusologiczne metody badań są szeroko stosowane w medycynie do diagnostyki wielu chorób zakaźnych i niektórych choroby onkologiczne mający charakter wirusowy.

Metody badań wirusologicznych wykorzystywane są również do identyfikacji, badania ich biologii i zdolności oddziaływania na komórki zwierzęce i ludzkie, co dodatkowo pomaga zrozumieć patogenezę choroby wirusowe i wybrać odpowiednie metody leczenia. Oprócz ustalenia etiologii choroby i monitorowania skuteczności terapii, ogromne znaczenie w ustalaniu i wdrażaniu działań przeciwepidemicznych mają wirusologiczne metody badawcze.

Metody badań bezpośrednich w wirusologii

Bezpośrednie metody badań wirusologicznych pozwalają na wykrycie wirusa, wirusowego kwasu nukleinowego lub antygenu wirusa bezpośrednio w materiale klinicznym i dzięki temu są najszybsze (metody ekspresowe – do 24 godzin). Metody te są mniej informatywne i wymagają potwierdzenia laboratoryjnego. metody pośrednie diagnoza w związku z częstym otrzymywaniem wyników fałszywie ujemnych lub wyniki fałszywie dodatnie. Do metod bezpośrednich zalicza się następujące metody badawcze:

• mikroskopia elektronowa z barwieniem wirusów metodą ujemną (pozwala określić obecność wirusa i jego stężenie w materiale pod warunkiem, że 1 ml zawiera co najmniej 105 cząstek wirusa);
• immunologiczna mikroskopia elektronowa, opierająca się na oddziaływaniu specyficznych przeciwciał z wirusami w celu utworzenia kompleksów, które są łatwiejsze do wykrycia przy ujemnym kontraście niż same wirusy;
• enzymatyczny test immunoenzymatyczny (ELISA) wykorzystujący znakowane enzymatycznie przeciwciała, które wiążą się z antygenami, tworząc kompleksy wykrywane po dodaniu substratu dla użytego enzymu;
• reakcja immunofluorescencyjna (RIF) – bezpośrednia lub pośrednia – polegająca na zastosowaniu przeciwciał związanych z barwnikiem fluorescencyjnym;
• test radioimmunologiczny (RIA) opiera się na zastosowaniu przeciwciał znakowanych radioizotopem i liczników gamma;
• metody cytologiczne opierają się na badaniu mikroskopowym wybarwionych rozmazów, biopsji, materiałów z sekcji zwłok;
• metody molekularne - hybrydyzacja molekularna kwasów nukleinowych i reakcja łańcuchowa polimerazy (pierwsza opiera się na detekcji komplementarnych nici kwasów nukleinowych za pomocą znacznika, druga opiera się na zasadzie replikacji sekwencji DNA specyficznej dla wirusa w trzech etapach) .

Istnieją trzy możliwości hybrydyzacji molekularnej kwasów nukleinowych – hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot (stosowana w diagnostyce Zakażenie wirusem HIV) i hybrydyzację in situ (bezpośrednio w zakażonych komórkach). PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) jest obecnie coraz częściej stosowana w monitorowaniu i diagnostyce infekcji wirusowych ze względu na wysoką czułość i swoistość tej metody.

Pośrednie metody badań wirusologicznych

Metody te opierają się na izolacji i identyfikacji wirusa. Są to metody bardziej czasochłonne i czasochłonne, jednak dokładniejsze. Materiałem do takich badań może być zawartość pęcherzyków, zeskrobin (z ospa wietrzna, zmiana opryszczkowa skóra i błony śluzowe), płukanie nosogardła (w infekcjach dróg oddechowych), krew i płyn mózgowo-rdzeniowy (w infekcjach arbowirusami), kał (w infekcjach enterowirusowych), wymazy (w infekcjach odry, różyczki itp.). Ze względu na to, że wirusy mogą namnażać się jedynie w żywych komórkach, hodowlę wirusa prowadzi się w hodowli tkankowej, zarodku kurczaka lub w organizmie zwierzęcia (chomik, mysz biała, pies, kot, niektóre gatunki małp). Identyfikację wirusa przeprowadza się poprzez działanie cytopatyczne, reakcję hemadsorpcji, próbę barwną, na podstawie wyników reakcji hamowania hemaglutynacji, na podstawie zmian lub ich braku w zarodkach kurzych lub hodowlach tkankowych, na podstawie przeżycia wirusa wrażliwe zwierzęta.

Serologiczne metody diagnostyki stosowane w wirusologii

Serologiczne oznacza wirusologiczne metody badawcze oparte na reakcji antygen-przeciwciało. W tym przypadku najczęściej stosuje się sparowane surowice krwi, które pobiera się w odstępach kilkutygodniowych. Przy wzroście miana przeciwciał 4 lub więcej razy reakcję uważa się za pozytywną. Aby określić specyficzność typu wirusów, stosuje się reakcję neutralizacji wirusa, w celu określenia specyficzności grupowej stosuje się reakcję wiązania dopełniacza. Szeroko stosowane są również reakcje hemaglutynacji biernej, hamowania hemaglutynacji, hemaglutynacji odwrotnej biernej, RIF i różne warianty testów immunologicznych enzymatycznych.

Stosunkowo niedawno, w toku badań inżynierii genetycznej, opracowano metodę otrzymywania przeciwciał monoklonalnych. Wąską specyficzność monoklonów przezwycięża się poprzez zastosowanie kilku przeciwciał monoklonalnych przeciwko różnym determinantom wirusowym. Zwiększyło to czułość i swoistość metod badań wirusologicznych z oznaczaniem antygenów wirusowych. Obecnie stworzono wiele różnych systemów testowych diagnostyka immunologiczna infekcje wirusowe.

metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, sposób ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusów, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych odgrywających ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się także na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemoliza, aktywność enzymatyczna), cechach interakcji wirusa z komórką gospodarza (tj. charakter efektu cytopatycznego, tworzenie wtrąceń wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości hodowli pierwotnych można hodować wtórnie i określa się je mianem hodowli wtórnych. Podczas dalszego pasażowania komórek tworzy się populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Fragmenty poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć poprzez zmianę morfologii komórek, działanie cytopatyczne, które może być specyficzne, pojawienie się wtrętów, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; oznaczanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów jest procesem pracochłonnym i długotrwałym. Przeprowadza się je w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa grypy, szczepu dzikiego lub szczepionkowego wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wykrywania wirusów w obiektach środowiskowych. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa zwykle określa się na podstawie specyficznej degeneracji komórek (efekt cytopatyczny), tworzenia symplastów i syncytii, wykrywania wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także specyficznego antygenu wykrywanego za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w wirusach hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do izolacji szeregu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów wykorzystuje się nowonarodzone myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, tworzą się wtręty i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę aktywności zakaźnej wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki identyfikuje się poprzez barwienie kultury barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów przeprowadza się zwykle poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Współczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, pozwalających uzyskać odpowiedź już w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach po chorobie, do których należą mikroskopia elektronowa i immunoelektronowa, immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy lgM itp.

