Skríning darcov. Imunohematologické laboratórne testy Antigény (Ag) erytrocytov

Celkom krvné bielkoviny 60-80 g/l. Existuje niekoľko proteínových frakcií, ktoré vykonávajú špecifické funkcie.

1. Albumíny (40-60 g/l) majú vysokú koloidno-osmotickú aktivitu.

2. Globulíny a, b, g (20-40 g/l) vytvárajú humorálna imunita, tvoriace rôzne protilátky nazývané imunoglobulíny (IgM, IgG).

3. Fibrinogén (2-4 g/l) je hlavným faktorom mechanizmu zrážania krvi.

ANTIGÉNY(grécky ànti - proti, genos - vytvárajú) - látky, ktoré majú schopnosť vyvolať tvorbu protilátok v organizme a reagovať s nimi. V membráne erytrocytov je zabudovaných množstvo špecifických polysacharidov - komplexov aminokyselín s antigénnymi vlastnosťami. Tieto komplexy sa nazývajú aglutinogény.

Doteraz bolo v ľudských erytrocytoch objavených viac ako 400 antigénov lokalizovaných v membráne erytrocytov, z ktorých 140 je kombinovaných do 20 geneticky riadených systémov. Zvyšné antigény sú bežné alebo individuálne. Pre klinickej praxi najdôležitejšie sú systém ABO a systém Rh (systém Rh). Rozlišujú sa aj skupiny Kell-Celano, Kidd, Lutheran, Duffy, Diego atď.. Posledné menované sú dôležité len pri častých krvných transfúziách alebo v tehotenstve inkompatibilných pre niektorý z týchto aglutinogénov. Preto sa neodporúčajú opakované krvné transfúzie od toho istého darcu.

Antigény červených krviniek sa objavujú v druhom mesiaci embryonálny vývoj avšak v čase narodenia dieťaťa je ich aglutinačná aktivita nízka a predstavuje 1/5 aktivity dospelých.

PROTILÁTKY- látky, ktoré reagujú s antigénom. Prirodzené protilátky sú vždy prítomné v krvnej plazme a patria do gamaglobulínovej frakcie. Patria sem protilátky systému ABO - a a b aglutiníny, ktoré sa u človeka objavujú v prvých mesiacoch po narodení a dosahujú maximálne množstvo do 5-10 rokov veku.

AGLUTINAČNÁ REAKCIA- zlepovanie a sedimentácia červených krviniek pod vplyvom špecifických protilátok - aglutinínov. Predpokladá sa, že molekula protilátky s dvoma väzbovými centrami tvorí most medzi dvoma červenými krvinkami. Každá z týchto červených krviniek zase komunikuje s inými červenými krvinkami a výsledkom je, že držia spolu. Pri transfúzii nekompatibilná krv aglutinácia vedie k hemolýze červených krviniek a uvoľneniu faktorov zrážanlivosti. Vzniknuté zrazeniny upchávajú malé cievy a tým narúšajú kapilárnu cirkuláciu.

K aglutinácii dochádza, keď sa stretnú aglutinogény s rovnakým názvom od darcu a aglutiníny od príjemcu.

Testy na kompatibilitu transfúznej krvi

Lekár vykonávajúci transfúziu krvi je povinný predchádzať možnej inkompatibilite s krvou pacienta vykonaním kontrolných štúdií vrátane testov kompatibility krvných skupín ABO a Rh faktora.

Testy kompatibility sa vykonávajú bezprostredne pred transfúziou. Na tento účel použite krvné sérum pacienta a darcovskú krv z liekovky pripravenej na transfúziu.

„Skupinové systémy ľudskej krvi a
komplikácie transfúzie krvi", M.A. Umnová

Krvné skupiny sa stanovujú pomocou aglutinačnej reakcie pri izbovej teplote na porcelánovej alebo inej bielej doske s navlhčeným povrchom. Existujú dva spôsoby stanovenia krvnej skupiny: pomocou štandardných sér, ktoré umožňujú určiť, ktorá skupina aglutinogénov (A alebo B) sa nachádza v červených krvinkách testovanej krvi; súčasne s použitím štandardných sér a štandardných erytrocytov (crossover metóda). V čom…

Do skúmavky sa dajú 2 kvapky séra pacienta, 1 kvapka krvi darcu a 1 kvapka 33% roztoku polyglucínu, špeciálne pripraveného na laboratórne účely. Skúmavka sa pretrepe, aby sa obsah premiešal, potom sa nakloní takmer do horizontálna poloha aby sa obsah rozlial po jej stenách a pomaly 5 minút otáčajte vertikálna os, uvedenie do kontaktu so zmesou séra pacienta...

Hemaglutinačná reakcia v každej kvapke môže byť pozitívna alebo negatívna. Ak je reakcia pozitívna, zvyčajne do 10 - 30 s od začiatku miešania, v zmesi sa objavia malé červené zrniečka (aglutináty) pozostávajúce z nalepených červených krviniek, viditeľné voľným okom. Malé aglutináty sa postupne spájajú do väčších, niekedy až do vločiek nepravidelný tvar. Zároveň je sérum úplne...

Krv darcu sa musí dvakrát premyť v skúmavke s 8 - 10-násobným objemom izotonický roztok chlorid sodný odstredením, potom ho odstráňte a sediment z premytých erytrocytov použite na výskum. Jedna malá (0,01 ml) kvapka premytých červených krviniek sa prenesie do inej skúmavky, pridajú sa 3 kvapky pacientovho séra, zmiešajú sa s červenými krvinkami darcu a skúmavka sa vloží do...

I. Pod vopred pripravenými označeniami sa na platňu aplikuje jedna veľká kvapka (0,1 ml) štandardného séra skupín 0αβ(I), Aβ(II) a Bα(III). Keďže sa používajú štandardné séra z dvoch rôznych sérií z každej skupiny, získa sa celkovo 6 kvapiek, ktoré tvoria dva rady po 3 kvapkách v nasledujúcom poradí zľava doprava: 0αβ(I), Aβ(II) a Bα(III ). II. Na konci záznamu...

Interpretácia výsledkov sa uskutočňuje vyhodnotením a porovnaním výsledkov získaných použitím štandardných sér (horné dva riadky) a použitím štandardných erytrocytov (spodný riadok). Výsledky reakcie získané použitím štandardných sér štandardných erytrocytov II sa musia zhodovať, t.j. indikovať obsah aglutinogénov a aglutinínov zodpovedajúcich rovnakej krvnej skupine. Tieto výsledky možno vyjadriť...

Na stanovenie stavu Rh, t. j. na zistenie prítomnosti alebo neprítomnosti antigénov systému Rh v krvi ľudí, sa používajú štandardné anti-Rh séra (reagenty), ktoré sa líšia špecifickosťou, t. j. obsahujú protilátky proti rôznym antigénom tohto systému. Na stanovenie Rh0(D) antigénu sa najčastejšie používa anti-Rhesus sérum s prídavkom 10% roztoku želatíny, alebo sa používa vopred pripravené štandardné anti-Rhesus činidlo...

