Luovuttajien seulonta. Immunohematologiset laboratoriotutkimukset Punasolujen antigeenit (Ag).

Kaikki yhteensä veren proteiinia 60-80 g/l. On olemassa useita proteiinifraktioita, jotka suorittavat tiettyjä tehtäviä.

1. Albumiineilla (40-60 g/l) on korkea kolloidinen osmoottinen aktiivisuus.

2. Globuliinit a, b, g (20-40 g/l) muodostavat humoraalinen immuniteetti muodostaen erilaisia ​​vasta-aineita, joita kutsutaan immunoglobuliineiksi (IgM, IgG).

3. Fibrinogeeni (2-4 g/l) on tärkein tekijä veren hyytymismekanismissa.

ANTIGEENIT(kreikaksi ànti - vastaan, genos - luoda) - aineet, joilla on kyky aiheuttaa vasta-aineiden muodostumista kehossa ja reagoida niiden kanssa. Punasolukalvoon on rakennettu useita spesifisiä polysakkarideja - aminohappokomplekseja, joilla on antigeenisiä ominaisuuksia. Näitä komplekseja kutsutaan agglutinogeeneiksi.

Tähän mennessä ihmisen punasoluista on löydetty yli 400 erytrosyyttien kalvoon sijoittuvaa antigeeniä, joista 140 on yhdistetty 20 geneettisesti kontrolloituun järjestelmään. Loput antigeenit ovat yleisiä tai yksittäisiä. varten hoitokäytäntö tärkeimmät ovat ABO-järjestelmä ja Rh-järjestelmä (Rh-järjestelmä). On myös ryhmiä Kell-Chelano, Kidd, Lutheran, Duffy, Diego jne. Jälkimmäisillä on merkitystä vain toistuvien verensiirtojen yhteydessä tai raskauden aikana yhteensopimattomien näiden agglutinogeenien kanssa. Siksi ei ole suositeltavaa siirtää verta toistuvasti samalta luovuttajalta.

Punasolujen antigeenit ilmestyvät toisessa kuukaudessa alkion kehitys Kuitenkin lapsen syntymähetkellä heidän agglutinoituva aktiivisuus on alhainen ja on 1/5 aikuisten aktiivisuudesta.

VASTA-AINEET Aineet, jotka reagoivat antigeenin kanssa. Veriplasmassa on aina luonnollisia vasta-aineita ja ne kuuluvat gammaglobuliinifraktioon. Näitä ovat ABO-järjestelmän vasta-aineet - a- ja b-agglutiniinit, jotka ilmaantuvat ihmisiin ensimmäisten kuukausien aikana syntymän jälkeen ja saavuttavat enimmäismäärä 5-10 vuoden iässä.

AGGLUTINAATIOREAKTIO- erytrosyyttien liimaus ja saostaminen spesifisten vasta-aineiden vaikutuksesta - agglutiniinit. Uskotaan, että vasta-ainemolekyyli muodostaa sillan kahden punasolun välille, jossa on kaksi sitoutumiskohtaa. Jokainen näistä punasoluista puolestaan ​​sitoutuu muihin punasoluihin ja sen seurauksena ne tarttuvat toisiinsa. Kun verensiirto yhteensopimatonta verta agglutinaatio johtaa punasolujen hemolyysiin ja hyytymistekijöiden vapautumiseen. Tuloksena olevat hyytymät tukkivat pieniä verisuonia ja häiritsevät siten kapillaarikiertoa.

Agglutinaatio tapahtuu, kun luovuttajan samannimiset agglutinogeenit ja vastaanottajan agglutiniinit kohtaavat.

Testit verensiirron yhteensopivuudesta

Verensiirtolääkäri on velvollinen estämään sen mahdollista yhteensopimattomuutta potilaan veren kanssa suorittamalla kontrollitutkimuksia, mukaan lukien AB0-veriryhmien ja Rh-tekijän yhteensopivuustestit.

Yhteensopivuustestit tehdään välittömästi ennen verensiirtoa. Käytä tätä varten potilaan veriseerumia ja luovuttajan verta verensiirtoa varten valmistetusta injektiopullosta.

"Ihmisen veriryhmäjärjestelmät ja
verensiirron komplikaatiot”, M.A. Umnova

Veriryhmät määritetään agglutinaatiokokeella huoneenlämmössä posliini- tai muulle valkoiselle lautaselle, jossa on kostuva pinta. Veriryhmä voidaan määrittää kahdella tavalla: käyttämällä standardiseerumia sen määrittämiseen, minkä ryhmän agglutinogeenit (A tai B) ovat tutkittavan veren punasoluissa; samanaikaisesti käyttämällä tavallisia seerumeita ja standardeja punasoluja (ristimenetelmä). Jossa…

Koeputkeen laitetaan 2 tippaa potilaan seerumia, 1 tippa luovuttajan verta ja 1 tippa 33 % polyglusiiniliuosta, joka on erityisesti valmistettu laboratoriotarkoituksiin. Putkea ravistellaan sisällön sekoittamiseksi, minkä jälkeen se kallistaa melkein asentoon vaaka-asento niin, että sisältö valuu sen seinien yli, ja käännä hitaasti ympäri 5 minuutin ajan pystyakseli, joutuu kosketuksiin potilaan seerumisekoituksen kanssa...

Jokaisen pisaran hemagglutinaatioreaktio voi olla positiivinen tai negatiivinen. Positiivisella reaktiolla, yleensä ensimmäisten 10-30 sekunnin kuluessa sekoittamisen aloittamisesta, seokseen ilmestyy paljaalla silmällä näkyviä pieniä punaisia ​​rakeita (agglutinaatteja), jotka koostuvat liimautuneista punasoluista. Pienet agglutinaatit sulautuvat vähitellen suuremmiksi ja joskus hiutaleiksi. epäsäännöllinen muoto. Samalla seerumi on täysin ...

Luovuttajan veri on pestävä kahdesti koeputkessa, jonka tilavuus on 8-10 kertaa isotoninen liuos natriumkloridi sentrifugoimalla, poista sitten kangas ja käytä pestyjen punasolujen sedimenttiä tutkimukseen. Yksi pieni (0,01 ml) pisara pestyjä erytrosyyttejä siirretään toiseen koeputkeen, siihen lisätään 3 tippaa potilaan seerumia, sekoitetaan luovuttajan punasoluihin ja koeputki asetetaan ...

I. Valmiilla merkinnöillä yksi suuri pisara (0,1 ml) ryhmien 0αβ (I), Aβ (II) ja Bα (III) standardiseerumit levitetään levylle. Koska kummastakin ryhmästä käytetään kahden eri erän standardiseerumia, saadaan yhteensä 6 tippaa, jotka muodostavat kaksi 3 tippaa seuraavassa järjestyksessä vasemmalta oikealle: 0αβ(I), Aβ(II) ja Bα(III) ). II. Lautan pohjalla...

Tulokset tulkitaan arvioimalla ja vertaamalla tuloksia, jotka on saatu standardiseerumeilla (kaksi yläriviä) ja standardierytrosyyteillä (alempi rivi). Standardierytrosyyttien standardiseerumeilla II saatujen reaktioiden tulosten tulee vastata toisiaan, eli ne osoittavat samaa veriryhmää vastaavien agglutinogeenien ja agglutiniinien pitoisuuden. Nämä tulokset voidaan ilmaista...

Rh-kuuluvuuden määrittämiseksi eli Rh-järjestelmän antigeenien läsnäolon tai puuttumisen havaitsemiseksi ihmisten veressä käytetään standardeja anti-Rhesus-seerumia (reagensseja), jotka ovat spesifisyydeltään erilaisia, eli sisältävät vasta-aineita suhteessa tämän järjestelmän erilaisia ​​antigeenejä. Rh0 (D) -antigeenin määrittämiseen käytetään useimmiten anti-Rhesus-seerumia lisäämällä 10-prosenttista gelatiiniliuosta tai käytetään etukäteen valmistettua standardia anti-Rhesus-reagenssia ...

I. 2 putkessa yksi tippa (0,05 ml) tutkittuja punasoluja ja 2 tippaa 10 % gelatiiniliuosta, joka on kuumennettu nesteytymiseen lämmintä vettä(46 - 48 °C). II. Yhdessä näistä putkista lisätään 2 tippaa anti-Rh-seerumia erytrosyyttien ja gelatiinin seokseen. Tätä seerumia ei lisätä toiseen putkeen, se toimii kontrollina ...