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie pozwala na różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Wadę tę eliminuje się stosując immunologiczną mikroskopię elektronową. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy równoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co umożliwia ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu ekspresowej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Do badania morfogenezy wirusa szeroko wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której możliwości poszerza się dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sond) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy lgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, zatem ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencyjną lub immunoenzymatyczną z użyciem surowic odpornościowych anty-μ (surowic anty-IgM przeciwko łańcuchom ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz Immunologiczne metody badań) : reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza promieniowa, immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy pomocy zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu do pierwszej (pierwsza surowica pobierana jest w pierwszych dniach po chorobie, druga – po 2-3 tygodnie). Wartość diagnostyczna to nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy lgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy lgC utrzymują się przez kilka lat, a czasami przez całe życie.

Do identyfikacji poszczególnych antygenów wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wcześniejszego oczyszczania białek stosuje się immunoblot. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem białek metodą immunoenzymatyczną. Rozdzielenie białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to jest istotne np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje w testach enzymatycznych wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w analizie populacji – zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu wykrycia poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

20) Główny składnik strukturalny wirionów (kompletne cząstki wirusa) jest nukleokapsydem, tj. otoczka białkowa (kapsyd), która otacza genom wirusa (DNA lub RNA). Nukleokapsyd większości rodzin wirusów jest otoczony otoczką lipoproteinową. W niektórych wirusach (orto-, paramykso-, rabdo-, filo- i retrowirusach) pomiędzy otoczką a nukleokapsydem znajduje się nieglikozylowane białko macierzy, które nadaje wirionom dodatkową sztywność. Wirusy większości rodzin mają otoczkę, która odgrywa ważną rolę w zakaźności. Wiriony nabywają zewnętrzną warstwę otoczki, gdy nukleokapsyd przenika przez błonę komórkową poprzez pączkowanie. Białka otoczki są kodowane przez wirusa, a lipidy są pożyczane z błony komórkowej. Glikoproteiny zwykle w postaci dimerów i trimerów tworzą peplomery (występy) na powierzchni wirionów (orto-, paramyksowirusy, rabdo-, filo-, korona-, bunya-, arena-, retrowirusy). Glikozylowane białka fuzyjne są związane z peplomerami i odgrywają kluczową rolę we wnikaniu wirusa do komórki. Kapsydy i otoczki wirionów powstają z wielu kopii jednego lub większej liczby typów podjednostek białkowych w wyniku procesu samoorganizacji. Oddziaływanie w układzie białko-białko, na skutek słabych wiązań chemicznych, prowadzi do unifikacji symetrycznych kapsydów. Różnice u wirusów w kształcie i wielkości wirionów zależą od kształtu, wielkości i liczby podjednostek białek strukturalnych oraz charakteru interakcji między nimi. Kapsyd składa się z wielu podjednostek (kapsomerów) wykazujących ekspresję morfologiczną, złożonych z polipeptydów wirusowych w ściśle określony sposób, zgodnie ze stosunkowo prostymi zasadami geometrycznymi. Podjednostki białek, łącząc się ze sobą, tworzą kapsydy o dwóch rodzajach symetrii: izometrycznej i helikalnej. Struktura nukleokapsydu wirusów otoczkowych jest podobna do struktury nukleokapsydu wirusów bezotoczkowych. Na powierzchni otoczki wirusów wyróżnia się morfologicznie wyrażone struktury glikoproteinowe - peplomery. Skład błony superkapsydu obejmuje lipidy (do 20-35%) i węglowodany (do 7-8%), które są pochodzenia komórkowego. Składa się z podwójnej warstwy lipidów komórkowych i białek specyficznych dla wirusa, znajdujących się na zewnątrz i wewnątrz biowarstwy lipidowej. Zewnętrzna warstwa powłoki superkapsydu jest reprezentowana przez peplomery (występy) jednego lub więcej typów, składające się z jednej lub więcej cząsteczek glikoprotein. Nukleokapsyd wirusów otoczkowych nazywany jest często rdzeniem, a środkowa część wirionów zawierająca kwas nukleinowy nazywana jest nukleoidem. Kapsomery (peplomery) składają się z jednostek strukturalnych zbudowanych z jednego lub kilku homologicznych lub heterologicznych łańcuchów polipeptydowych (podjednostek białek). klasyfikacja wirusów Kapsydy izometryczne nie są kulami, ale regularnymi wielościanami (dwuścianami). Ich wymiary liniowe są identyczne wzdłuż osi symetrii. Według Kaspara i Kluga (1962) kapsomery w kapsydach ułożone są według symetrii ikozaedrycznej. Takie kapsydy składają się z identycznych podjednostek tworzących dwudziestościan. Mają 12 wierzchołków (narożników), 30 ścian i 20 powierzchni w postaci trójkątów równoramiennych. Zgodnie z tą zasadą kapsyd wirusa polio i wirusa pryszczycy składa się z 60 białkowych jednostek strukturalnych, z których każda składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych. Dwudziestościan optymalnie rozwiązuje problem upakowania powtarzających się podjednostek w ściśle zwartą strukturę, gdy minimalna głośność. Tylko niektóre konfiguracje podjednostek strukturalnych mogą tworzyć powierzchnie, wierzchołki i ściany dwudziestościanu wirusowego. Na przykład podjednostki strukturalne adenowirusa tworzą sześciokątne kapsomery (heksony) na powierzchniach i ścianach oraz pięciokątne kapsomery (peptony) na szczytach. W niektórych wirusach oba typy kapsomerów są utworzone przez te same polipeptydy, w innych przez różne polipeptydy. Ponieważ podjednostki strukturalne różnych wirusów różnią się od siebie, niektóre wirusy wydają się być bardziej sześciokątne, inne bardziej kuliste. Wszystkie znane wirusy kręgowców zawierające DNA, z wyjątkiem wirusów ospy, a także wiele wirusów zawierających RNA (7 rodzin) mają typ symetrii kapsydu sześciennego. Reowirusy, w przeciwieństwie do innych wirusów kręgowców, mają podwójny kapsyd (zewnętrzny i wewnętrzny), każdy składający się z jednostek morfologicznych. Wirusy o symetrii helikalnej mają postać cylindrycznej struktury nitkowatej, ich genomowy RNA ma postać spirali i znajduje się wewnątrz kapsydu. Wszystkie wirusy zwierzęce o symetrii helikalnej są otoczone otoczką lipoproteinową. Spiralne nukleokapsydy charakteryzują się długością, średnicą, podziałką helisy i liczbą kapsomerów na obrót helisy. Zatem w wirusie Sendai (paramyksowirusie) nukleokapsyd jest helisą o długości około 1 μm, średnicy 20 nm i skoku helisy 5 nm. Kapsyd składa się z około 2400 jednostek strukturalnych, z których każda jest białkiem waga molekularna 60 kD. Na jeden obrót helisy przypada 11-13 podjednostek. W wirusach o helikalnej symetrii nukleokapsydu złożenie cząsteczek białka w helisę zapewnia maksymalną interakcję między podjednostkami kwasu nukleinowego i białka. W wirusach ikozaedrycznych kwas nukleinowy jest zwinięty wewnątrz wirionów i oddziałuje z jednym lub większą liczbą polipeptydów znajdujących się wewnątrz kapsydu.