I. Jedna kvapka (0,05 ml) testovaných červených krviniek a 2 kvapky 10 % roztoku želatíny, zahriate na skvapalnenie teplá voda(46 - 48 °C). II. V jednej z týchto skúmaviek pridajte 2 kvapky anti-Rh séra do zmesi červených krviniek a želatíny. Toto sérum sa nepridáva do inej skúmavky, slúži ako kontrola...

Rúry sa skúmajú voľným okom alebo cez lupu s 2-násobným zväčšením. Výsledok sa interpretuje v závislosti od prítomnosti alebo neprítomnosti aglutinácie červených krviniek. Ak je výsledok pozitívny, aglutináty sú ľahko rozlíšiteľné vo forme červených zŕn alebo vločiek na priehľadnom, takmer odfarbenom pozadí kvapaliny. Ak je výsledok negatívny, skúmavka ukazuje jednotnú farbu ružová farba, mierne opalizujúca kvapalina. Ukážky...

I. Do skúmavky sa nakvapká jedna kvapka (0,05 ml) testovanej krvi alebo erytrocytov (netreba zmývať konzervačný prostriedok), pridajte 1 - 2 kvapky štandardného univerzálneho anti-Rhesus činidla a erytrocyty premiešajte s činidlom pretrepaním skúmavky. II. Skúmavka sa nakloní takmer do vodorovnej polohy, aby sa obsah rozprestrel po jej stenách, a potom sa v tejto polohe pomaly otáča...

Výber darcov prebieha podľa jednotných medicínskych kritérií, čím je zabezpečená neškodnosť, vysoká aktivita a účinnosť krvi a jej zložiek.

Pred darovaním krvi sa každý darca podrobí vyšetreniu: odoberie sa anamnéza, vykoná sa dôkladné lekárske vyšetrenie a špeciálne vyšetrenie identifikovať kontraindikácie darovania krvi a vylúčiť možnosť prenosu patogénov infekčných chorôb krvou. Vykonávať sérologické, virologické a bakteriologické vyšetrenia darcovskej krvi.

Pokrok v klinickej transfuziológii znižuje riziko prenosu patogénov infekčných ochorení (infekcia HIV, hepatitída B a C, syfilis, cytomegalovírusová infekcia a pod.) krvou a jej zložkami.

Hlavné antigénne krvné systémy

Zistilo sa, že antigénna štruktúra ľudskej krvi je zložitá, všetky vytvorené prvky krvných a plazmatických bielkovín rôznych ľudí sa líšia v antigénoch. Je známych už asi 500 krvných antigénov, ktoré tvoria viac ako 40 rôznych antigénnych systémov.

Antigénny systém sa chápe ako súbor krvných antigénov dedených (riadených) alelickými génmi.

Všetky krvné antigény sú rozdelené na bunkové a plazmové. Bunkové antigény majú primárny význam v transfuziológii.

Bunkové antigény

Bunkové antigény sú komplexné sacharidovo-proteínové komplexy (glykopeptidy), štrukturálne zložky membrány krvných buniek. Z iných komponentov bunková membrána vyznačujú sa imunogenicitou a sérologickou aktivitou.

Imunogenicita - schopnosť antigénov vyvolať syntézu protilátok, ak sa dostanú do organizmu, ktorý tieto antigény nemá.

Sérologická aktivita - schopnosť antigénov spájať sa s protilátkami rovnakého mena.

Molekula bunkového antigénu pozostáva z dvoch zložiek:

Schlepper (proteínová časť antigénu umiestnená vo vnútorných vrstvách membrány), ktorá určuje imunogenicitu;

Haptén (polysacharidová časť antigénu umiestnená v povrchových vrstvách bunkovej membrány), ktorý určuje sérologickú aktivitu.

Na povrchu hapténu sa nachádzajú antigénne determinanty (epitopy) – molekuly sacharidov, na ktoré sa viažu protilátky. Známe krvné antigény sa navzájom líšia v epitopoch.

Napríklad haptény antigénov systému ABO majú nasledujúci súbor sacharidov: epitop antigénu 0 je fukóza, epitop antigénu A je N-acetylgalaktózamín a epitop antigénu B je galaktóza. Na ne sa viažu skupinové protilátky.

Existujú tri typy bunkových antigénov:

erytrocyt;

leukocytov;

Krvná doštička.

Antigény červených krviniek

Je známych viac ako 250 antigénov erytrocytov, ktoré tvoria viac ako 20 antigénnych systémov. Klinický význam má 11 systémov: AB0, Rhesus (Rh-Hr), MNS, Kell, Lutheran, Kidd, Diego, Duffy, Dombrock, enzýmové skupiny erytrocytov.

U ľudí sú v červených krvinkách súčasne prítomné antigény niekoľkých antigénnych systémov.

Antigénne systémy AB0 a Rhesus sú v transfuziológii uznávané ako hlavné. Iné antigénne systémy erytrocytov nemajú v súčasnosti v klinickej transfuziológii významný význam.

AB0 antigénny systém

Systém AB0 je hlavným sérologickým systémom, ktorý určuje kompatibilitu alebo inkompatibilitu transfúzovanej krvi. Pozostáva z dvoch geneticky podmienených aglutinogénov (antigény A a B) a dvoch aglutinínov (protilátky α a β).

Aglutinogény A a B sa nachádzajú v stróme erytrocytov a aglutiníny α a β sa nachádzajú v krvnom sére. Aglutinín α je protilátka proti aglutinogénu A a aglutinín β proti aglutinogénu B. V červených krvinkách a krvnom sére jednej osoby nemôžu byť aglutinogény a aglutiníny rovnakého mena. Keď sa stretnú antigény a protilátky s rovnakým názvom, dôjde k izohemaglutinačnej reakcii. Práve táto reakcia spôsobuje krvnú inkompatibilitu počas transfúzie krvi.

V závislosti od kombinácie antigénov A a B v erytrocytoch (a teda protilátok α a β v sére) sú všetci ľudia rozdelení do štyroch skupín.

Antigénny systém Rhesus

Rh faktor (Rh faktor), tak pomenovaný, pretože bol prvýkrát objavený u opíc rhesus, je prítomný u 85 % ľudí a chýba u 15 %.

V súčasnosti je známe, že systém Rhesus je pomerne zložitý a je reprezentovaný piatimi antigénmi. Úloha Rh faktora počas transfúzie krvi, ako aj počas tehotenstva, je mimoriadne dôležitá. Chyby vedúce k rozvoju konfliktu Rh spôsobujú ťažké komplikácie a niekedy aj smrť pacienta.

Menšie antigénne systémy

Systémy menších skupín erytrocytov sú reprezentované veľkým počtom antigénov. Znalosť tejto rozmanitosti systémov je dôležitá pre riešenie niektorých problémov v antropológii, forenznom výskume, ako aj pre prevenciu vzniku potransfúznych komplikácií a niektorých ochorení u novorodencov.

systém MNSs zahŕňa faktory M, N, S, s. Bola dokázaná prítomnosť dvoch tesne spojených génových lokusov, MN a Ss. Následne boli identifikované ďalšie rôzne varianty antigénov systému MNS. Podľa chemickej štruktúry sú MNS glykoproteíny.