Koeputkia tarkastellaan valoa vasten paljaalla silmällä tai luupin läpi kaksinkertaisella suurennuksella. Tulos tulkitaan riippuen erytrosyyttiagglutinaation olemassaolosta tai puuttumisesta. Positiivisella tuloksella agglutinaatit ovat helposti erotettavissa punaisten rakeiden tai hiutaleiden muodossa nesteen läpinäkyvää, lähes värjäytyvää taustaa vasten. Jos tulos on negatiivinen koeputkessa, tasaisen värinen vaaleanpunainen väri, hieman opaalinhohtoinen neste. Näytteet…

I. Yksi tippa (0,05 ml) testiverta tai punasoluja ruiskutetaan koeputkeen (et voi pestä sitä säilöntäaineesta), lisää 1-2 tippaa yleistä yleistä antireesusreagenssia ja sekoita punasolut reagenssia ravistamalla putkea. II. Koeputki kallistetaan melkein vaaka-asentoon niin, että sisältö leviää sen seinille, ja käännetään sitten hitaasti tähän asentoon ...

Luovuttajien valinta suoritetaan yhtenäisten lääketieteellisten kriteerien mukaan, mikä takaa veren ja sen komponenttien turvallisuuden, korkean aktiivisuuden ja tehokkuuden.

Jokainen luovuttaja käy läpi tutkimuksen ennen verenluovutusta: he keräävät anamneesin, suorittavat perusteellisen lääkärintarkastuksen ja erikoistutkimus tunnistaa verenluovutuksen vasta-aiheet ja sulkea pois mahdollisuus tartuntatautien patogeenien leviämiseen veren kanssa. Luovuttajien verelle tehdään serologisia, virologisia ja bakteriologisia tutkimuksia.

Kliinisen transfusiologian edistyminen vähentää tartuntatautien patogeenien (HIV-infektio, B- ja C-hepatiitti, kuppa, sytomegalovirusinfektio jne.) leviämisen riskiä veren ja sen komponenttien kanssa.

Veren tärkeimmät antigeenijärjestelmät

On todettu, että ihmisveren antigeeninen rakenne on monimutkainen, kaikki eri ihmisten verisolut ja plasmaproteiinit eroavat antigeeneiltä. Noin 500 veren antigeeniä tunnetaan jo, ja ne muodostavat yli 40 erilaista antigeenijärjestelmää.

Antigeeninen järjestelmä ymmärretään sarjaksi alleelisten geenien perimiä (kontrolloituja) veren antigeenejä.

Kaikki veren antigeenit on jaettu soluihin ja plasmaan. Soluantigeenit ovat ensisijaisen tärkeitä transfusiologiassa.

Solujen antigeenit

Soluantigeenit ovat monimutkaisia ​​hiilihydraatti-proteiinikomplekseja (glykopeptidejä), verisolukalvon rakenneosia. Muista komponenteista solukalvo ne eroavat immunogeenisyydestä ja serologisesta aktiivisuudesta.

Immunogeenisuus - antigeenien kyky indusoida vasta-ainesynteesiä, jos ne joutuvat organismiin, jolla ei ole näitä antigeenejä.

Serologinen aktiivisuus - antigeenien kyky sitoutua samannimiin vasta-aineisiin.

Solun antigeenimolekyyli koostuu kahdesta osasta:

Schlepper (kalvon sisäkerroksissa sijaitseva antigeenin proteiiniosa), joka määrittää immunogeenisyyden;

Hapteen (antigeenin polysakkaridiosa, joka sijaitsee solukalvon pintakerroksissa), joka määrittää serologisen aktiivisuuden.

Hapteenin pinnalla on antigeenisiä determinantteja (epitooppeja) - hiilihydraattimolekyylejä, joihin on kiinnittynyt vasta-aineita. Tunnetut veren antigeenit eroavat toisistaan ​​epitooppien mukaan.

Esimerkiksi AB0-järjestelmän antigeenien hapteeneilla on seuraavat hiilihydraatit: antigeenin 0 epitooppi on fukoosi, antigeeni A on N-asetyyligalaktosamiini ja antigeeni B on galaktoosi. Ryhmävasta-aineet ovat yhteydessä niihin.

Sellulaarisia antigeenejä on kolmenlaisia:

punasolut;

Leukosyytit;

Verihiutale.

RBC-antigeenit

Tunnetaan yli 250 erytrosyyttiantigeeniä, jotka muodostavat yli 20 antigeenijärjestelmää. 11 systeemiä ovat kliinisesti tärkeitä: AB0, Rh-Hr, MNSs, Kell, Lutheran, Kidd, Diego, Duffy, Dombrock, erytrosyyttien entsymaattiset ryhmät.

Ihmisillä erytrosyyteissä on samanaikaisesti useiden antigeenijärjestelmien antigeenejä.

Transfusiologian tärkeimmät antigeenijärjestelmät ovat AB0 ja Rhesus. Muilla punasolujen antigeenisillä järjestelmillä ei ole tällä hetkellä merkittävää merkitystä kliinisessä transfusiologiassa.

Antigeeninen järjestelmä AB0

AB0-järjestelmä on tärkein serologinen järjestelmä, joka määrittää siirretyn veren yhteensopivuuden tai yhteensopimattomuuden. Se koostuu kahdesta geneettisesti määrätystä agglutinogeenista (antigeenit A ja B) ja kahdesta agglutiniinista (vasta-aineet α ja β).

Agglutinogeenit A ja B ovat erytrosyyttien stroomassa ja agglutiniinit α ja β löytyvät veren seerumista. Agglutiniini α on vasta-aine agglutinogeeni A:ta vastaan ​​ja agglutiniini β on agglutinogeeni B:tä vastaan. Yhden henkilön punasoluissa ja veren seerumissa ei voi olla samannimisiä agglutinogeenejä ja agglutiniineja. Kun samannimiset antigeenit ja vasta-aineet kohtaavat, tapahtuu isohemagglutinaatioreaktio. Tämä reaktio on syy veren yhteensopimattomuuteen verensiirron aikana.

Riippuen antigeenien A ja B yhdistelmästä erytrosyyteissä (ja vastaavasti α- ja β-vasta-aineiden seerumissa), kaikki ihmiset jaetaan neljään ryhmään.

Rhesus-antigeenijärjestelmä

Rh-tekijä (Rh-tekijä), joka on nimetty, koska se löydettiin ensimmäisen kerran Rhesus-apinoista, esiintyy 85 prosentilla ihmisistä ja 15 prosentilla puuttuu.

Nyt tiedetään, että Rhesus-järjestelmä on melko monimutkainen ja sitä edustaa viisi antigeeniä. Rh-tekijän rooli verensiirrossa sekä raskauden aikana on erittäin suuri. Rhesus-konfliktin kehittymiseen johtavat virheet aiheuttavat vakavia komplikaatioita ja joskus potilaan kuolema.

Pienet antigeeniset järjestelmät

Sekundaarisia erytrosyyttiryhmiä edustaa suuri määrä antigeenejä. Tämän moninaisten järjestelmien tuntemus on tärkeää joidenkin ongelmien ratkaisemiseksi antropologiassa, oikeuslääketieteellisessä tutkimuksessa sekä verensiirron jälkeisten komplikaatioiden ja tiettyjen vastasyntyneiden sairauksien kehittymisen ehkäisemisessä.

MNS-järjestelmä sisältää tekijät M, N, S, s. Kahden läheisesti liittyvän geenilokuksen MN ja Ss läsnäolo on todistettu. Myöhemmin tunnistettiin muita erilaisia ​​MNS-järjestelmän antigeenien variantteja. Kemiallisen rakenteen mukaan MNS:t ovat glykoproteiineja.

R-järjestelmä. P-antigeenijärjestelmällä on jonkin verran kliinistä merkitystä. Isovasta-aineiden aiheuttamia varhaisia ​​ja myöhäisiä keskenmenoja on esiintynyt. anti-R. Useita verensiirron jälkeisiä komplikaatioita, jotka liittyvät luovuttajan ja vastaanottajan yhteensopimattomuuteen P-antigeenijärjestelmän mukaisesti, on kuvattu.