Antyreceptory (receptory) Wirusowe- białka powierzchniowego wirionu, na przykład hemaglutynina, które wiążą się w sposób komplementarny z odpowiednim receptorem podatnej komórki.

21) Metody immunologiczne w badaniach wirusologicznych.

Testy serologiczne różnią się zdolnością do wykrywania poszczególnych klas przeciwciał. Na przykład test aglutynacji dobrze wykrywa przeciwciała IgM, ale jest mniej czuły w wykrywaniu przeciwciał IgG. Testy wiązania dopełniacza i hemolizy, które wymagają dopełniacza, nie wykrywają przeciwciał nie przyłączających dopełniacza, takich jak przeciwciała IgA i przeciwciała IgE. W reakcji neutralizacji wirusa biorą udział wyłącznie przeciwciała skierowane przeciwko determinantom antygenowym powierzchni wirionu związanym z patogenicznością. Czułość I. m. i. przewyższa wszystkie inne metody badania antygenów i przeciwciał, w szczególności test radioimmunologiczny i test immunoenzymatyczny pozwalają na wykrycie obecności białka w ilościach mierzonych w nanogramach, a nawet w pikogramach. Z pomocą I. m. i. określić grupę i sprawdzić bezpieczeństwo krwi (zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B i wirusem HIV). Przy przeszczepianiu tkanek i ciał I. m. umożliwiają określenie zgodności tkanek i testowanie metod tłumienia niezgodności. W medycynie sądowej reakcję Castellaniego stosuje się do określenia specyficzności gatunkowej białka, a reakcję aglutynacji do określenia grupy krwi.

Metody immunologiczne znajdują szerokie zastosowanie w diagnostyce laboratoryjnej chorób zakaźnych. Etiologię choroby ustala się także na podstawie wzrostu poziomu przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi rekonwalescenta w porównaniu z próbką pobraną w pierwszych dniach choroby. Na podstawie I. m. i. badać odporność populacji na masowe infekcje, takie jak grypa, a także oceniać skuteczność szczepień zapobiegawczych.

W zależności od ich mechanizmu i rachunku wyników I. m. i. można podzielić na reakcje oparte na zjawisku aglutynacji; reakcje oparte na zjawisku opadów atmosferycznych; reakcje z udziałem dopełniacza; Reakcja neutralizacji; reakcje chemiczne i fizyczne.

Reakcje oparte na zjawisku aglutynacji. Aglutynacja to sklejanie się komórek lub pojedynczych cząstek – nośników antygenu za pomocą surowicy odpornościowej z tym antygenem.

Badanie aglutynacji bakterii z użyciem odpowiedniej surowicy antybakteryjnej jest jednym z najprostszych badań serologicznych. Do różnych rozcieńczeń badanej surowicy krwi dodaje się zawiesinę bakterii i po określonym czasie kontaktu w temperaturze t°37° rejestruje się, przy którym następuje największe rozcieńczenie aglutynacji surowicy krwi. Reakcję aglutynacji bakterii wykorzystuje się w diagnostyce wielu chorób zakaźnych: brucelozy, tularemii, duru brzusznego i duru paradurowego, czerwonki prątkowej i tyfusu.

Reakcja hemaglutynacji biernej lub pośredniej (RPGA, RNGA). Wykorzystuje erytrocyty lub obojętne materiały syntetyczne (np. cząsteczki lateksu), na powierzchni których adsorbowane są antygeny (bakteryjne, wirusowe, tkankowe) lub przeciwciała. Do ich aglutynacji dochodzi po dodaniu odpowiednich surowic lub antygenów.

Test hemaglutynacji biernej służy do diagnostyki chorób wywołanych przez bakterie ( dur brzuszny i paratyfus, czerwonka, bruceloza, dżuma, cholera itp.), pierwotniaki (malaria) i wirusy (grypa, zakażenia adenowirusami, Wirusowe zapalenie wątroby B, odra, kleszczowe zapalenie mózgu, krymski gorączka krwotoczna itp.), a także w celu określenia niektórych hormonów, identyfikacji nadwrażliwość chory leki oraz hormony, takie jak penicylina i insulina.

Test hamowania hemaglutynacji (HITA) opiera się na zjawisku zapobiegania (hamowania) surowicy odpornościowej hemaglutynacji erytrocytów przez wirusy i służy do wykrywania i oznaczania przeciwciał przeciwwirusowych. Służy jako główna metoda serodiagnostyki grypy, odry, różyczki, świnka, kleszczowe zapalenie mózgu i inne infekcje wirusowe, których czynniki sprawcze mają właściwości hemaglutynujące. na przykład w celu serodiagnostyki kleszczowego zapalenia mózgu do dołków panelu wlewa się dwukrotne rozcieńczenia surowicy pacjenta w alkalicznym roztworze buforu boranowego. Następnie dodaje się pewną ilość, zwykle 8 AU (jednostek aglutynacji), antygenu kleszczowego zapalenia mózgu i po 18 godzinach ekspozycji w temperaturze t°4° wprowadza się zawiesinę erytrocytów gęsich przygotowaną w kwaśnym roztworze buforu fosforanowego. Jeśli w surowicy krwi pacjenta znajdują się przeciwciała przeciwko wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu, wówczas antygen zostaje zneutralizowany i nie następuje aglutynacja erytrocytów.

Reakcje oparte na zjawisku opadów atmosferycznych. Wytrącanie następuje w wyniku interakcji przeciwciał z rozpuszczalnymi antygenami. Najprostszym przykładem reakcji wytrącania jest utworzenie w probówce nieprzezroczystego pasma wytrącania na granicy nawarstwiania się antygenu na przeciwciele. Szeroko stosowane są różne rodzaje reakcji strącania w półpłynnym agarze lub żelach agarozowych (metoda podwójnej immunodyfuzji Ouchterlona, ​​metoda immunodyfuzji radialnej, immunoelektroforeza), które mają zarówno charakter jakościowy, jak i ilościowy. W wyniku swobodnej dyfuzji w żelu antygenów i przeciwciał w strefie ich optymalnego stosunku powstają specyficzne kompleksy – pasma precypitacyjne, które wykrywa się wizualnie lub poprzez barwienie. Cechą tej metody jest to, że każda para antygen-przeciwciało tworzy indywidualne pasmo precypitacji, a reakcja nie jest uzależniona od obecności innych antygenów i przeciwciał w badanym układzie.