Systém R. Antigénny systém P má určitý klinický význam. Vyskytli sa prípady skorého a neskorého potratu spôsobeného izoprotilátkami anti-R. Bolo popísaných niekoľko prípadov potransfúznych komplikácií spojených s inkompatibilitou darcu a príjemcu podľa P antigénneho systému.

Kell systém reprezentované tromi pármi antigénov. Najväčšiu imunogénnu aktivitu majú antigény Kell (K) a Cellano (k). Antigény Kellovho systému môžu spôsobiť senzibilizáciu organizmu počas tehotenstva a pri transfúzii krvi, spôsobiť komplikácie transfúzie krvi a rozvoj hemolytickej choroby novorodenca.

luteránsky systém. Jeden z darcov, menom Luterán, mal vo svojich červených krvinkách nejaký predtým neznámy antigén, čo viedlo k imunizácii príjemcu. Antigén bol označený písmenami Lu a. O niekoľko rokov neskôr bol objavený druhý antigén tohto systému, Lu b. Ich frekvencia: Lu a - 0,1 %, Lu b - 99,9 %. Anti-Lub protilátky sú izoimunitné, čo potvrdzujú správy o význame týchto protilátok pri vzniku hemolytickej choroby novorodencov. Klinický význam antigénov luteránskeho systému je malý.

Kidd systém. Antigény a protilátky systému Kidd majú určité praktický význam. Môžu spôsobiť rozvoj hemolytickej choroby novorodencov a potransfúzne komplikácie pri viacerých krvných transfúziách, ktoré nie sú kompatibilné s antigénmi tohto systému. Frekvencia antigénov je asi 75 %.

Diegov systém. V roku 1953 sa vo Venezuele v rodine Diegovi narodilo dieťa s príznakmi hemolytickej choroby. Pri určovaní príčiny tohto ochorenia bol u dieťaťa objavený dovtedy neznámy antigén, označený ako Diego faktor (Di). V roku 1955 výskum odhalil, že antigén Diego je rasový znak charakteristický pre národy mongoloidnej rasy.

Duffyho systém pozostáva z dvoch hlavných antigénov – Fy a a Fy b. Anti-Fy a protilátky sú nekompletné protilátky, svoj účinok prejavujú len v nepriamom antiglobulínovom Coombsovom teste. Neskôr boli objavené antigény Fy x, Fy 3, Fy 4, Fy 5. Frekvencia závisí od rasy osoby, ktorá má veľký význam pre antropológov. V černošských populáciách je frekvencia faktora Fy a 25%, medzi čínskou populáciou, Eskimákmi a austrálskymi domorodcami - takmer 100%, medzi belochmi - 60-82%.

Systém Dombrok. V roku 1973 boli identifikované antigény Do a a Do b. Faktor Do a sa nachádza v 55-60% prípadov a faktor Dob - v 85-90%. Táto frekvencia radí tento sérologický krvný systém na piate miesto z hľadiska informačného obsahu z hľadiska forenzného určenia otcovstva (systém Rhesus, MNS, AB0 a Duffy).

Enzýmové skupiny erytrocytov. Od roku 1963 je známy značný počet geneticky polymorfných enzýmových systémov ľudských erytrocytov. Tieto objavy zohrali významnú úlohu vo vývoji všeobecnej sérológie ľudských krvných skupín, ako aj v aspekte forenzného skúmania sporného otcovstva. Enzýmové systémy erytrocytov zahŕňajú fosfát glukomutázu, adenozín deaminázu, glutamát-pyruvát transaminázu, esterázu-D atď.

V súčasnej fáze to bolo možné dokázať hemolytická choroba plod a novorodenec je typ aloimunitnej cytopénie spôsobenej imunizáciou matky fetálnymi krvinkami nesúcimi na svojich membránach antigény, ktoré u tehotnej ženy chýbajú. Tento proces môžu spôsobiť rôzne antigény umiestnené na membráne erytrocytov a iných krviniek (trombocytov, neutrofilov) plodu, ktoré vstupujú transplacentárne do krvného obehu matky a spôsobujú v nej tvorbu protilátok. Najčastejšie pozorovaná aloimunitná erytropénia je spôsobená inkompatibilitou krvi plodu a matky vzhľadom na antigény systému ABO a Rhesus.

Povaha anémie vyvíjajúcej sa u plodu (hemolytická, aplastická) závisí od antigénu alebo antigénov, ktoré ju spôsobujú. Navyše u plodov s erytropéniou rôzneho pôvodu, podobný klinické prejavy chorôb prístupných neinvazívnym a invazívnym metódam overovania.

Aloimunitná erytropénia, vrátane hemolytického ochorenia plodu/novorodenca (HDFN) je ochorenie charakterizované hemolýzou erytrocytov a/alebo inhibíciou krvotvorby pod vplyvom protilátok vytvorených v matke proti antigénom fetálnych erytrocytov, vzájomne prenikajúcich placentárnou bariérou, prejavujúce sa u plodu/novorodenca anémiou, nárastom blastických foriem červených krviniek a často bilirubínu v krvi.

Keďže rozdiely v krvi matky a plodu v erytrocytových antigénoch majú primárny význam v patogenéze ochorenia, je potrebné zvážiť ich imunohematologické charakteristiky.

V súčasnom štádiu vývoja imunohematológie je známych viac ako 250 antigénov erytrocytov, ktoré sú zvyčajne rozdelené do 29 geneticky nezávislých systémov. Každý systém je kódovaný jedným alebo viacerými génmi. Antigény červených krviniek sú proteíny (napríklad systém Rhesus), glykoproteíny alebo glykolipidy (systém ABO).

Od roku 1980 do súčasnosti Medzinárodná spoločnosť pre krvnú transfúziu (ISBT) pokračuje v práci na klasifikácii známych medicínska veda antigény erytrocytov. Podľa v súčasnosti používanej nomenklatúry sa všetky erytrocytové antigény delia na systémy, kolekcie a série.

Tabuľka 1 uvádza zoznam známych 29 erytrocytových antigénnych systémov, ktoré sú v nich spojené podľa princípu prítomnosti spoločných génov kódujúcich ich produkty. Antigénové systémy sú zvyčajne označené v poradí ich objavenia trojcifernými číslami vo vzostupnom poradí, počnúc 001. V rámci systému má každý antigén aj trojmiestne číslo. Každý antigén je teda zvyčajne označený šesťmiestnym číslom.

zbierky kombinujú antigény, ktoré sú biochemicky a sérologicky príbuzné na fenotypovej úrovni, ale nemajú spoločné gény kódujúce ich produkty, a preto nespĺňajú požiadavky na antigénne systémy.

Skombinujú sa antigény, pre ktoré gény, ktoré ich kódujú, ešte neboli študované séria z dvoch skupín – s nízkou a vysoká frekvencia výskyt.