Kell järjestelmä edustaa kolme paria antigeenejä. Kell (K) ja Cellano (k) -antigeeneillä on korkein immunogeeninen aktiivisuus. Kell-järjestelmän antigeenit voivat aiheuttaa kehon herkistymistä raskauden ja verensiirron aikana, aiheuttaa verensiirtokomplikaatioita ja vastasyntyneen hemolyyttisen taudin kehittymistä.

luterilainen järjestelmä. Yhdellä luovuttajista, nimeltä luterilainen, oli veren punasoluissa aiemmin tuntematon antigeeni, joka johti vastaanottajan immunisointiin. Antigeenille annettiin nimi Lu a. Muutamaa vuotta myöhemmin tämän järjestelmän toinen antigeeni, Lu b, löydettiin. Niiden taajuus: Lu a - 0,1%, Lu b - 99,9%. Anti-Lub-vasta-aineet ovat isoimmuuneja, minkä vahvistavat myös raportit näiden vasta-aineiden merkityksestä vastasyntyneen hemolyyttisen taudin synnyssä. Luterilaisen järjestelmän antigeenien kliininen merkitys on pieni.

Kidd järjestelmä. Kidd-järjestelmän antigeeneillä ja vasta-aineilla on spesifinen käytännön arvoa. Ne voivat olla syynä vastasyntyneen hemolyyttisen taudin ja verensiirron jälkeisten komplikaatioiden kehittymiseen toistuvilla verensiirroilla, jotka eivät ole yhteensopivia tämän järjestelmän antigeenien kanssa. Antigeenien esiintymistiheys on noin 75 %.

Diego järjestelmä. Vuonna 1953 Venezuelassa Diegon perheeseen syntyi lapsi, jolla oli merkkejä hemolyyttisestä taudista. Tämän taudin syytä määritettäessä lapsessa havaittiin aiemmin tuntematon antigeeni, joka on nimetty Diego-tekijällä (Di). Vuonna 1955 tehdyt tutkimukset paljastivat, että Diego-antigeeni on mongoloidirodun kansoille tyypillinen rodullinen piirre.

Duffy järjestelmä koostuu kahdesta pääantigeenistä - Fy a ja Fy b. Anti-Fy a -vasta-aineet ovat epätäydellisiä vasta-aineita, ne osoittavat vaikutuksensa vain epäsuorassa antiglobuliini Coombs -testissä. Myöhemmin löydettiin antigeenit Fyx, Fy3, Fy4, Fy5. Taajuus riippuu henkilön rodusta, jolla on hyvin tärkeä antropologeille. Negroidipopulaatioissa Fy a -tekijän esiintymistiheys on 25%, kiinalaisilla, eskimoilla ja Australian alkuperäiskansoilla - lähes 100%, valkoihoisilla - 60-82%.

Dombrockin järjestelmä. Vuonna 1973 tunnistettiin Doa- ja Dob-antigeenit. Tekijä Do a löytyy 55-60 % tapauksista ja tekijä Do b - 85-90 % tapauksista. Tällainen taajuus asettaa tämän serologisen verijärjestelmän viidenneksi informatiivisuudessa isyyden rikosteknisessä määrittämisessä (Rhesus-järjestelmä, MNS:t, AB0 ja Duffy).

Entsymaattiset erytrosyyttien ryhmät. Vuodesta 1963 lähtien on tullut tunnetuksi huomattava määrä ihmisen erytrosyyttien geneettisesti polymorfisia entsyymijärjestelmiä. Näillä löydöillä oli merkittävä rooli ihmisen veriryhmien yleisen serologian kehityksessä sekä kiistanalaisen isyyden oikeuslääketieteellisen tutkimuksen näkökulmasta. Punasolujen entsyymijärjestelmiä ovat fosfaattiglukomutaasi, adenosiinideaminaasi, glutamaatti-pyruvaattitransaminaasi, esteraasi-D jne.

Tässä vaiheessa se on todistettu hemolyyttinen sairaus sikiö ja vastasyntynyt on eräänlainen alloimmuunisytopenia, joka johtuu äidin immunisoinnista sikiön verisoluilla, jotka kantavat kalvoilla antigeenejä, joita raskaana olevalla naisella ei ole. Tämä prosessi voi johtua sikiön punasolujen ja muiden verisolujen (verihiutaleet, neutrofiilit) kalvolla olevista erilaisista antigeeneistä, jotka pääsevät äidin verenkiertoon istukan kautta ja aiheuttavat vasta-aineiden muodostumista äidissä. Alloimmuunierytropeniat havaitaan useimmiten, koska sikiön ja äidin veri on yhteensopimaton ABO- ja Rhesus-järjestelmän antigeenien kanssa.

Sikiössä kehittyvän anemian luonne (hemolyyttinen, aplastinen) riippuu sen aiheuttavasta antigeenistä tai antigeeneistä. Samaan aikaan sikiöillä, joilla on erytropenia erilainen synty, samanlainen kliiniset ilmentymät ei-invasiivisilla ja invasiivisilla varmennusmenetelmillä

Sikiön/vastasyntyneen alloimmuuninen erytropenia, mukaan lukien hemolyyttinen sairaus (HDFN) on sairaus, jolle on ominaista punasolujen hemolyysi ja/tai hematopoieesin estyminen äidissä muodostuneiden vasta-aineiden vaikutuksesta sikiön punasolujen antigeeneille, jotka tunkeutuvat keskenään istukan esteen läpi. , joka ilmenee sikiössä/vastasyntyneessä anemiana, erytrosyyttien ja usein bilirubiinin lisääntymisenä.

Koska erot äidin ja sikiön veressä erytrosyyttiantigeenien suhteen ovat ensisijaisen tärkeitä taudin patogeneesissä, on tarpeen ottaa huomioon niiden immunohematologiset ominaisuudet.

Immunohematologian nykyisessä kehitysvaiheessa tunnetaan yli 250 erytrosyyttiantigeeniä, jotka ovat yleensä jakautuneet geneettisesti 29:ään. itsenäiset järjestelmät. Jokaista järjestelmää koodaa yksi tai useampi geeni. RBC-antigeenit ovat proteiineja (esim. Rhesus-järjestelmä), glykoproteiineja tai glykolipidejä (ABO-järjestelmä).

Vuodesta 1980 nykypäivään International Society for Blood Transfusion (ISBT) on jatkanut työtä tunnettujen lääketiede erytrosyyttiantigeenit. Nykyisen nimikkeistön mukaan kaikki erytrosyyttiantigeenit on jaettu järjestelmiin, kokoelmiin ja sarjoihin.

Taulukossa 1 on luettelo tunnetuista 29 erytrosyyttiantigeenijärjestelmästä, jotka on yhdistetty niihin niiden tuotteita koodaavien yhteisten geenien läsnäolon periaatteen mukaisesti. On tapana merkitä antigeenijärjestelmät niiden löytämisjärjestyksessä kolminumeroisilla luvuilla nousevassa järjestyksessä alkaen 001:stä. Järjestelmässä jokaisella antigeenillä on myös kolminumeroinen numero. Siten jokainen antigeeni on yleensä merkitty kuusinumeroisella numerolla.

Kokoelmat yhdistävät antigeenejä, jotka liittyvät biokemiallisesti ja serologisesti fenotyyppitasolla, mutta joilla ei ole tuotteitaan koodaavia yhteisiä geenejä, eivätkä siksi täytä antigeenijärjestelmien vaatimuksia.

Antigeenit, joiden niitä koodaavia geenejä ei ole vielä tutkittu, ryhmitellään sarja kahdesta ryhmästä - matalalla ja korkeataajuus esiintyminen.

Punasolujen alloantigeenit perinteisesti jaettuna yleiset antigeenit, antigeenit keskimääräinen esiintymistiheys ja harvinainen antigeenit. Yleisiä antigeenejä löytyy melkein kaikista ihmisistä, joten vasta-aineita tällaisille antigeeneille muodostuu harvoin. Kuitenkin, jos verensiirto on tarpeen suorittaa potilaille, joilla on vasta-aineita usein esiintyville antigeeneille, syntyy yleensä vaikeuksia luovuttajien valinnassa. Jos antigeeni jakautuu alle 1 %:n taajuudella, se luokitellaan harvinaisten antigeenien ryhmään.

pöytä 1

RBC-antigeenijärjestelmät

Potilailla, joilla on isoimmunisaatio harvinaisiin antigeeneihin, on useimmissa tapauksissa vaikea suorittaa immunohematologista tutkimusta vasta-aineiden todentamiseksi, koska tämä prosessi vaatii pitkän ja kalliin tutkimuksen, jossa käytetään suurta määrää näytteitä ja testijärjestelmiä.