Reakcje z udziałem dopełniacza, który służy jako świeża surowica krwi świnka morska, opierają się na zdolności podskładnika dopełniacza Clq, a następnie innych składników dopełniacza, do przyłączania się do kompleksów immunologicznych.

Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) umożliwia miareczkowanie antygenów lub przeciwciał w zależności od stopnia wiązania dopełniacza przez kompleks antygen-przeciwciało. Reakcja ta składa się z dwóch faz: interakcji antygenu z badaną surowicą krwi (układ testowy) oraz interakcji surowicy hemolitycznej z erytrocytami barana (układ wskaźnikowy). W przypadku reakcji pozytywnej w badanym układzie następuje wiązanie dopełniacza, a następnie po dodaniu erytrocytów uwrażliwionych na przeciwciała nie obserwuje się hemolizy. Reakcję stosuje się w serodiagnostyce kiły (reakcja Wassermanna), infekcji wirusowych i bakteryjnych.

Reakcja neutralizacji opiera się na zdolności przeciwciał do neutralizowania pewnych specyficznych funkcji antygenów wielkocząsteczkowych lub rozpuszczalnych, takich jak aktywność enzymów, toksyny bakteryjne i patogeniczność wirusów. Reakcję neutralizacji toksyn można ocenić na podstawie efektu biologicznego, np. miareczkuje się surowice przeciw tężcowi i botulinowi. Mieszanka toksyny i surowicy odpornościowej podana zwierzętom nie powoduje ich śmierci. W wirusologii wykorzystuje się różne warianty reakcji neutralizacji. Po zmieszaniu wirusów z odpowiednią surowicą odpornościową i podaniu tej mieszaniny zwierzętom lub kulturom komórkowym, patogeniczność wirusów zostaje zneutralizowana, zwierzęta nie chorują, a komórki hodowli nie ulegają zniszczeniu.

Reakcje z wykorzystaniem znaczników chemicznych i fizycznych. Immunofluorescencja polega na wykorzystaniu przeciwciał znakowanych fluorochromem, a dokładniej frakcji immunoglobulin przeciwciała IgG. Przeciwciało znakowane fluorochromem tworzy z antygenem kompleks antygen-przeciwciało, który staje się dostępny do obserwacji pod mikroskopem w promieniach UV wzbudzających luminescencję fluorochromu. Bezpośrednią reakcję immunofluorescencyjną wykorzystuje się do badania antygenów komórkowych, wykrywania wirusów w zakażonych komórkach oraz wykrywania bakterii i riketsj w rozmazach.

Coraz szerzej stosowana jest metoda immunofluorescencji pośredniej. opiera się na detekcji kompleksu antygen-przeciwciało przy użyciu luminescencyjnej surowicy przeciwciał anty-lgG i służy nie tylko do wykrywania antygenów, ale także do miareczkowania przeciwciał.

Metody immunoenzymatyczne, czyli enzymatyczne, opierają się na wykorzystaniu przeciwciał skoniugowanych z enzymami, głównie peroksydazą chrzanową lub fosfatazy alkalicznej. Podobnie jak immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny służy do wykrywania antygenów w komórkach lub do miareczkowania przeciwciał na komórkach zawierających antygen.

Metoda radioimmunologiczna opiera się na wykorzystaniu radioizotopowego znacznika antygenów lub przeciwciał. Jest to najczulsza metoda oznaczania antygenów i przeciwciał, służy do oznaczania hormonów, substancje lecznicze i antybiotyki, do diagnostyki chorób bakteryjnych, wirusowych, riketsyjnych, pierwotniakowych, do badania białek krwi, antygenów tkankowych.

Immunoblotting służy do wykrywania przeciwciał przeciwko poszczególnym antygenom lub „rozpoznawania” antygenów ze znanych surowic. Metoda składa się z 3 etapów: rozdzielenia makrocząsteczek biologicznych (np. wirusa) na poszczególne białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym; przeniesienie oddzielonych białek z żelu na stały nośnik (blot) poprzez nałożenie płytki z żelem poliakryloamidowym na aktywowany papier lub nitrocelulozę (elektrobloting); wykrywanie pożądanych białek na podłożu za pomocą bezpośredniego lub pośredniego testu immunologicznego enzymatycznego. Jako metodę diagnostyczną w przypadku zakażenia wirusem HIV stosuje się immunoblot. Wartość diagnostyczna polega na wykryciu przeciwciał przeciwko jednemu z białek zewnętrznej otoczki wirusa.

22) Typy symetrii wirusów (sześcienny, helikalny, mieszany). Oddziaływanie białek i kwasów nukleinowych w pakowaniu genomów wirusów.

W zależności od oddziaływania kapsydu z kwasem nukleinowym cząstki wirusa można podzielić na kilka typów symetrii:

1). Typ symetrii sześciennej.

Kapsydy sześcienne to ikozydy posiadające około 20 trójkątnych powierzchni i 12 wierzchołków. Tworzą strukturę przypominającą formację kulistą, choć w rzeczywistości jest to wielościan. W niektórych przypadkach do wierzchołków takich ikozaedrycznych wielościanów przyczepiają się specjalne formacje lipoproteinowe zwane kolcami. Rola tych kolców prawdopodobnie sprowadza się do interakcji wirionów lub cząstek wirusa z odpowiednimi obszarami komórek gospodarza, które są na nie wrażliwe. Przy symetrii sześciennej wirusowy kwas nukleinowy jest ciasno upakowany (zwinięty w kulkę), a cząsteczki białka otaczają go, tworząc wielościan (dwuścian). Dwudziestościan to wielościan o dwudziestu trójkątnych ścianach, który ma symetrię sześcienną i kształt w przybliżeniu kulisty. Wirusy ikozaedryczne obejmują wirusa opryszczki pospolitej, reowirusy itp.