Aloantigény červených krviniek konvenčne rozdelené na bežné antigény antigény priemerná frekvencia výskytu A zriedkavé antigény. Bežne sa vyskytujúce antigény sa nachádzajú takmer u všetkých ľudí, takže protilátky proti takýmto antigénom sa tvoria len zriedka. Ak je však potrebné vykonať transfúziu krvi u pacientov s protilátkami proti bežne sa vyskytujúcim antigénom, spravidla vznikajú ťažkosti pri výbere darcov. Ak je antigén bežný s frekvenciou menšou ako 1 %, potom je klasifikovaný ako zriedkavý antigén.

stôl 1

Antigénne systémy červených krviniek

U pacientov s izoimunizáciou na vzácne antigény vo väčšine prípadov vznikajú ťažkosti pri vykonávaní imunohematologického vyšetrenia na overenie protilátok, pretože tento proces vyžaduje dlhú a nákladnú štúdiu s veľkým počtom vzoriek a testovacích systémov.

Pretože klinicky zmysluplné formy hemolytická choroba je spôsobená najmä protilátkami vytvorenými na antigény systému Rhesus, mali by sme sa zamerať na klasifikácie navrhované pre antigény tohto systému. Existuje niekoľko takýchto klasifikácií. Jedným z nich je Wienerova klasifikácia Rh antigénov. Vychádza z predpokladu, že na chromozóme Rh je len jedno miesto, ktoré môže obsadiť jeden z ôsmich alelomorfných génov. Každý gén kóduje produkciu aglutinogénu, čo je komplex antigénov. Wienerovo označenie antigénov je zložité a v súčasnosti sa v imunohematológii veľmi nepoužíva. Je však zvyčajné označovať špecifickosť protilátok v imunoglobulíne anti-Rhesus - „Rho (D)“.

Odporúčané na použitie Výborom expertov WHO pre biologické štandardy Fischer-Reissova klasifikácia Rh antigénov. Vychádza z predpokladu, že na Rh chromozóme sú tri miesta pre tri gény. Okrem toho každý génový komplex pozostáva z troch antigénnych determinantov: D alebo jeho absencia - d, C alebo c, E alebo e v rôznych kombináciách.

Vo výskume v posledných rokoch Ukázalo sa, že existujú iba dva gény (RHD A RHCE), zodpovedný za produkciu erytrocytových antigénov systému Rh. Produkciu antigénu D teda riadi gén R.H.D. kým antigény C, c, E, e – genóm RHCE. V čom veľké množstvo antigénov, ktoré tvoria Rhesus systém (48 antigénov), sa vysvetľuje mutáciami v týchto dvoch génoch. Neexistujú žiadne údaje o prítomnosti antigénu d, pretože neexistuje žiadny gén zodpovedný za syntézu tohto antigénu.

Hemolytická choroba plodu a novorodenca môže byť spôsobená antigénmi iného systému Rhesus ako D, ako aj inými, takzvanými „nepravidelnými“ antigénmi iných systémov alebo kombináciou viacerých antigénov jedného systému. V tomto prípade sa na charakterizáciu aloimunitného procesu v literatúre najčastejšie používa termín „erytrocytová aloimunizácia“.

Práve aloimunizácia erytrocytových antigénov je hlavnou príčinou vzniku anemického syndrómu u plodu. Podľa amerického Centra pre kontrolu a prevenciu chorôb (rok) sa teda napriek realizovanému programu imunoprofylaxie vyskytuje Rh senzibilizácia v 6,7 prípadoch na 1000 živonarodených detí. Ak k týmto prípadom pripočítame rozvoj aloimunizácie pod vplyvom erytrocytových antigénov iných skupín (Kell, Kidd, Duffy), tak je v USA ročne registrovaných viac ako 30 000 plodov s rizikom vzniku aloimunitnej anémie. Bohužiaľ, takéto úplné štatistiky na Ruská federácia zatiaľ nie je k dispozícii z dôvodu nedostatočnej implementácie podrobného imunohematologického vyšetrenia rizikových pacientov.

Pre adekvátne posúdenie prítomnosti izoimunizácie je teda potrebné v prvom rade vyhľadať a identifikovať erytrocytové protilátky cirkulujúce v krvi tehotnej ženy.

Úloha erytrocytových antigénov pri výskyte hemolytickej choroby plodu a novorodenca je rôzna a je určená schopnosťou aloprotilátok vytvorených proti určitej triede antigénov ničiť erytrocyty alebo narúšať procesy ich tvorby u plodu. Proces tvorby imunitných protilátok proti antigénom červených krviniek plodu závisí od prítomnosti antigénu, ktorý u matky chýba, od jeho imunogenicity, ako aj od počtu červených krviniek plodu vstupujúcich do krvného obehu tehotnej ženy.

Protilátky proti antigénom erytrocytov (alloprotilátky) sú prirodzené (pravidelné) a imunitné (nepravidelné). V krvnom sére ľudí (okrem jedincov s krvnou skupinou AB) sú teda neustále prítomné vrodené prirodzené protilátky proti antigénom A a/alebo B systému ABO, pozostávajúce zo štyroch antigénov.

Ochorenie u plodu a následne u novorodenca je v 10–20 % prípadov spôsobené inkompatibilitou červených krviniek matky a plodu podľa ABO antigénneho systému. Okrem toho sa hemolytické ochorenie plodu/novorodenca rozvinie 40-krát častejšie u žien s krvnou skupinou 0 (I) a manželov s inou krvnou skupinou. Keď však dôjde k tomuto typu izoimunizácie ťažké formy Choroby u plodu a novorodenca sú pozorované len v ojedinelých prípadoch - 1:3000 pôrodov.

Gélová aglutinačná metóda na stanovenie antigénov erytrocytov a protilátok proti erytrocytom

Úvod

Gélovú technológiu v mikroskúmavkách (GTM) navrhol Y. Lapierre v roku 1989. Metóda je založená na aglutinácii červených krviniek v agarovom géli Sephadex umiestnenom v mikroskúmavkách. Typicky systém pozostáva z plastových kariet obsahujúcich mikroskúmavky naplnené gélom (patent DiaMed AG, Švajčiarsko). Imunohematologické štúdie založené na hemaglutinačnej reakcii sa zvyčajne uskutočňujú v systémoch s kvapalnou fázou.

Jeden z najviac dôležité podmienky Získanie správnych údajov pre aglutinačnú reakciu slúži na vyhodnotenie výsledku. Slabá odpoveď môže byť nesprávne interpretovaná, najmä neskúseným personálom. Falošne slabé alebo negatívne výsledky nepriameho antiglobulínového testu sa môžu vyskytnúť v dôsledku neutralizácie antiglobulínového činidla stopami séra v dôsledku nedostatočného premývania červených krviniek. Neadekvátne premiešanie červených krviniek a elúcia slabo fixovaných protilátok počas premývacieho procesu môže spôsobiť chyby pri vykonávaní nepriameho antiglobulínového testu.