Kliinisestä lähtien merkittäviä muotoja hemolyyttiset sairaudet johtuvat pääasiassa Rhesus-järjestelmän antigeeneille muodostuneista vasta-aineista, on tarpeen keskittyä tämän järjestelmän antigeeneille ehdotettuun luokitukseen. Tällaisia ​​luokituksia on useita. Yksi niistä on Wiener-antigeenien reesusluokitus. Se perustuu oletukseen, että Rh-kromosomissa on vain yksi paikka, jossa yksi kahdeksasta allelomorfisesta geenistä voi olla käytössä. Jokainen geeni koodaa agglutinogeenin tuotantoa, joka on antigeenikompleksi. Antigeenien nimitys Wienerin mukaan on monimutkainen, eikä sitä tällä hetkellä käytetä laajasti immunohematologiassa. Heille on kuitenkin tavallista nimetä vasta-aineiden spesifisyys anti-Rhesus-immunoglobuliinissa - "Rho (D)".

WHO:n biologisten standardien asiantuntijakomitea suosittelee käytettäväksi Rhesus-antigeenien Fisher-Reis-luokitus. Se perustuu oletukseen, että Rh-kromosomissa on kolme paikkaa kolmelle geenille. Lisäksi jokainen geenikompleksi koostuu kolmesta antigeenideterminantista: D tai sen puuttuminen - d, C tai c, E tai e erilaisissa yhdistelmissä.

Tutkimuksessa Viime vuosina vain kaksi geeniä on esitetty (RHD ja RHCE), joka vastaa Rhesus-järjestelmän punasolujen antigeenien tuotannosta. Siten geeni säätelee antigeeni D:n tuotantoa rhd, kun taas antigeenit C, c, E, e - genomi RHCE. Jossa suuri määrä antigeenit, jotka muodostavat Rhesus-järjestelmän (48 antigeeniä), selittyy näiden kahden geenin mutaatioilla. Ei ole tietoa antigeenin d läsnäolosta, koska ei ole geeniä, joka olisi vastuussa tämän antigeenin synteesistä.

Sikiön ja vastasyntyneen hemolyyttisen taudin voivat aiheuttaa myös muut Rhesus-järjestelmän antigeenit kuin D, samoin kuin muut muiden järjestelmien niin sanotut "epäsäännölliset" antigeenit tai yhden järjestelmän useiden antigeenien yhdistelmä. Tässä tapauksessa termiä "erytrosyyttien alloimmunisaatio" käytetään useimmiten kirjallisuudessa kuvaamaan alloimmuuniprosessia.

Erytrosyyttiantigeenien alloimmunisaatio on tärkein syy aneemisen oireyhtymän kehittymiseen sikiössä. Joten US Center for Disease Control and Prevention (vuosi) mukaan toteutetusta immunoprofylaksiaohjelmasta huolimatta Rh-herkistyminen tapahtuu 6,7 tapauksessa 1000 elävänä syntynyttä kohden. Jos lisäämme niihin tapaukset, joissa alloimmunisaation kehittyminen muiden ryhmien erytrosyyttien antigeenien vaikutuksesta (Kell, Kidd, Duffy), Yhdysvalloissa rekisteröidään vuosittain yli 30 000 sikiötä, joilla on riski saada alloimmuunianemia. Valitettavasti tällainen täysimittainen tilastot Venäjän federaatio ei ole vielä saatavilla, koska riskipotilaiden yksityiskohtaisia ​​immunohematologisia testejä ei ole toteutettu riittävästi.

Näin ollen isoimmunisaation riittävän arvioimiseksi on ensinnäkin tarpeen etsiä ja tunnistaa raskaana olevan naisen veressä kiertäviä punasolujen vasta-aineita.

Punasoluantigeenien rooli sikiön ja vastasyntyneen hemolyyttisen taudin esiintymisessä on erilainen, ja sen määrää tietylle antigeeniluokalle muodostuneiden allovasta-aineiden kyky tuhota punasoluja tai häiritä niiden muodostumisprosesseja sikiössä. Immuunivasta-aineiden muodostumisprosessi sikiön erytrosyyttiantigeeneille riippuu äidistä puuttuvan antigeenin läsnäolosta, sen immunogeenisuudesta sekä raskaana olevan naisen verenkiertoon tulevien sikiön punasolujen määrästä.

Punasoluantigeenien vasta-aineet (allovasta-aineet) ovat luonnollisia (säännöllisiä) ja immuuneja (epäsäännöllisiä). Joten ihmisten (paitsi henkilöiden, joiden veriryhmä on AB) veren seerumissa on jatkuvasti läsnä synnynnäisiä luonnollisia vasta-aineita ABO-järjestelmän antigeeneille A ja / tai B, jotka koostuvat neljästä antigeenistä.

Sikiön ja myöhemmin vastasyntyneen sairaus johtuu äidin ja sikiön punasolujen yhteensopimattomuudesta ABO-antigeenijärjestelmän mukaan 10–20 %:ssa tapauksista. Samaan aikaan sikiön/vastasyntyneen hemolyyttinen sairaus kehittyy 40 kertaa useammin naisilla, joilla on veriryhmä 0 (I) ja puolisolla, jolla on eri veriryhmä. Kuitenkin, kun tämän tyyppinen isoimmunisaatio tapahtuu vaikeita muotoja sikiön ja vastasyntyneen sairauksia havaitaan vain yksittäisissä tapauksissa - 1:3000 syntymää.

Geeliagglutinaatiomenetelmä erytrosyyttiantigeenien ja punasolujen vastaisten vasta-aineiden määrittämiseen

Johdanto

Y. Lapierre ehdotti geeliteknologiaa mikroputkissa (GTM) vuonna 1989. Menetelmä perustuu erytrosyyttien agglutinaatioon mikroputkiin sijoitetussa Sephadex-agargeelissä. Tyypillisesti järjestelmä on muovikortti, joka sisältää geelillä täytettyjä mikroputkia (patentti DiaMed AG, Sveitsi). Hemagglutinaatioreaktioon perustuvat immunohematologiset tutkimukset suoritetaan yleensä nestefaasijärjestelmissä.

Yksi kaikista tärkeitä ehtoja oikean tiedon saaminen agglutinaatioreaktiosta on tuloksen arviointi. Varsinkin kokematon henkilökunta voi tulkita huonon vastauksen väärin. Epäsuoran antiglobuliinitestin vääriä heikkoja tai negatiivisia tuloksia saattaa ilmetä, koska seerumijäämät neutraloivat antiglobuliinireagenssia punasolujen riittämättömän tehokkaan pesun vuoksi. Punasolujen riittämätön sekoittuminen ja heikosti kiinnittyneiden vasta-aineiden eluoituminen pesuprosessin aikana voivat aiheuttaa virheitä epäsuorassa antiglobuliinitestissä.

Geeliagglutinaatiotekniikka kehitettiin hemagglutinaatioreaktioiden standardoimiseksi ja saamiseksi luotettavia tuloksia. Geeliteknologia mahdollistaa punasolujen erottamisen sentrifugoinnin aikana, kun taas agglutinoitumattomat punasolut kulkevat geelin läpi ja asettuvat putkien pohjalle ( negatiivinen tulos), kun taas agglutinoituneet jäävät geelin pinnalle tai paksuuteen ( positiivinen tulos). Geelisentrifugointi voi olla minkä tahansa hemagglutinaatioon perustuvan serologisen testin viimeinen vaihe, lukuun ottamatta menetelmiä, jotka edellyttävät dispergointia tuloksen arvioimiseksi.

Suoritetut testit sisältävät punasolujen fenotyypin määrityksen (mukaan lukien heikot antigeenivariantit), antiglobuliinitestauksen, vasta-aineseulonnan ja -tunnistuksen, yhteensopivuustestit ja muutamat muut.