2). Typ symetrii spiralnej. Kapsydy spiralne są nieco prostsze. Te. Kapsomery tworzące kapsyd pokrywają helikalny NK, a także tworzą dość stabilną otoczkę białkową tych wirusów. A stosując mikroskopy elektronowe o wysokiej rozdzielczości i odpowiednie metody przygotowania, można zobaczyć struktury spiralne na wirusach. Dzięki helikalnej symetrii kapsydu wirusowy kwas nukleinowy tworzy spiralną (lub spiralną) figurę, pustą w środku, a podjednostki białka (kapsomery) są również ułożone wokół niej w spiralę (kapsyd rurkowy). Przykładem wirusa o spiralnej symetrii kapsydu jest wirus mozaiki tytoniowej, który ma kształt pręcika i jego długość wynosi 300 nm, a średnica 15 nm. Skład cząstki wirusa obejmuje jedną cząsteczkę RNA o wielkości około 6000 nukleotydów. Kapsyd składa się z 2000 identycznych podjednostek białkowych ułożonych w helisę.

3). Mieszany lub złożony typ symetrii. Z reguły ten typ symetrii występuje głównie wśród wirusów bakteryjnych. Klasycznym przykładem są fagi coli lub umiarkowane fagi. Są to złożone formacje, które mają głowę z wewnętrzną zawartością jąder, różnego rodzaju przydatków, proces ogonowy i urządzenie o różnym stopniu złożoności. A każdy składnik takich cząstek ma określoną funkcję, która jest realizowana w procesie interakcji wirusa z komórką. Innymi słowy, złożony typ symetrii to połączenie symetrii sześciennej, głowa jest wielościanem ikozyderowym, a formacje w kształcie pręta to procesy ogonowe. Chociaż wśród wirusów bakteryjnych istnieją również po prostu zorganizowane wiriony, które są prymitywnymi nukleokapsydami o kształcie kulistym lub sześciennym. Wirusy bakteryjne są bardziej złożone niż wirusy roślinne i zwierzęce.

24) Oddziaływanie faga z komórką. Fagi zjadliwe i umiarkowane.

Adsorpcja.

Interakcja rozpoczyna się od przyłączenia cząstek wirusa do powierzchni komórki. Proces ten staje się możliwy w obecności odpowiednich receptorów na powierzchni komórki i antyreceptorów na powierzchni cząstki wirusa.

Wirusy do transportu wykorzystują receptory komórkowe substancje niezbędne: cząsteczki składników odżywczych, hormony, czynniki wzrostu itp.

Receptory: białka, węglowodanowy składnik białek i lipidów, lipidy. Specyficzne receptory determinują dalszy los cząstki wirusa (transport, dostarczenie do obszarów cytoplazmy lub jądra). Wirus może przyłączać się do niespecyficznych receptorów, a nawet przenikać do komórki. Jednak proces ten nie powoduje infekcji.

Początkowo tworzy się pojedyncze wiązanie pomiędzy antyreceptorem i receptorem. Ta więź jest krucha i może pęknąć. Do powstania nieodwracalnej adsorpcji konieczne jest przyłączenie wielowartościowe. Stabilne wiązanie następuje dzięki swobodnemu ruchowi cząsteczek receptora w błonie. Podczas interakcji wirusa z komórką obserwuje się wzrost płynności lipidów i powstawanie pól receptorowych w obszarze oddziaływania wirusa z komórką. Receptory wielu wirusów mogą być obecne tylko w ograniczonym zestawie komórek gospodarza. To określa wrażliwość organizmu na tego wirusa. Zatem wirusowe DNA i RNA mają zdolność infekowania szerszego zakresu komórek gospodarza.

Antyreceptory można znaleźć w unikalnych organellach wirusa: struktury rozrostowe u bakteriofagów T, włókna u adenowirusów, kolce na powierzchni błon wirusowych, korona u koronawirusów.

Penetracja.

2 mechanizmy - endocytoza receptora i fuzja błon.

Endocytoza receptorowa:

Zwykły mechanizm przedostawania się składników odżywczych i substancji regulacyjnych do komórki. Występuje w wyspecjalizowanych obszarach - tam, gdzie znajdują się specjalne dołki pokryte klatryną, na dnie jamki zlokalizowane są specyficzne receptory. Dołki zapewniają szybką inwazję i tworzenie wakuoli pokrytych klatryną (od momentu adsorpcji upływa nie więcej niż 10 minut, w ciągu jednej minuty może powstać do 2000 wakuoli). Wakuole łączą się z większymi wakuolami cytoplazmatycznymi, tworząc receptorosomy (nie zawierające już klatryny), które z kolei łączą się z lizosomami.

Fuzja błon wirusowych i komórkowych:

W wirusach otoczkowych fuzja odbywa się za pośrednictwem punktowych oddziaływań białka wirusowego z lipidami błony komórkowej, co skutkuje integracją otoczki lipoproteinowej wirusa z błoną komórkową. W wirusach bezotoczkowych jedno z białek powierzchniowych oddziałuje również z lipidami. błony komórkowe a składnik wewnętrzny przechodzi przez błonę (w paramyksowirusach - białko F, ​​w ortomyksowirusach - podjednostka hemaglutynująca HA2). pH wpływa na konformację białek powierzchniowych.

Rozebrać się.

W procesie tym zanika aktywność zakaźna, często pojawia się wrażliwość na nukleazy i pojawia się oporność na przeciwciała. Końcowym produktem rozbierania są kwasy nukleinowe związane z wewnętrznym białkiem wirusa. Etap rozbierania ogranicza także możliwość infekcji (wirusy nie są w stanie rozebrać się w każdej komórce). Rozbieranie następuje w wyspecjalizowanych obszarach komórki: lizosomach, aparacie Golgiego i przestrzeni okołojądrowej.

Rozbieranie się następuje w wyniku szeregu reakcji. Na przykład u pikornawirusów rozbieranie przebiega z utworzeniem pośrednich cząstek subwirusowych o rozmiarach od 156 do 12S. W adenowirusach w cytoplazmie i porach jądrowych i ma co najmniej 3 etapy:

Tworzenie cząstek subwirusowych o większej gęstości niż wiriony;

Tworzenie rdzeni, w których brakuje 3 białek wirusowych;

Tworzenie kompleksu DNA-białko, w którym DNA jest kowalencyjnie połączone z białkiem końcowym.

Charakterystyka fagów zjadliwych i umiarkowanych.

Kiedy bakteria zostaje zakażona fagiem, dochodzi do tak zwanej infekcji litycznej, tj. infekcji zakończonej lizą komórki gospodarza, ale jest to charakterystyczne tylko dla tak zwanych fagów zjadliwych, których interakcja z komórką prowadzi do śmierci komórki i powstania potomstwa faga.