Technika gélovej aglutinácie bola vyvinutá na štandardizáciu hemaglutinačných reakcií a získanie spoľahlivé výsledky. Gélová technológia zahŕňa oddelenie červených krviniek centrifugáciou, pričom neaglutinované červené krvinky prechádzajú cez gél a usadzujú sa na dne skúmaviek ( negatívny výsledok), zatiaľ čo aglutinované zostávajú na povrchu alebo v hrúbke gélu ( pozitívny výsledok). Gélová centrifugácia môže byť konečnou fázou akéhokoľvek sérologického testu založeného na hemaglutinačnej reakcii, s výnimkou metód, ktoré na vyhodnotenie výsledku vyžadujú disperziu.

Rozsah vykonávaných testov zahŕňa stanovenie fenotypu červených krviniek (vrátane slabých variantov antigénu), antiglobulínový test, skríning a identifikáciu protilátok, testy kompatibility a niekoľko ďalších.

Princíp gélového testu

Pufrovaný dextránový gél Sephadex TM G 100 superline môže byť buď neutrálny, alebo môže obsahovať špecifické antiséra alebo antiglobulínové činidlo na gélovej matrici. Na gél sa aplikujú červené krvinky alebo zmes červených krviniek a séra. Bunky sa vždy pridávajú pred sérami – na rozdiel od štandardných sérologických techník – aby testované séra neprišli do kontaktu s gélom, čo je obzvlášť dôležité pri vykonávaní antiglobulínového testu. Po inkubácii nasleduje centrifugácia v presne definovanom režime. Ak nie sú splnené podmienky odstreďovania (odstreďovanie nie je dostatočne dlhé alebo je príliš jemné), môžu sa vyskytnúť falošne pozitívne výsledky. Falošne negatívne výsledky sa môžu vyskytnúť aj vtedy, ak sú porušené (vynútené) podmienky odstreďovania. Použitie automatickej ID centrifúgy (DiaMed) tieto problémy eliminuje. Na testovanie sa zvyčajne používajú tri typy gélov:

1. neutrálne, neobsahujúce špecifické protilátky (používa sa na vyhľadávanie a identifikáciu protilátok pomocou soľných a enzymatických metód, studená fáza testovania kompatibility krvi darcu a príjemcu);
2. špecifické, obsahujúce protilátky (monoklonálne alebo polyklonálne) proti ľudským erytrocytovým antigénom (používajú sa na typizáciu erytrocytových antigénov systémov ABO, Rhesus, Kell atď.)
3. antiglobulín, obsahujúci protilátky (polyšpecifické alebo monošpecifické) proti ľudským imunoglobulínom a zložkám komplementového systému (používa sa na priamy a nepriamy antiglobulínový test (Coombsov test) pri hľadaní a identifikácii auto- a aloimunitných protilátok, test na kompatibilitu krvi darca a príjemca).

Pridá sa krv, ktorá sa má testovať vrchná časť mikroskúmaviek diagnostických kariet a pri centrifugácii sa aglutinované a neaglutinované erytrocyty oddeľujú nasledovne: neaglutinované erytrocyty majú veľkosť porovnateľnú s veľkosťou gélových častíc a voľne cez ne prechádzajú vplyvom odstredivej sily a vytvárajú kompaktnú červenú sediment na dne mikroskúmavky - negatívny výsledok; vďaka svojej veľkej veľkosti sa aglutinované červené krvinky zadržiavajú na povrchu gélu alebo v jeho hrúbke – pozitívny výsledok.

Fixná aglutinácia v géli uľahčuje vyhodnotenie výsledku reakcie a prítomnosť kontrolnej mikroskúmavky v diagnostickej karte potvrdzuje spoľahlivosť získaných údajov.

V závislosti od sily aglutinačnej reakcie v gélovom médiu sa akceptuje nasledujúce hodnotenie získaných výsledkov:

• silne pozitívne (++++) - vytvorené aglutináty erytrocytov zotrvávali na povrchu gélu;
• pozitívne (+++) - aglutináty sa nachádzajú v hornej tretine gélového stĺpca;
• slabo pozitívne (++) - aglutináty sú fixované v horných dvoch tretinách gélu;
• veľmi slabo pozitívne (+) - aglutináty sa nachádzajú v spodnej tretine gélu;
• negatívny (-) - červené krvinky tvoria kompaktný sediment na dne mikroskúmavky.

Vybavenie a činidlá

• ID karty na stanovenie antigénov erytrocytov a protilátok proti erytrocytom;
• ID centrifúga na odstreďovanie kariet;
• termostat pri +37°C;
• stojany na skúmavky a karty;
• skúmavky s objemom 5 a 10 ml;
• poloautomatické jednokanálové pipety (10, 25, 50 ul);
• gumené chirurgické rukavice;
• riediaci roztok 1 (roztok bromelaínu);
• riediaci roztok 2 (roztok s nízkou iónovou silou - LISS, RNIS);
• 0,9% roztok chloridu sodného;
• štandardné typizované ľudské červené krvinky na detekciu protilátok a krížovú reakciu.

Charakteristika identifikačných kariet

Identifikačné karty Dia-Med (ID karty) sú plastové karty so šiestimi zabudovanými mikrotrubičkami. Päť skúmaviek obsahuje zmes gélu a antiséra. Každá karta má šiestu kontrolnú skúmavku obsahujúcu neutrálny gél bez protilátok (ctl). Označenie skúmaviek v ID karte sa vykonáva podľa detekovateľných antigénov, napríklad: A-B-AB-D-CDE-ctl alebo C-c-E-e-K-ctl. Identifikačné karty na detekciu protilátok proti antigénom erytrocytov majú určité rozdiely, napríklad karty "Coombs / Enzyme Test": tri skúmavky umiestnené vľavo obsahujú gél obsahujúci protilátky proti ľudským globulínom (monošpecifické anti-IgD alebo polyšpecifické - na imunoglobulíny rôznych tried ) - Coombsova reakcia. Ďalšie tri skúmavky obsahujú iba neutrálny gél určený na detekciu protilátok proti antigénom červených krviniek vo fyziologickom prostredí.

Všeobecné pravidlá používania identifikačných kariet

1. Občianske preukazy skladujte na suchom mieste, chráňte pred svetlom, pri teplote 18-25°C. Dátum exspirácie je uvedený v pasovej časti každej karty a na obalových škatuliach.
2. Roztoky na prípravu suspenzií červených krviniek, ako aj štandardné séra a štandardné ID červené krvinky používané v jednotlivých štúdiách by sa mali skladovať na suchom mieste, chránené pred svetlom, pri teplote 2 – 8 °C. Dátum exspirácie je uvedený na štítku každej fľaštičky a škatuľke.
3. Aby nedošlo k prijatiu falošné výsledky pri výskume je zakázané používať akékoľvek reagencie a karty, ktorým uplynula doba použiteľnosti, ako aj tie, ktoré vyschli, obsahujú plynové bubliny alebo majú poškodené škrupiny.
4. Odber krvi sa realizuje modernými technikami flebotómie, vhodná je aj arteriálna, kapilárna a pupočníková (bez premývania) krv. Na výskum sú vhodné vzorky plnej krvi (odobraté do čistej suchej skúmavky), ako aj vzorky krvi odobraté s konzervačnými látkami a stabilizátormi.