Geelitestin periaate

Puskuroitu dekstraanigeeli Sephadex TM G 100 superline voi olla joko neutraali tai sisältää spesifisiä antiseerumeja tai antiglobuliinireagenssia geelimatriisilla. Geelille levitetään punasoluja tai punasolujen ja seerumin seosta. Solut levitetään aina ennen seerumeita - toisin kuin tavanomaisissa serologisissa tekniikoissa - jotta testattavat seerumit eivät joudu kosketuksiin geelin kanssa, mikä on erityisen tärkeää antiglobuliinitestiä suoritettaessa. Inkuboinnin jälkeen seuraa sentrifugointi tiukasti määritellyssä tilassa. Jos sentrifugointiolosuhteet eivät täyty (sentrifugointi ei ole riittävän pitkä tai liian pehmeä), saattaa esiintyä vääriä positiivisia tuloksia. Väärin negatiivisia tuloksia voi esiintyä myös, jos sentrifugoinnin ehtoja (pakottaa) rikotaan. Automaattisen ID-sentrifugin (Diamed) käyttö poistaa nämä ongelmat. Testauksessa käytetään yleisesti kolmen tyyppistä geeliä:

1. neutraali, ei sisällä spesifisiä vasta-aineita (käytetään vasta-aineiden etsimiseen ja tunnistamiseen suolaliuoksella ja entsymaattisilla menetelmillä, luovuttajan ja vastaanottajan veren yhteensopivuuden testin kylmävaihe);
2. spesifisiä, jotka sisältävät vasta-aineita (monoklonaalisia tai polyklonaalisia) ihmisen erytrosyyttiantigeeneille (käytetään ABO-, Rhesus-, Kell-järjestelmien jne. erytrosyyttiantigeenien tyypitykseen)
3. antiglobuliini, joka sisältää vasta-aineita (polyspesifisiä tai monospesifisiä) ihmisen immunoglobuliineille ja komplementtijärjestelmän komponenteille (käytetään suorassa ja epäsuorassa antiglobuliinitestissä (Coombs-reaktio) auto- ja alloimmuunivasta-aineiden etsimisessä ja tunnistamisessa, luovuttajan ja vastaanottajan yhteensopivuustesti veri).

Testattua verta lisätään ylempi osa diagnostisten korttien mikroputkia ja sentrifugoinnin aikana agglutinoituneet ja agglutinoimattomat punasolut erotetaan seuraavasti: agglutinoitumattomat punasolut ovat kooltaan verrattavissa geelihiukkasten kokoon ja kulkevat niiden läpi vapaasti keskipakovoiman vaikutuksesta muodostaen tiiviin punaisen sakka mikroputken pohjalla - negatiivinen tulos; agglutinoidut erytrosyytit suuren kokonsa vuoksi viipyvät geelin pinnalla tai sen paksuudessa - positiivinen tulos.

Kiinteä agglutinaatio geelissä helpottaa reaktion tuloksen arviointia, ja kontrollimikroputken läsnäolo diagnostisessa kaaviossa vahvistaa saatujen tietojen luotettavuuden.

Riippuen agglutinaatioreaktion voimakkuudesta geeliväliaineessa hyväksyttiin seuraava arvio saaduista tuloksista:

• vahvasti positiivinen (++++) - muodostuneet erytrosyyttiagglutinaatit viipyivät geelin pinnalla;
• positiivinen (+++) - agglutinaatit sijaitsevat geelikolonnin yläosassa;
• heikosti positiivinen (++) - agglutinaatit kiinnittyvät geelin ylempään kahteen kolmasosaan;
• erittäin heikosti positiivinen (+) - agglutinaatit sijaitsevat geelin alemmassa kolmanneksessa;
• negatiivinen (-) - erytrosyytit muodostavat tiiviin sedimentin mikroputken pohjalle.

Laitteet ja reagenssit

• ID-kortit erytrosyyttiantigeenien ja punasolujen vastaisten vasta-aineiden määrittämiseen;
• ID-sentrifugi korttien sentrifugointiin;
• termostaatti +37°С;
• koeputkien ja korttien teline;
• koeputket, joiden tilavuus on 5 ja 10 ml;
• puoliautomaattiset yksikanavaiset pipetit (10, 25, 50 µl);
• kumi kirurgiset käsineet;
• laimennusliuos 1 (bromelainliuos);
• laimennusliuos 2 (alhaisen ionivahvuuden liuos - LISS, RNIS);
• 0,9 % natriumkloridiliuos;
• standardityyppiset ihmisen punasolut vasta-aineiden havaitsemiseen ja ristireaktioon.

Henkilökorttien ominaisuudet

Henkilökortit (ID-kortit) Dia-Med ovat muovikortteja, joissa on kuusi mikroputkia. Viisi putkea sisältävät geelin ja antiseerumin seoksen. Jokaisessa kortissa on kuudes kontrolliputki, joka sisältää neutraalia geeliä ilman vasta-aineita (ctl). Putket on merkitty tunnistekortilla havaittavien antigeenien mukaan, esimerkiksi: A-B-AB-D-CDE-ctl tai C-c-E-e-K-ctl. Punasoluantigeenien vasta-aineiden havaitsemiseen tarkoitetuissa tunnistekorteissa on joitain eroja, esimerkiksi "Coombs / Enzyme Test" -kortit: kolme vasemmalla olevaa putkea sisältävät geelin, joka sisältää vasta-aineita ihmisen globuliineille (monospesifinen anti-IgD tai polyspesifinen - eri luokkien immunoglobuliineille) ) - Coombsin reaktio. Seuraavat kolme putkea sisältävät vain neutraalia geeliä, joka on suunniteltu havaitsemaan erytrosyyttiantigeenien vasta-aineita suolaliuoksessa.

Yleiset säännöt henkilökorttien käytöstä

1. Henkilökortit tulee säilyttää kuivassa, pimeässä paikassa 18-25°C lämpötilassa. Viimeinen käyttöpäivä on merkitty kunkin kortin passi-osaan ja pakkauslaatikoihin.
2. Punasolususpension valmistukseen tarkoitetut liuokset sekä yksittäisissä tutkimuksissa käytetyt standardiseerumit ja standardi ID-erytrosyytit tulee säilyttää kuivassa, pimeässä paikassa 2-8°C:n lämpötilassa. Viimeinen käyttöpäivämäärä on ilmoitettu kunkin injektiopullon etiketissä ja pakkauslaatikossa.
3. Välttääksesi saamisen vääriä tuloksia tutkimuksissa, älä käytä reagensseja ja kortteja, jotka ovat vanhentuneet, samoin kuin kuivuneet, sisältävät kaasukuplia tai jos kuori on vaurioitunut.
4. Veri kerätään nykyaikaisilla flebotomiatekniikoilla, ja myös valtimo-, kapillaari- ja napaveri (ilman pesua) sopii. Tutkimukseen soveltuvat sekä kokoverinäytteet (puhtaassa, kuivassa putkessa) että säilöntäaineilla ja stabilointiaineilla otetut verinäytteet.

Punasoluantigeenien tyypitys

DiaMed ID-kortit on tarkoitettu luovuttajan ja vastaanottajan punasolujen (mukaan lukien niiden heikot antigeenimuunnokset) ABO-veriryhmän ja Rh-kuuluvuuden samanaikaiseen määritykseen sekä muiden punasoluantigeenien tyypitykseen. DiaMed-henkilökortteja voidaan käyttää isohemagglutinoivan seerumin, anti-D-, anti-DCE-reagenssien, anti-A-, anti-B-, anti-D- ja anti-D-superkollikonien sijasta tai rinnakkain.

• [näytä] .

  Alkuvaihe suoritetaan eri tavoilla riippuen käytetyistä henkilökorteista, jotka sisältävät polyklonaalisia (katso kohta 1a alla) tai monoklonaalisia (katso kohta 16) vasta-aineita:

  1a) Valmista tutkituista punasoluista suspensio polyklonaalisia vasta-aineita sisältävien ICID-korttien laimennusliuokseen), jolle:

  • säilytä laimennusliuosta 1, kunnes se saavuttaa huoneenlämpötilan;
  • valmistaa 5-prosenttinen testipunasolujen suspensio laimennusliuokseen 1 laittamalla koeputkeen 0,5 ml laimennusliuosta 1 ja 50 µl testattavaa kokoverta tai 25 µl erytrosyyttimassaa;
  • sekoita varovasti ja inkuboi 10 minuuttia huoneenlämpötilassa;
  • käytä viimeistään 15 minuuttia inkubaation jälkeen.