Jednocześnie ze względu na interakcję faga z komórką wyróżnia się następujące etapy: wymieszanie faga z hodowlą komórkową (krotność infekcji wynosi 1 fag na 10 komórek) i stężenie musi być na tyle wysokie, aby fagi mogą wejść w kontakt z komórkami. Nie być ponowna infekcja– po zakażeniu trwającym maksymalnie 5 minut, gdy fagi zostaną zaadsorbowane – tę mieszaninę komórek z fagami rozcieńcza się. Istnieje okres utajony, podczas którego liczba fagów nie wzrasta, następnie bardzo krótki okres wyjścia, kiedy liczba cząstek fagów gwałtownie wzrasta, kiedy komórka ulega lizie i uwalniane jest potomstwo fagów, a następnie liczba fagów pozostaje na poziomie na tym samym poziomie, ponieważ nie następuje ponowne zakażenie. Na podstawie tej krzywej można rozróżnić następujące fazy: okres wegetacyjny „wzrostu” (okres utajony), okres wyjścia oraz obliczyć wydajność fagów na 1 zakażoną komórkę. W okresie utajonym w bakteriach nie można znaleźć niczego przypominającego cząsteczki fagów i nie jest możliwe wyizolowanie z takich komórek znajdujących się w okres ukryty początek zakaźny. Tylko dojrzałe cząsteczki fagów mogą infekować bakterie. Zatem zjadliwe fagi zawsze powodują śmierć bakterii i powodują infekcję, która objawia się wytwarzaniem nowych cząstek wirusowych zdolnych do infekowania kolejnych i innych wrażliwych komórek.

W przeciwieństwie do fagów zjadliwych, infekcja fagami umiarkowanymi nie prowadzi do lizy komórek bakteryjnych, ale dochodzi do powstania szczególnego stanu współistnienia faga z komórką bakteryjną. To współistnienie wyraża się w tym, że pewien początek faga jest obecny w komórce bakteryjnej bez żadnych dla niej niekorzystnych warunków i jest zachowywany z pokolenia na pokolenie. Na pewnych etapach takiego współistnienia fag ulega aktywacji w komórce i wchodzi w stan litycznego cyklu rozwoju, powodując lizę komórki i uwolnienie potomstwa faga. Takie fagi nazywane są fagami lizogennymi lub umiarkowanymi, a stan umiarkowanej egzystencji z fagiem to lizogenia, a bakterie zawierające takiego utajonego faga nazywane są bakteriami lizogennymi. Termin bakteria lizogenna wywodzi się z faktu, że kiedyś odkryto kultury, w których samoistnie pojawił się fag i bakteriofag ten zaczęto uważać za zanieczyszczenie kultury, czyli przedostawanie się do kultury wirus bakteryjny, a takie kultury nazywane są lizogennymi, to znaczy wytwarzają lizę.

metody badania biologii wirusów i ich identyfikacji. W wirusologii szeroko stosowane są metody biologii molekularnej, za pomocą których udało się ustalić strukturę molekularną cząstek wirusa, sposób ich przenikania do komórki i cechy reprodukcji wirusów, pierwotną strukturę wirusowych kwasów nukleinowych i białka. Trwają prace nad metodami określania sekwencji elementów składowych wirusowych kwasów nukleinowych i aminokwasów białkowych. Możliwe staje się powiązanie funkcji kwasów nukleinowych i kodowanych przez nie białek z sekwencją nukleotydów oraz ustalenie przyczyn procesów wewnątrzkomórkowych odgrywających ważną rolę w patogenezie infekcji wirusowej.

Metody badań wirusologicznych opierają się także na procesach immunologicznych (oddziaływanie antygenu z przeciwciałami), właściwościach biologicznych wirusa (zdolność do hemaglutynacji, hemoliza, aktywność enzymatyczna), cechach oddziaływania wirusa z komórką gospodarza (charakter cytopatycznego efekt, tworzenie wtrętów wewnątrzkomórkowych itp.).

W diagnostyce infekcji wirusowych, w hodowli, izolacji i identyfikacji wirusów, a także w przygotowaniu preparatów szczepionkowych, szeroko stosuje się metodę hodowli tkankowej i komórkowej. Stosuje się pierwotne, wtórne, stabilne, ciągłe i diploidalne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne uzyskuje się poprzez zdyspergowanie tkanki za pomocą enzymów proteolitycznych (trypsyna, kolagenaza). Źródłem komórek mogą być tkanki i narządy (częściej nerki) zarodków ludzkich i zwierzęcych. Zawiesinę komórek w pożywce umieszcza się w tzw. materacykach, butelkach lub szalkach Petriego, gdzie po przyczepieniu do powierzchni naczynia komórki zaczynają się namnażać. W przypadku infekcji wirusowej zwykle stosuje się monowarstwę komórkową. Pożywkę odsącza się, wprowadza zawiesinę wirusa w określonych rozcieńczeniach, a po kontakcie z komórkami dodaje świeżą pożywkę, zwykle bez surowicy.

Komórki z większości hodowli pierwotnych można hodować wtórnie i określa się je mianem hodowli wtórnych. Wraz z dalszym pasażem komórek powstaje populacja komórek podobnych do fibroblastów, zdolna do szybkiej reprodukcji, z których większość zachowuje oryginalny zestaw chromosomów. Są to tak zwane komórki diploidalne. W seryjnej hodowli komórek uzyskuje się stabilne, ciągłe hodowle komórkowe. Podczas pasaży pojawiają się szybko dzielące się jednorodne komórki z heteroploidalnym zestawem chromosomów. Stabilne linie komórkowe mogą być jednowarstwowe i zawieszone. Kultury jednowarstwowe rosną w postaci ciągłej warstwy na powierzchni szkła, kultury zawiesinowe rosną w postaci zawiesin w różnych naczyniach za pomocą mieszadeł. Istnieje ponad 400 linii komórkowych pochodzących od 40 różnych gatunków zwierząt (w tym naczelnych, ptaków, gadów, płazów, ryb, owadów) i ludzi.

Fragmenty poszczególnych narządów i tkanek (hodowle narządów) można hodować w sztucznych pożywkach. Hodowle tego typu zachowują strukturę tkanki, co jest szczególnie ważne w przypadku izolacji i pasażu wirusów, które nie rozmnażają się w niezróżnicowanych kulturach tkankowych (na przykład koronawirusów).