Typizácia antigénov erytrocytov

ID karty DiaMed sú určené na súčasné stanovenie krvnej skupiny podľa systému ABO a Rh príslušnosti erytrocytov darcov a príjemcov (vrátane ich slabých variantov antigénov), ako aj na typizáciu iných erytrocytových antigénov. Identifikačné karty DiaMed možno použiť namiesto alebo súbežne s izohemaglutinačnými sérami, anti-D, anti-DCE reagenciami, anti-A, anti-B, anti-D a anti-D Super koliklonmi.

• [šou] .

  Počiatočná fáza sa vykonáva odlišne v závislosti od typu použitých ID kariet, ktoré obsahujú polyklonálne (pozri bod 1a nižšie) alebo monoklonálne (pozri bod 16) protilátky:

  1a) Pripravte suspenziu testovaných červených krviniek v roztoku na riedenie ICID kariet obsahujúcich polyklonálne protilátky), pre ktoré:

  • ponechajte riediaci roztok 1, kým nedosiahne izbovú teplotu;
  • pripravte 5 % suspenziu testovaných červených krviniek v riediacom roztoku 1 umiestnením 0,5 ml riediaceho roztoku 1 a 50 μl testovanej plnej krvi alebo 25 μl červených krviniek do skúmavky;
  • jemne premiešajte a inkubujte 10 minút pri izbovej teplote;
  • Použite najneskôr 15 minút po inkubácii.

  16) Pripravte suspenziu testovaných červených krviniek v riediacom roztoku 2 (ID karty obsahujúce monoklonálne protilátky), pre ktoré:

  • Dilučný roztok 2 uchovávajte, kým nedosiahne izbovú teplotu;
  • označte čisté skúmavky;
  • pripravte 5 % suspenziu testovaných červených krviniek v riediacom roztoku 2 umiestnením 0,5 ml riediaceho roztoku 1 a 50 μl testovanej plnej krvi alebo 25 μl červených krviniek do skúmavky.
• Ďalšie akcie [šou] .
  1. Označte identifikačnú kartu (N testovanej vzorky séra alebo celé meno pacienta).
  2. Odstráňte ochrannú fóliu z tubusov ID karty.
  3. Pridajte 10 μl testovaných červených krviniek pripravených v súlade s odsekom 1a alebo 50 μl testovaných červených krviniek pripravených v súlade s odsekom 16 do každej skúmavky na preukaz totožnosti.
  4. Nainštalujte ID karty do rotora ID centrifúgy (s povinným vyvážením s inými ID kartami, prípadne nepoužitými).
  5. ID karty odstredivky (čas a rýchlosť odstreďovania sú konštantné a nastavujú sa automaticky).
  6. Vyhodnoťte výsledok štúdie: Výsledok v kontrolnej mikroskúmavke – „ctl“ – by mal byť vždy negatívny. Pozitívna reakcia v „kontrole“ môže byť spôsobená prítomnosťou autoprotilátok a nešpecifických plazmatických proteínov. Ak je „kontrola“ pozitívna, stanovenie je nespoľahlivé; musí sa zopakovať po premytí vzorky červených krviniek raz 0,9 % roztokom chloridu sodného alebo riediacim roztokom 2.
  7. Výsledky stanovenia každého antigénu zapíšte do príslušného stĺpca preukazu totožnosti (do bieleho poľa pod každým antigénom).
  8. Identifikujte výsledok podľa nasledujúcej schémy (tabuľka 18.7-18.9)

  Tabuľka 18.7. Výsledky štúdia antigénov krvných skupín ABO a Rh v preukaze ABO/Rh
  Detegovateľné antigény					Záver
  A	IN	AB	D	CDE
  +	+	+	+	+	AB Rh+
  +	+	+	-	-	AB Rh-
  +	-	+	+	+	A Rh+
  +	-	+	-	-	A Rh-
  -	+	+	+	+	B Rh+
  -	+	+	-	-	V Rh-
  -	-	-	+	+	0 Rh+
  -	-	-	-	-	0 Rh-
  Poznámka: Špecifickosť testu je potvrdená negatívnym výsledkom v skúmavke s kontrolou ID karty.

  Tabuľka 18.8 Stanovenie erytrocytových antigénov systému ABO
  Krvná skupina
  	anti-A	anti-B	anti-AV
  0(1)	-	-	-
  A1(II)	++++	-	++++
  A2(II)	++++	-	++++
  A3(II)	++/+++	-	++/++++
  A x (II)*	-/++	-	+/++
  B(II)	-	++++	++++
  B3(III)	-	+/+++	+/+++
  B x (III)*	-	-/++	-/++
  A1B(IV)	++++	++++	++++
  A2B(IV)	+++/++++	++++	++++
  Poznámka: * - stanovenie veľmi slabých variantov antigénov A a B si vyžaduje ďalší výskum.

  Tabuľka 18.9 Stanovenie stavu Rh (D, CDE)
  Rhesus príslušnosť	Výsledky štúdie so sérami
  	Anti-D	Anti-CDE
  D-pozitívne	++++	++++
  D-negatívny	-	-
  D-negatívny, C	E-pozitívny*	-
  slabo pozitívny (D u)	od ± do +++	od +++ do ++++
  Poznámka: * - Pozitívna reakcia so sérom anti-CDE at negatívna reakcia s anti-D sérom indikuje prítomnosť antigénov C, E a vyžaduje ďalšiu typizáciu pomocou ID kariet: C-c-E-e-K-stl alebo C-C w -c-E-e-K

použité občianske preukazy

Pri určovaní krvných skupín a Rhesusovej príslušnosti sa používajú polyklonálne (tabuľka 18.10 [šou] ) a monoklonálne (tabuľka 18.11 [šou] ) činidlá. Najčastejšie využitie v praxi z dôvodu ekonomická realizovateľnosť nájsť monoklonálne séra.

Autor: moderná klasifikácia Jedinci s oslabeným variantom D antigénu, ktorí sú schopní produkovať anti-D protilátky, spadajú do siedmich kategórií. Najvyššiu frekvenciu výskytu a praktický význam má kategória VI, ktorej erytrocyty nesú len Z epitop antigénu D. Osoby kategórie VI (Rh-negatívni príjemcovia, ale Rh-pozitívni darcovia!) môžu produkovať protilátky proti nezmenenej D a parciálnej D všetkých ostatných kategórií. Na potvrdenie krvnej skupiny sa používajú rôzne identifikačné karty: D(IV -) - pre príjemcov, D(IV +) - pre darcov.

Stanovenie krvnej skupiny ABO a Rh príslušnosti sa vykonáva identifikáciou špecifických antigénov a protilátok (dvojitá alebo krížová reakcia) (tabuľka 18.12 [šou] ).

Na hĺbkové preskúmanie sa používajú iné mapy (tabuľky 18.13-18.14 [šou] ).