  16) Valmista testierytrosyyttien suspensio laimennusliuokseen 2 (monokliinisia vasta-aineita sisältävät henkilökortit), jolle:

  • säilytä laimennusliuosta 2, kunnes se saavuttaa huoneenlämpötilan;
  • etiketti puhdas koeputket;
  • valmista 5-prosenttinen testipunasolujen suspensio laimennusliuokseen 2 laittamalla koeputkeen 0,5 ml laimennusliuosta 1 ja 50 µl testattavaa kokoverta tai 25 µl punasolumassaa.
• Jatkotoimet [näytä] .
  1. Merkitse henkilökorttiin (testiseeruminäytteen N tai potilaan koko nimi).
  2. Poista suojakalvo ID-kortin putkista.
  3. Lisätään jokaiseen ID-kortin koeputkeen 10 µl kohdan 1a mukaisesti valmistettuja testierytrosyyttejä tai 50 µl kohdan 16 mukaisesti valmistettuja testierytrosyyttejä.
  4. Asenna ID-kortit ID-sentrifugin roottoriin (pakollinen tasapainotus muiden ID-korttien kanssa, mahdollisesti käyttämättä).
  5. Sentrifugoi ID-kortit (sentrifugoinnin aika ja nopeus ovat vakioita ja asettuvat automaattisesti).
  6. Arvioi testitulos: Kontrollimikroputken tuloksen - "ctl" - tulee aina olla negatiivinen. Positiivinen reaktio "kontrollissa" voi johtua autovasta-aineiden ja ei-spesifisten plasmaproteiinien läsnäolosta. Jos "kontrolli" on positiivinen - määritys on epäluotettava, se on toistettava erytrosyyttinäytteen yhden pesun jälkeen 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella tai laimennusliuoksella 2.
  7. Syötä kunkin antigeenin määrityksen tulokset henkilökortin vastaavaan sarakkeeseen (valkoiseen kenttään kunkin antigeenin alla).
  8. Tunnista tulos seuraavan kaavion mukaan (taulukko 18.7-18.9)

  Taulukko 18.7. ABO-veriryhmän antigeenien ja Rh-kuuluvuuden tutkimuksen tulokset ABO/Rh ID-kortissa
  Havaittavissa olevat antigeenit					Johtopäätös
  MUTTA	AT	AB	D	CDE
  +	+	+	+	+	AB Rh+
  +	+	+	-	-	AB Rh-
  +	-	+	+	+	A Rh+
  +	-	+	-	-	Ja Rh-
  -	+	+	+	+	Rh+:ssa
  -	+	+	-	-	Rh-
  -	-	-	+	+	0 Rh+
  -	-	-	-	-	0 Rh-
  Huomautus: Tutkimuksen spesifisyyden vahvistaa negatiivinen tulos ID-kortin kontrolliputkessa.

  Taulukko 18.8 ABO-järjestelmän punasolujen antigeenien määritys
  Veriryhmä
  	anti-A	anti-B	anti-AB
  0(1)	-	-	-
  A1(II)	++++	-	++++
  А2(II)	++++	-	++++
  А3(II)	++/+++	-	++/++++
  A x (II)*	-/++	-	+/++
  B(II)	-	++++	++++
  В3(III)	-	+/+++	+/+++
  B x (III)*	-	-/++	-/++
  A1B(IV)	++++	++++	++++
  A2B(IV)	+++/++++	++++	++++
  Huomautus: * - antigeenien A ja B erittäin heikkojen varianttien määrittäminen vaatii lisätutkimusta.

  Taulukko 18.9 Rh-liittymän määritelmä (D, CDE)
  Reesus-kuuluvuus	Seerumitutkimuksen tulokset
  	Anti-D	Anti-CDE
  D-positiivinen	++++	++++
  D-negatiivinen	-	-
  D-negatiivinen, C	E-positiivinen*	-
  Heikko positiivinen (D u)	± - +++	+++:sta ++++:aan
  Huomautus: * - Positiivinen reaktio anti-CDE-seerumin kanssa klo takaisku anti-D-seerumilla osoittaa C-, E-antigeenien läsnäolon ja vaatii lisätyypitystä henkilökorteilla: C-c-E-e-K-stl tai C-C w -c-E-e-K

Käytetyt henkilökortit

Veriryhmiä ja Rh-kuuluvuutta määritettäessä käytetään polyklonaalisia (Taulukko 18.10 [näytä] ) ja monoklonaalinen (taulukko 18.11 [näytä] ) reagenssit. Yleisin sovellus käytännössä johtuen taloudellinen kannattavuus löytää monoklonaalisia seerumeja.

Tekijä: moderni luokitus yksilöt, joilla on heikentynyt D-antigeenin variantti, joka pystyy tuottamaan anti-D-vasta-aineita, jaetaan seitsemään luokkaan. Kategorialla VI on suurin esiintymistiheys ja käytännön merkitys, jonka punasoluissa on vain D-antigeenin epitooppi Z. Kategorian VI henkilöt (Rh-negatiiviset vastaanottajat, mutta Rh-positiiviset luovuttajat!) voivat tuottaa vasta-aineita muuttumattomalle D- ja kaikkien muiden luokkien osittainen D. Veriryhmän vahvistamiseen käytetään erilaisia ​​henkilökortteja: D (IV -) - vastaanottajille, D (IV +) - luovuttajille.

ABO-veriryhmän ja Rh-lisäosien määritys suoritetaan tunnistamalla tietyt antigeenit ja vasta-aineet (kaksois- tai ristireaktio) (taulukko 18.12) [näytä] ).

Syvälliseen tutkimukseen käytetään muita karttoja (taulukko 18.13-18.14 [näytä] ).

Punasolujen vastaisten vasta-aineiden havaitseminen

Menetelmän periaate

Testiseerumit ja standardierytrosyytit vasta-aineiden havaitsemista varten lisätään mikroputkien yläosaan. Inkuboinnin ja sentrifugoinnin jälkeen agglutinoituneet punasolut jäävät putken yläosaan, koska ne eivät kulje geelin läpi. iso koko agglutinaatit (positiivinen tulos). Jos testierytrosyyttien antigeeneille ei ole vasta-aineita, agglutinaatteja ei muodostu. Agglutinoitumattomat punasolut kulkevat helposti geelin läpi ja asettuvat putken pohjalle (negatiivinen tulos). Agglutinaation luonne erytrosyyttien vasta-aineiden havaitsemisessa riippuu vasta-aineiden tiitteristä, niiden aktiivisuudesta ja sen arvioidaan olevan ++++ -+.

• Tutkimusalgoritmi [näytä] .

  Tyypityt punasolut ennen tutkimusta on ensin pestävä kahdesti säilöntäaineesta 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella ja suoritettava sitten seuraavat vaiheet:

  • säilytä laimennusainetta 2, kunnes huoneenlämpötila on saavutettu;
  • etiketti putket;
  • valmistaa 0,8-prosenttinen suspensio tyypitetyistä punasoluista laimennusliuokseen 2 laittamalla 1,0 ml laimennusliuosta 2 ja 10 µl verta koeputkeen;
  • poista suojakalvo henkilökortista;
  • merkitse henkilökortti (testiseeruminäytteen numero tai potilaan koko nimi);
  • lisää 50 µl standardierytrosyyttejä mikroputkiin;
  • lisää 25 µl testinäytteen seerumia tai plasmaa jokaiseen mikroputkeen;
  • inkuboi 15 minuuttia +37 °C:n lämpötilassa;
  • sentrifugoi ID-kortit ID-sentrifugissa (sentrifugoinnin aika ja nopeus ovat vakioita ja asettuvat automaattisesti).

  Huomautus: DiaMedin paneelin ID-DiaCell I-II-III ja ID-DiaCell I-Ii-III P standardierytrosyytit ovat valmiita käyttöön ilman aiempaa pesua ja käsittelyä laimennusliuoksella 2.

• Tulosten tulkinta [näytä] .