W zakażonych hodowlach komórkowych wirusy można wykryć poprzez zmianę morfologii komórek, działanie cytopatyczne, które może być specyficzne, pojawienie się wtrętów, poprzez oznaczenie antygenów wirusowych w komórce i płynie hodowlanym; oznaczanie właściwości biologicznych potomstwa wirusa w płynie hodowlanym i miareczkowanie wirusów w hodowli tkankowej, zarodkach kurzych lub zwierzętach wrażliwych; poprzez wykrywanie poszczególnych wirusowych kwasów nukleinowych w komórkach metodą hybrydyzacji molekularnej lub skupisk kwasów nukleinowych metodą cytochemiczną z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Izolacja wirusów jest procesem pracochłonnym i długotrwałym. Przeprowadza się je w celu określenia rodzaju lub wariantu wirusa krążącego w populacji (na przykład w celu identyfikacji serowarianta wirusa grypy, szczepu dzikiego lub szczepionkowego wirusa polio itp.); w przypadkach, gdy konieczne jest podjęcie pilnych działań epidemiologicznych; kiedy pojawiają się nowe typy lub warianty wirusów; w razie potrzeby potwierdź wstępną diagnozę; do wykrywania wirusów w obiektach środowiskowych. Izolując wirusy, bierze się pod uwagę możliwość ich utrzymywania się w organizmie człowieka, a także wystąpienie infekcji mieszanej wywołanej przez dwa lub więcej wirusów. Genetycznie jednorodna populacja wirusa uzyskana z pojedynczego wirionu nazywana jest klonem wirusa, a proces jej uzyskiwania nazywa się klonowaniem.

Do izolacji wirusów stosuje się infekcję podatnych zwierząt laboratoryjnych, zarodków kurzych, ale najczęściej stosuje się hodowlę tkankową. Obecność wirusa zwykle określa się na podstawie specyficznej degeneracji komórek (efekt cytopatyczny), tworzenia symplastów i syncytii, wykrywania wtrętów wewnątrzkomórkowych, a także specyficznego antygenu wykrywanego za pomocą immunofluorescencji, hemadsorpcji, hemaglutynacji (w wirusach hemaglutynujących) itp. . Objawy te można wykryć dopiero po 2-3 pasażach wirusa.

Do izolacji szeregu wirusów, takich jak wirusy grypy, stosuje się zarodki kurze, do izolacji niektórych wirusów Coxsackie i szeregu arbowirusów wykorzystuje się nowonarodzone myszy. Identyfikacja izolowanych wirusów odbywa się za pomocą testów serologicznych i innych metod.

Podczas pracy z wirusami określa się ich miano. Miareczkowanie wirusów zwykle przeprowadza się w hodowli tkankowej, określając najwyższe rozcieńczenie płynu zawierającego wirusa, przy którym następuje degeneracja tkanki, tworzą się wtręty i antygeny specyficzne dla wirusa. Metodę łysinkową można zastosować do miareczkowania wielu wirusów. Płytki lub negatywne kolonie wirusów to ogniska komórek zniszczonych przez wirusy w jednowarstwowej hodowli tkankowej pod powłoką agarową. Liczenie kolonii umożliwia ilościową analizę aktywności zakaźnej wirusów na podstawie tego, że jedna zakaźna cząsteczka wirusa tworzy jedną łysinkę. Płytki identyfikuje się poprzez barwienie kultury barwnikami witalnymi, zwykle neutralną czerwienią; płytki nie adsorbują barwnika i dlatego są widoczne jako jasne plamki na tle wybarwionych żywych komórek. Miano wirusa wyraża się jako liczbę jednostek tworzących łysinki w 1 ml.

Oczyszczanie i zatężanie wirusów przeprowadza się zwykle poprzez ultrawirowanie różnicowe, a następnie wirowanie w gradiencie stężenia lub gęstości. Do oczyszczania wirusów stosuje się metody immunologiczne, chromatografię jonowymienną, immunosorbenty itp.

Diagnostyka laboratoryjna infekcji wirusowych obejmuje wykrycie patogenu lub jego składników w materiale klinicznym; izolacja wirusa z tego materiału; serodiagnoza. Wybór metody diagnostyki laboratoryjnej w każdym indywidualnym przypadku zależy od charakteru choroby, okresu choroby i możliwości laboratorium. Współczesna diagnostyka infekcji wirusowych opiera się na metodach ekspresowych, pozwalających uzyskać odpowiedź już w kilka godzin po pobraniu materiału klinicznego we wczesnych stadiach po chorobie, do których należą mikroskopia elektronowa i immunoelektronowa, immunofluorescencja, metoda hybrydyzacji molekularnej, wykrywanie przeciwciał klasy lgM itp.

Mikroskopia elektronowa wirusów wybarwionych ujemnie pozwala na różnicowanie wirusów i określenie ich stężenia. Zastosowanie mikroskopii elektronowej w diagnostyce infekcji wirusowych ogranicza się do przypadków, w których stężenie cząstek wirusa w materiale klinicznym jest wystarczająco wysokie (10 5 w 1 ml i wyżej). Wadą tej metody jest brak możliwości rozróżnienia wirusów należących do tej samej grupy taksonomicznej. Wadę tę eliminuje się stosując immunologiczną mikroskopię elektronową. Metoda opiera się na tworzeniu kompleksów immunologicznych w wyniku dodania specyficznej surowicy do cząstek wirusa, przy równoczesnym zagęszczeniu cząstek wirusa, co umożliwia ich identyfikację. Metodę tę stosuje się także do wykrywania przeciwciał. W celu ekspresowej diagnostyki przeprowadza się badanie mikroskopem elektronowym ekstraktów tkankowych, kału, płynu z pęcherzyków i wydzieliny z nosogardzieli. Do badania morfogenezy wirusa szeroko wykorzystuje się mikroskopię elektronową, której możliwości poszerza się dzięki zastosowaniu znakowanych przeciwciał.

Metoda hybrydyzacji molekularnej, oparta na wykrywaniu specyficznych dla wirusa kwasów nukleinowych, umożliwia wykrywanie pojedynczych kopii genów i nie ma sobie równych pod względem czułości. Reakcja polega na hybrydyzacji komplementarnych nici DNA lub RNA (sond) i utworzeniu struktur dwuniciowych. Najtańszą sondą jest sklonowany rekombinowany DNA. Sonda jest znakowana prekursorami radioaktywnymi (najczęściej radioaktywnym fosforem). Obiecujące jest zastosowanie reakcji kolorymetrycznych. Istnieje kilka wariantów hybrydyzacji molekularnej: hybrydyzacja punktowa, hybrydyzacja blot, hybrydyzacja kanapkowa, hybrydyzacja in situ itp.

Przeciwciała klasy lgM pojawiają się wcześniej niż przeciwciała klasy G (w 3-5 dniu choroby) i znikają po kilku tygodniach, zatem ich wykrycie wskazuje na świeżą infekcję. Przeciwciała klasy IgM wykrywa się metodą immunofluorescencyjną lub immunoenzymatyczną z użyciem surowic odpornościowych anty-μ (surowic anty-IgM przeciwko łańcuchom ciężkim).