Detekcia protilátok proti erytrocytom

Princíp metódy

Testovacie séra a štandardné červené krvinky na detekciu protilátok sa pridajú do hornej časti mikroskúmaviek. Po inkubácii a odstredení zostávajú aglutinované červené krvinky v hornej časti skúmavky, pretože neprechádzajú cez gél v dôsledku veľká veľkosť aglutinuje (pozitívny výsledok). Pri absencii protilátok na testovanie antigénov erytrocytov sa netvoria aglutináty. Neaglutinované červené krvinky ľahko prejdú cez gél a usadia sa na dne skúmavky (negatívny výsledok). Charakter aglutinácie pri zisťovaní protilátok proti erytrocytom závisí od titra protilátok, ich aktivity a hodnotí sa od ++++ do +.

• Výskumný algoritmus [šou] .

  Pred testovaním sa musia typizované červené krvinky najskôr dvakrát umyť z konzervačnej látky 0,9% roztokom chloridu sodného a potom vykonať nasledujúce kroky:

  • zrieďovací roztok 2 ponechajte, kým sa nedosiahne izbová teplota;
  • označte rúrky;
  • pripravte 0,8 % suspenziu typizovaných erytrocytov v roztoku na riedenie 2, pričom do skúmavky vložte 1,0 ml roztoku na riedenie 2 a 10 μl krvi;
  • odstráňte ochrannú fóliu z občianskeho preukazu;
  • označte identifikačnú kartu (číslo skúmanej vzorky séra alebo celé meno pacienta);
  • pridajte 50 μl štandardných červených krviniek do mikroskúmaviek;
  • do každej mikroskúmavky pridajte 25 μl séra alebo plazmy testovanej vzorky;
  • inkubujte 15 minút pri teplote +37 °C;
  • odstreďte ID karty v ID odstredivke (čas a rýchlosť odstreďovania sú konštantné a nastavujú sa automaticky).

  Poznámka: Štandardné červené krvinky panelov ID-DiaCell I-II-III a ID-DiaCell I-Ii-III P od DiaMed sú pripravené na použitie bez predchádzajúceho premytia a ošetrenia riediacim roztokom 2.

• Interpretácia výsledkov [šou] .

  Pozitívna reakcia znamená prítomnosť imunitných protilátok v testovanej vzorke.

  Ak existuje pozitívna reakcia Pri všetkých červených krvinkách panelu ID-DiaCell sa odporúča vykonať automatickú kontrolu na vylúčenie autoprotilátok v testovanej vzorke.

  Ak reakcia zostane negatívna s jedným alebo viacerými typmi červených krviniek na paneli ID-DiaCell, špecifickosť protilátok možno stanoviť pomocou sprievodného listu – tabuľky profilov antigénov, ktorá je súčasťou všetkých balení ID-DiaCell. V tomto prípade sa musíte uistiť, že čísla panelu ID-DiaCell1 a priloženého hárku sa zhodujú.

  Ak tento panel nestanoví špecifickosť protilátky, odporúča sa pokračovať v identifikácii pomocou ID-DiaPanel a/alebo ID-DiaPanel P vylepšeného panelu červených krviniek (v závislosti od pôvodne použitej techniky).

Skríning a identifikácia protilátok

Skríning protilátok sa vykonáva v neutrálnom géli aj v géli obsahujúcom antiglobulínové činidlo (tabuľka 18.15-18.16 [šou] ). V prvom prípade sa na výskum používajú enzýmom ošetrené erytrocyty, v druhom sa používa suspenzia erytrocytov v roztoku s nízkou iónovou silou. Skríning a identifikácia protilátok sa vykonáva pomocou štandardného panelu červených krviniek. Pri hodnotení účinnosti gélového testu na skríning a identifikáciu protilátok bola zistená jeho vyššia citlivosť v porovnaní s tradičnými metódami.

Metódy štúdia protilátok proti antigénom erytrocytov

• Antiglobulínový test (nepriamy Coombsov test) [šou] .

  Nepriamy antiglobulínový test (IAT) sa používa na detekciu protilátok proti erytrocytom. NAT sa zvyčajne vykonáva v dvoch fázach:

  1. inkubácia erytrocytov a séra (fixácia protilátok) s následným premytím na odstránenie nenaviazaných globulínov; vykonanie nepriameho antiglobulínového testu v gélovom teste nevyžaduje umývanie červených krviniek!
  2. inkubácia premytých erytrocytov s anti-humánnym globulínom (ACG). Aglutinácia indikuje prítomnosť protilátok v sére, ktoré sa in vitro naviazali na antigény erytrocytov.

  NAT sa používa na:

  1. stanovenie protilátok proti erytrocytom darcu v sére príjemcu - pri vykonávaní testu kompatibility;
  2. pri skríningu na „neočakávané“ protilátky proti erytrocytom;
  3. pri štúdiu protilátok proti erytrocytom u tehotných žien;
  4. pri štúdiu protilátok v sére pacientov s autoimunitnou hemolytickou anémiou.

  Priebeh určovania:

  • pridajte 50 μl suspenzie typizovaných erytrocytov do troch skúmaviek na ID karty umiestnených vľavo;
  • do skúmaviek pridajte 25 μl testovacieho séra;
  • odstreďte identifikačné karty počas 10 minút;
  • zhodnotiť výsledok štúdie. Výsledok zapíšte do občianskeho preukazu.

  Výsledky determinácie:

  • pozitívny výsledok indikuje prítomnosť imunitných (allo) protilátok v testovanom sére alebo plazme (na určenie špecifickosti protilátok použite tabuľku pripojenú k štandardným červeným krvinkám);
  • negatívny výsledok indikuje neprítomnosť imunitných protilátok v testovanom sére alebo plazme.
• Enzýmová metóda [šou] .

  Liečba proteolytickými enzýmami zvyšuje aglutinovateľnosť erytrocytov.

  Priebeh určovania:

  • pridajte 50 μl suspenzie štandardných typizovaných erytrocytov do troch skúmaviek na ID karty umiestnených vpravo;
  • pridajte 25 μl riediaceho roztoku 1 do skúmaviek;
  • do skúmaviek pridajte 25 μl testovacieho séra.

  Poznámka: Riediaci roztok 1 sa nepridáva, ak sa na štúdiu používajú štandardné typizované červené krvinky vopred ošetrené proteolytickým enzýmom (napríklad ID-DiaCell I-II-III P od DiaMed).

  • inkubovať 15 minút pri +37 °C;
  • centrifugujte ID karty v Sh-centrifúge 10 minút (parametre sa nastavia automaticky);
  • zapíšte výsledok do občianskeho preukazu.

  Výsledky výskumu:

  • pozitívny výsledok indikuje prítomnosť aloprotilátok v testovanom sére alebo plazme (na určenie špecifickosti protilátok použite tabuľku pripojenú k štandardným červeným krvinkám);
  • negatívny výsledok indikuje neprítomnosť aloprotilátok v testovanom sére alebo plazme.
• Metóda studenej aglutinácie [šou] .

  Priebeh určovania:

  • inkubujte riediaci roztok 2, typizované červené krvinky a ID karty 30 minút pri teplote 2-8 °C;
  • liečte typizované červené krvinky riediacim roztokom 2, pre ktorý:
    • označte skúmavku;
    • pripravte 0,8 % suspenziu typizovaných erytrocytov v riediacom roztoku 2 umiestnením 1,0 ml riediaceho roztoku 2 a 10 µl krvi do skúmavky.