  Positiivinen reaktio tarkoittaa immuunivasta-aineiden läsnäoloa testinäytteessä.

  Jos on positiivinen reaktio kaikilla ID-DiaCell-paneelin punasoluilla on suositeltavaa suorittaa autokontrolli autovasta-aineiden sulkemiseksi pois testinäytteestä.

  Jos reaktio pysyy negatiivisena yhden tai useamman ID-DiaCell-paneelin RBC:n kanssa, vasta-aineiden spesifisyys voidaan määrittää käyttämällä kaikkien ID-DiaCell-pakkausten mukana toimitettua antigeenista profilointilehteä. Kun teet tämän, varmista, että ID-DiaCell1-paneelin ja mukana tulevan arkin numerot täsmäävät.

  Jos tämä paneeli ei salli vasta-ainespesifisyyden määrittämistä, on suositeltavaa jatkaa tunnistusta käyttämällä ID-DiaPanel- ja/tai ID-DiaPanel P kehittynyttä punasolupaneelia (alun perin käytetystä menetelmästä riippuen).

Vasta-aineiden seulonta ja tunnistaminen

Vasta-aineseulonta suoritetaan sekä neutraalissa geelissä että geelissä, joka sisältää antiglobuliinireagenssia (taulukko 18.15-18.16 [näytä] ). Ensimmäisessä tapauksessa tutkimukseen käytetään entsyymikäsiteltyjä punasoluja, toisessa tapauksessa punasolujen suspensiota matalan ionivahvuuden liuoksessa. Vasta-aineiden seulonta ja tunnistaminen suoritetaan käyttämällä standardia punasolujen paneelia. Arvioitaessa geelitestin tehokkuutta vasta-aineiden seulonnassa ja tunnistamisessa, sen herkkyys havaittiin perinteisiin menetelmiin verrattuna.

Menetelmät punasoluantigeenien vasta-aineiden tutkimiseksi

• Antiglobuliinitesti (epäsuora Coombsin testi) [näytä] .

  Epäsuoraa antiglobuliinitestiä (NAT) käytetään punasolujen vastaisten vasta-aineiden havaitsemiseen. Tyypillisesti NAT suoritetaan kahdessa vaiheessa:

  1. erytrosyyttien ja seerumin inkubointi (vasta-aineiden kiinnitys), jota seuraa pesu sitoutumattomien globuliinien poistamiseksi; epäsuoran antiglobuliinitestin asettaminen geelitestissä ei vaadi punasolujen pesua!
  2. pestyjen punasolujen inkubointi anti-ihmisglobuliinilla (AHG). Agglutinaatio osoittaa, että seerumissa on vasta-aineita, jotka ovat sitoutuneet erytrosyyttiantigeeneihin in vitro.

  NAT:ia käytetään:

  1. luovuttajan punasolujen vasta-aineiden määrittäminen vastaanottajan seerumista - asetettaessa yhteensopivuustestiä;
  2. kun seulotaan "odottamattomia" erytrosyyttivasta-aineita;
  3. erytrosyyttien vastaisten vasta-aineiden tutkimuksessa raskaana olevilla naisilla;
  4. autoimmuunista hemolyyttistä anemiaa sairastavien potilaiden seerumin vasta-aineiden tutkimuksessa.

  Määritelmän edistyminen:

  • lisää 50 µl tyypitettyjen erytrosyyttien suspensiota kolmeen vasemmalla olevan ID-kortin koeputkeen;
  • lisää 25 µl testiseerumia koeputkiin;
  • sentrifugoi henkilökortit 10 minuuttia;
  • arvioida tutkimuksen tulosta. Kirjoita tulos henkilökorttiin.

  Määritelmätulokset:

  • positiivinen tulos osoittaa immuuni- (allo)-vasta-aineiden läsnäolon testiseerumissa tai plasmassa (vasta-aineiden spesifisyyden määrittämiseksi käytä standardierytrosyyttien liitteenä olevaa taulukkoa);
  • negatiivinen tulos osoittaa immuunivasta-aineiden puuttumisen testiseerumissa tai plasmassa.
• entsymaattinen menetelmä [näytä] .

  Käsittely proteolyyttisillä entsyymeillä lisää punasolujen agglutinaatiokykyä.

  Määritelmän edistyminen:

  • lisää 50 µl standardityyppisten erytrosyyttien suspensiota oikealla olevan henkilökortin kolmeen putkeen;
  • lisää 25 µl laimennusliuosta 1 putkiin;
  • lisää 25 µl testiseerumia koeputkiin.

  Huomautus: Laimennusliuosta 1 ei lisätä, jos testaukseen käytetään proteolyyttisellä entsyymillä esikäsiteltyjä standardinmukaisia ​​erytrosyyttejä (esim. DiaMedin ID-DiaCell I-II-III P).

  • inkuboi 15 minuuttia +37 °C:ssa;
  • sentrifugoi ID-kortteja W-sentrifugissa 10 minuuttia (parametrit asetetaan automaattisesti);
  • syötä tulos henkilökorttiin.

  Tutkimustulokset:

  • positiivinen tulos osoittaa allovasta-aineiden läsnäolon testiseerumissa tai plasmassa (vasta-aineiden spesifisyyden määrittämiseksi käytä standardierytrosyyttien liitteenä olevaa taulukkoa);
  • negatiivinen tulos osoittaa allovasta-aineiden puuttumisen testiseerumissa tai plasmassa.
• Kylmäagglutinaatiomenetelmä [näytä] .

  Määritelmän edistyminen:

  • inkuboi laimennusliuosta 2, kirjoitettuja punasoluja ja henkilökortteja 30 minuuttia lämpötilassa 2-8 °C;
  • käsitellä tyypittyjä punasoluja laimennusliuoksella 2, jota varten:
    • merkitse koeputki;
    • valmista 0,8-prosenttinen suspensio tyypitetyistä punasoluista laimentimeen 2 laittamalla 1,0 ml laimennusainetta 2 ja 10 µl verta koeputkeen.

  Huomautus: Normaalit ID-DiaCell RBC:t (DiaMed) ovat käyttövalmiita, eikä niitä tarvitse laimentaa;

  • lisää 50 µl laimennusliuoksella 2 käsiteltyä tyypitettyjen erytrosyyttien suspensiota kolmeen oikealla olevan henkilökortin koeputkeen;
  • lisää 25 µl testiseerumia näihin putkiin;
  • inkuboi 30 minuuttia 2-8 C:n lämpötilassa;
  • sentrifugoi ID-kortteja ID-sentrifugissa 10 minuuttia (parametrit asetetaan automaattisesti);
  • arvioi tutkimuksen tulos;
  • syötä tulos henkilökorttiin. Tutkimustulokset:
  • positiivinen tulos osoittaa kylmien vasta-aineiden läsnäolon testiseerumissa tai plasmassa (vasta-aineiden spesifisyyden määrittämiseksi käytä standardierytrosyyttien liitteenä olevaa taulukkoa);
  • negatiivinen tulos osoittaa kylmien vasta-aineiden puuttumisen testiseerumissa tai plasmassa.

  Jos testiseerumissa on kylmiä tai lämpimiä autovasta-aineita, vääriä positiivisia tuloksia. Jos haluat sulkea ne pois, sinun on asetettava automaattinen ohjaus:

  • valmistaa 0,8-prosenttinen suspensio testiveren punasoluista laimennusliuokseen 2 lisäämällä 10 µl kokoverta 1,0 ml:aan laimennusliuosta 2;
  • lisää 50 µl valmistettua punasolususpensiota vasemmalla olevaan ID-kortin putkeen (Coombs-reaktiota varten) tai oikealla olevaan ID-korttiputkeen (entsyymimenetelmää ja kylmäagglutinaatiota varten);
  • lisää 25 µl testiseerumia ID-kortin koeputkiin (entsymaattista menetelmää varten on tarpeen lisätä putkiin vielä 25 µl laimennusliuosta 1);
  • inkuboi kortteja 15 minuuttia +37°C:ssa (Coombsin reaktiota ja entsymaattista menetelmää varten) tai 2-8°C:n lämpötilassa (kylmäagglutinaatioautokontrollissa).

  Positiivinen tulos autokontrollissa osoittaa autovasta-aineiden läsnäolon testiseerumissa.