Metody serologiczne w wirusologii opierają się na klasycznych reakcjach immunologicznych (patrz Immunologiczne metody badań) : reakcje wiązania dopełniacza, hamowanie hemaglutynacji, neutralizacja biologiczna, immunodyfuzja, hemaglutynacja pośrednia, hemoliza promieniowa, immunofluorescencja, test immunologiczny enzymatyczny, test radioimmunologiczny. Opracowano mikrometody wielu reakcji, a ich techniki są stale udoskonalane. Metody te służą do identyfikacji wirusów przy pomocy zestawu znanych surowic oraz do serodiagnostyki w celu określenia wzrostu przeciwciał w drugiej surowicy w porównaniu do pierwszej (pierwsza surowica pobierana jest w pierwszych dniach po chorobie, druga – po 2-3 tygodnie). Wartość diagnostyczna to nie mniej niż czterokrotny wzrost przeciwciał w drugiej surowicy. Jeśli wykrycie przeciwciał klasy lgM wskazuje na niedawną infekcję, wówczas przeciwciała klasy lgC utrzymują się przez kilka lat, a czasami przez całe życie.

Do identyfikacji poszczególnych antygenów wirusów i przeciwciał przeciwko nim w złożonych mieszaninach bez wcześniejszego oczyszczania białek stosuje się immunoblot. Metoda łączy frakcjonowanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z późniejszym oznaczeniem białek metodą immunoenzymatyczną. Rozdzielenie białek zmniejsza wymagania dotyczące czystości chemicznej antygenu i umożliwia identyfikację poszczególnych par antygen-przeciwciało. Zadanie to jest istotne np. w serodiagnostyce zakażenia wirusem HIV, gdzie fałszywie dodatnie reakcje w testach enzymatycznych wynikają z obecności przeciwciał przeciwko antygenom komórkowym, które powstają w wyniku niedostatecznego oczyszczenia białek wirusowych. Identyfikacja przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko wewnętrznym i zewnętrznym antygenom wirusowym pozwala określić stopień zaawansowania choroby, a w analizie populacji – zmienność białek wirusowych. Immunoblotting w zakażeniu wirusem HIV służy jako test potwierdzający w celu wykrycia poszczególnych antygenów wirusowych i przeciwciał przeciwko nim. Analizując populacje, metodę stosuje się do określenia zmienności białek wirusowych. Ogromną wartością metody jest możliwość analizy antygenów syntetyzowanych przy użyciu technologii rekombinacji DNA, ustalenia ich wielkości oraz obecności determinant antygenowych.

Bibliografia: Bukrinskaya A.G. Wirusologia, M., 1986; Wirusologia, Metody, wyd. B. Meikhi, tłum. z języka angielskiego, M., 1988; Podręcznik metod badań mikrobiologicznych i wirusologicznych, wyd. MO Birger, M., 1982.

• - metody unieszkodliwiania odpadów zawierających substancje organiczne, polegające na ich ogrzewaniu w wyniku żywotnej aktywności termofilnych mikroorganizmów tlenowych ...

  Encyklopedia medyczna

• - metody histochemiczne wykrywanie enzymów na podstawie reakcji tworzenia się osadów fosforanu wapnia lub magnezu w miejscach lokalizacji aktywność enzymatyczna podczas inkubacji skrawków tkanek z organiczną ...

  Encyklopedia medyczna

• - metody wykrywania histiocytów w preparatach tkanka nerwowa I różne ciała stosując srebro amoniakalne lub roztwory pirydyno-sodowe srebra ...

  Encyklopedia medyczna

• - metody oceny założeń dotyczących charakteru dziedziczenia, polegające na porównaniu obserwowanych i oczekiwanych proporcji osób chorych i zdrowych w rodzinach obciążonych chorobami dziedzicznymi, z uwzględnieniem metody...

  Encyklopedia medyczna

• - służą do badania struktury i funkcji komórek i tkanek ludzi, zwierząt i roślin w warunkach normalnych, patologicznych i doświadczalnych...

  Encyklopedia medyczna

• - metody identyfikacji substancji chemicznych w skrawkach histologicznych. Integralna część G. m. to metody cytochemiczne wykrywające substancje chemiczne w komórkach przygotowanych rozmazów i odcisków...

  Encyklopedia medyczna

• - metody ilościowego i jakościowego oznaczania glukozy we krwi i moczu, polegające na utlenianiu glukozy tlenem atmosferycznym w obecności enzymu oksydazy glukozowej...

  Encyklopedia medyczna

• - metody diagnostyczne badania oparte na specyficznym oddziaływaniu antygenów i przeciwciał...

  Encyklopedia medyczna

• - metody wykrywania struktur włóknistych tkanka łączna i neuroglia w preparatach histologicznych na podstawie ich wielobarwnego barwienia...

  Encyklopedia medyczna

• - 1) metoda barwienia preparatów histologicznych skóry właściwej hemalunem Mayera, roztworem ałunu potasowego i rodaminy; jądra komórkowe są wybarwione Kolor niebieski, eleidin - na czerwono...

  Encyklopedia medyczna

• - w medycynie - zestaw metod ilościowego badania i analizy stanu oraz zachowania obiektów i systemów związanych z medycyną i opieką zdrowotną...

  Encyklopedia medyczna

• - sposoby badania różnych obiektów za pomocą mikroskopu ...

  Encyklopedia medyczna

• - opiera się na wykorzystaniu praw optyki dotyczących natury, propagacji i oddziaływania z materią promieniowania elektromagnetycznego w zakresie optycznym...

  Encyklopedia medyczna

• - metody badania i oceny jakości obiektów środowiska za pomocą narządów zmysłów...

  Encyklopedia medyczna

• - ogólna nazwa szeregu metod impregnacji preparatów histologicznych srebrem w celu wykrycia włókien glejowych i innych włókien argyrofilnych ...

  Encyklopedia medyczna

• - są wyznaczani przez śledczego i sąd w celu rozstrzygania szczególnych kwestii powstałych w trakcie dochodzeń w sprawie przestępstw i rozpatrywania spraw cywilnych. Są one również przetrzymywane na wniosek lekarza sądowego...

  Encyklopedia medyczna

„Metody badań wirusologicznych” w książkach

Wściekłość przeciwko maszynie Zabijanie w imię (1992)

Rage Against The Machine Killing In The Name (1992) Pierwsza płyta Los Angeles zespołu Rage Against The Machine łączył hip-hop i hard rock, okraszając je aktualnymi manifestami politycznymi i, przyjemnie, pokaźną dawką gęstego funkowego rytmu. W utworze „Killing in the name”, zawartym na pierwszym singlu,

James Brown Wstań (czuję się jak maszyna do seksu) (1970)

James Brown Wstawaj (Czuję się jak maszyna seksualna) (1970) Pod koniec lat 60. James Brown zaczął eksperymentować. Rozdzierająca serce dusza The Famous Flames ustąpiła miejsca skwierczącemu funkowi z The J.B.’s. Jednym z najważniejszych kamieni milowych nadchodzącej ery funku był „Sex Machine”, który w dziesięciominutowej wersji

Wściekłość na maszynę