Luovuttajan ja vastaanottajan veren yhteensopivuuden määrittäminen

Testin tarkoitus yksilöllinen yhteensopivuus Estää punasoluantigeenien kanssa yhteensopimattomien hemokomponenttien verensiirrot. Vastaanottajan seerumin testaus aiotun luovuttajan punasoluilla on eniten luotettava tapa sellaisten vasta-aineiden havaitseminen, jotka voivat aiheuttaa vaurioita verensiirtoon siirretyille punasoluille, verensiirron jälkeisiä reaktioita ja hemolyyttisiä komplikaatioita. Tämän testin avulla voit:

1. vahvistaa luovuttajan ja vastaanottajan ABO-yhteensopivuus;
2. havaita vastaanottajan seerumista luovuttajan erytrosyyttiantigeenejä vastaan ​​suunnattuja vasta-aineita.

Luovuttajan ja vastaanottajan veren yksilöllisen yhteensopivuuden testaus erytrosyyttiantigeenien perusteella (taulukko 18.17) [näytä] ) ei korvaa pakollista immunohematologista tutkimusta (ABO-, Rhesus-, Kell-järjestelmän erytrosyyttiantigeenien tyypitys, erytrosyyttivasta-aineiden havaitseminen, alloanti-erytrosyyttivasta-aineiden haku ja tunnistaminen), vaan vain täydentää sitä.

Koska herkistymistä voi esiintyä jopa erikseen valittujen hemokomponenttien verensiirron jälkeen, yhteensopivuuden testaamiseksi on tarpeen käyttää joka kerta tuoretta potilaan seerumia, joka on saatu hemokomponenttien viimeisen verensiirron jälkeen.

Jokaiselle luovuttajan verinäytteelle on tehtävä yhteensopivuustesti!

• Määritelmän edistyminen [näytä]
  • säilytä laimennusaine 2, kunnes se saavuttaa huoneenlämpötilan (20-24 °C);
  • merkitse henkilökortit ja koeputket (luovuttajan ja vastaanottajan koko nimi);
  • valmistaa 0,8 % suspensio luovuttajan ja vastaanottajan punasoluista laimennusliuokseen 2, jota varten lisää 1 ml laimennusliuosta 2 kahteen merkittyyn putkeen, lisää 10 µl luovuttajan ja vastaanottajan verta, vastaavasti;
  • sekoita;
  • poista suojakalvo vastaavasta henkilökortista;
  • lisää 50 µl valmistettua luovuttajan erytrosyyttisuspensiota henkilökorttien 1, 2, 3, 4, 5 mikroputkiin;
  • lisää 50 µl valmistettua vastaanottajan erytrosyyttisuspensiota henkilökorttien 4, 5, 6 mikroputkiin;
  • lisää 25 µl vastaanottajan seerumia tai plasmaa henkilökorttien 1, 2, 3, 6 mikroputkiin;
  • lisää 25 µl laimennusainetta 1 ID-kortin mikroputkeen 4 (entsyymitesti);
  • inkuboi 15 minuuttia +37°C:n lämpötilassa;
  • sentrifugi (sentrifugoinnin aika ja nopeus ovat vakioita ja asettuvat automaattisesti);
  • arvioida tutkimuksen tulosta. Yhteensopivuus antigeeneille A, B, D (1, 2, 3 mikroputkea):
  • selkeä positiivinen tai negatiivinen tulos osoittaa luovuttajan ja vastaanottajan veren punasolujen A, B, O antigeenien vastaavuuden;
  • Jos punasolujen kaksinkertainen populaatio havaitaan (positiivinen ja negatiivinen tulos yhdessä mikroputkessa), luovuttajan ja vastaanottajan A-, B-, D-antigeenit eivät ole identtisiä!
  • yhteensopivuuden määritys antigeeneille A, B, D on voimassa vain negatiivisen reaktion kanssa kuudennessa mikroputkessa (autokontrolli).
• Yhteensopivuustestitulokset (4, 5 mikroputkea) [näytä]
  • positiivinen tulos henkilökorttien 4, 5 mikroputkissa negatiivisella kontrollilla (mikroputki 6) osoittaa luovuttajan ja vastaanottajan veren yhteensopimattomuuden erytrosyyttiantigeenien suhteen;
  • negatiivinen tulos henkilökorttien 4, 5, 6 mikroputkissa osoittaa luovuttajan ja vastaanottajan veren yhteensopivuuden erytrosyyttiantigeenien suhteen;
  • positiivinen reaktio mikroputken ID-kortissa 6 (autokontrolli) edellyttää auto- ja allovasta-aineiden lisämäärityksiä vastaanottajan seerumissa (plasmassa).
• Rajoitukset [näytä]
  • varma lääkkeet voi aiheuttaa väärä positiivinen reaktio Coombs;
  • jonkun kanssa patologiset tilat potilailla voi olla positiivinen Coombsin reaktio;
  • käytetyn materiaalin bakteeri- tai muu kontaminaatio voi aiheuttaa väärän positiivisen tai väärän negatiivisen tuloksen;
  • testinäytteissä olevat fibriinijäämät voivat sitoa agglutinoitumattomia soluja ja muodostaa sentrifugoinnin jälkeen ohuen vaaleanpunaisen viivan geelin pinnalle, kun taas useimmat solut sijaitsevat mikroputken pohjalla;
  • liian väkevät punasolususpensiot voivat aiheuttaa vääriä positiivisia reaktioita.
• Varastointi ja käyttöolosuhteet [näytä]

  DiaMed ID-kortit tulee säilyttää huoneenlämmössä (+18-25°C) kuivassa paikassa koko säilyvyyden ajan.

  Kortit ovat voimassa 18 kuukautta. Reagenssien säilyvyysaika on 2 vuotta.

  Tutkimuksen tulokset kartalle tallennetaan ennallaan:

  • 48 tuntia huoneenlämmössä;
  • kolme viikkoa jääkaapissa (+2-8°C) henkilökortin yläosa sinetöity teipillä.

  Henkilökortin alakenttä voidaan irrottaa tai leikata ja käyttää asiakirjana sairaushistoriassa tai arkistokaappissa.

  Ei saa käyttää henkilökortteja, joissa on merkkejä geelin kuivumisesta, kuplia sen paksuudessa tai vaurioita suojakalvossa.

  Näytteet ja reagenssit on saatettava huoneenlämpöön ennen käyttöä.

Johtopäätös

Geelitesti on yksinkertainen, toistettava, nopea ja erittäin herkkä menetelmä, joka mahdollistaa punasoluantigeenien heikkojen varianttien välittömän havaitsemisen. Testi arvioidaan vain makroskooppisesti. Lyhyen koulutuksen jälkeen henkilöstöä tarvitaan oikea toteutus testaa, minimoi ajan ja virheet perinteisiä menetelmiä käytettäessä.

Geelitestin avulla voit standardoida laboratoriomenetelmiä ja antaa objektiivisen arvion hemagglutinaatioreaktion tuloksista. Testitulosten vakauden ansiosta voit tarkistaa saadut tiedot uudelleen, mikä on tarpeen valvonnan kannalta. Testitulokset voidaan valokopioida arkistointia tai opetustarkoituksiin vaikeasti diagnosoitavissa tapauksissa. Testissä käytetään pientä määrää seerumia tai punasoluja, mikä on erittäin tärkeää lastenklinikoilla.

Geelijärjestelmän käyttö vähentää henkilökunnan tartunnan riskiä myös mahdollisesti tartunnan saaneita näytteitä käsiteltäessä. Geelitestillä voidaan testata erytrosyyttiantigeenien yhteensopivuutta ennen verensiirtoa. Tätä varten käytetään epäsuoraa antiglobuliinitestiä ja yksivaiheista entsymaattista menetelmää.

Geelitesti suoritetaan ja arvioidaan yllä olevien sääntöjen mukaisesti. Punasolujen pesuvaiheiden puuttuminen suoritettaessa epäsuoraa antiglobuliinitestiä mahdollistaa tehokkaamman käytön työaika, ja myös testitulosten vakauden vuoksi valvoa kaikkia saatuja tuloksia.

Lähde: Lääketieteellinen laboratoriodiagnostiikka, ohjelmat ja algoritmit. Ed. prof. Karpishchenko A.I., Pietari, Intermedica, 2001