  Poznámka: Štandardné červené krvinky ID-DiaCell (od DiaMed) sú pripravené na použitie a nevyžadujú riedenie;

  • pridajte 50 μl suspenzie typizovaných erytrocytov ošetrených riediacim roztokom 2 do troch skúmaviek na ID karty umiestnených vpravo;
  • do týchto skúmaviek pridajte 25 μl testovacieho séra;
  • inkubovať 30 minút pri teplote 2-8 C;
  • centrifugujte ID karty v ID centrifúge 10 minút (parametre sa nastavia automaticky);
  • vyhodnotiť výsledok štúdie;
  • zapíšte výsledok do občianskeho preukazu. Výsledky výskumu:
  • pozitívny výsledok naznačuje prítomnosť studených protilátok v testovanom sére alebo plazme (na určenie špecifickosti protilátok použite tabuľku pripojenú k štandardným červeným krvinkám);
  • negatívny výsledok naznačuje neprítomnosť studených protilátok v testovanom sére alebo plazme.

  Ak sú v testovacom sére prítomné studené alebo teplé autoprotilátky, falošne pozitívne. Na ich vylúčenie je potrebné nainštalovať automatické ovládanie:

  • pripravte 0,8 % suspenziu červených krviniek testovanej krvi v riediacom roztoku 2, pričom do 1,0 ml riediaceho roztoku 2 pridajte 10 μl plnej krvi;
  • pridajte 50 μl pripravenej suspenzie erytrocytov do ID-karty umiestnenej vľavo (pre Coombsovu reakciu) alebo do ID-karty umiestnenej vpravo (pre enzymatickú metódu a studenú aglutináciu);
  • pridajte 25 μl testovacieho séra do skúmaviek s identifikačnými kartami (pre enzýmovú metódu je potrebné pridať do skúmaviek ďalších 25 μl riediaceho roztoku 1);
  • inkubujte karty 15 minút pri teplote +37°C (pre Coombsovu reakciu a enzymatickú metódu) alebo pri teplote 2-8°C (pre nastavenie autokontroly studenej aglutinácie).

  Pozitívny výsledok v autokontrole indikuje prítomnosť autoprotilátok v testovacom sére.

Stanovenie kompatibility krvi darcu a príjemcu

Účelom testu je individuálna kompatibilita je zabrániť transfúziám hemokomponentov, ktoré sú inkompatibilné s antigénmi erytrocytov. Testovanie séra príjemcu s červenými krvinkami zamýšľaného darcu je najviac spoľahlivým spôsobom identifikáciu protilátok, ktoré môžu spôsobiť poškodenie transfúznych červených krviniek, potransfúzne reakcie a hemolytické komplikácie. Vykonanie takéhoto testu vám umožní:

1. potvrdiť ABO kompatibilitu darcu a príjemcu;
2. identifikovať protilátky v sére príjemcu namierené proti antigénom erytrocytov darcu.

Testovanie individuálnej kompatibility krvi darcu a príjemcu pomocou erytrocytových antigénov (tabuľka 18.17 [šou] ) nenahrádza povinnú imunohematologickú štúdiu (typizácia erytrocytových antigénov systémov ABO, Rhesus, Kell, identifikácia antierytrocytových protilátok, vyhľadávanie a identifikácia aloantierytrocytových protilátok), ale ju iba dopĺňa.

Vzhľadom na to, že k senzibilizácii môže dôjsť aj po transfúziách individuálne vybraných hemokomponentov, na testovanie kompatibility je potrebné použiť vždy čerstvé sérum pacienta získané po poslednej transfúzii hemokomponentov.

Pre každú vzorku krvi darcu je potrebné vykonať test kompatibility!

• Pokrok v odhodlaní [šou]
  • uchovávajte riediaci roztok 2, kým sa nedosiahne izbová teplota (20-24°C);
  • označte identifikačné karty a skúmavky (celé meno darcu a príjemcu);
  • pripravte 0,8 % suspenziu erytrocytov darcu a príjemcu v riediacom roztoku 2, do ktorej pridajte 1 ml riediaceho roztoku 2 do dvoch označených skúmaviek, pridajte 10 μl krvi darcu a príjemcu;
  • zmiešať;
  • odstráňte ochrannú fóliu z príslušnej identifikačnej karty;
  • pridajte 50 μl pripravenej suspenzie darcovských erytrocytov do mikroskúmaviek ID-card 1, 2, 3, 4, 5;
  • pridajte 50 μl pripravenej suspenzie erytrocytov príjemcu do mikroskúmaviek ID-card 4, 5, 6;
  • pridajte 25 μl séra alebo plazmy príjemcu do mikroskúmaviek na ID kartu 1, 2, 3, 6;
  • pridajte 25 ul riediaceho roztoku 1 do mikroskúmavky 4 s ID-kartou (enzýmový test);
  • inkubovať 15 minút pri +37 °C;
  • odstredivka (čas a rýchlosť odstreďovania sú konštantné a nastavujú sa automaticky);
  • zhodnotiť výsledok štúdie. Kompatibilita pre antigény A, B, D (1, 2, 3 mikroskúmavky):
  • jasný pozitívny alebo negatívny výsledok indikuje zhodu antigénov A, B, O červených krviniek darcu a príjemcu;
  • ak je pozorovaná dvojitá populácia červených krviniek (v jednej mikroskúmavke je pozitívny a negatívny výsledok), antigény A, B, D u darcu a príjemcu nie sú totožné!
  • stanovenie kompatibility antigénmi A, B, D platí len pri negatívnej reakcii v 6. mikroskúmavke (autokontrola).
• Výsledky testu kompatibility (4, 5 mikroskúmaviek) [šou]
  • pozitívny výsledok v mikroskúmavkách ID-card 4, 5 s negatívnou kontrolou (mikroskúmavka 6) indikuje inkompatibilitu krvi darcu a príjemcu z hľadiska erytrocytových antigénov;
  • negatívny výsledok v mikroskúmavkách ID kariet 4, 5, 6 indikuje kompatibilitu krvi darcu a príjemcu s ohľadom na erytrocytové antigény;
  • pozitívna reakcia v mikroskúmavke ID karta 6 (autokontrola) vyžaduje ďalšie stanovenie auto- a aloprotilátok v sére (plazme) príjemcu.
• Obmedzenia [šou]
  • istý lieky môže spôsobiť falošne pozitívna reakcia Coombs;
  • s niektorými patologických stavov pacienti môžu zaznamenať pozitívnu Coombsovu reakciu;
  • bakteriálna alebo iná kontaminácia použitého materiálu môže spôsobiť falošne pozitívny alebo falošne negatívny výsledok;
  • zvyšky fibrínu v testovaných vzorkách môžu viazať neaglutinované bunky a po centrifugácii vytvoriť tenkú ružovú čiaru na povrchu gélu, pričom väčšina buniek bude lokalizovaná na dne mikroskúmavky;
  • suspenzie červených krviniek, ktoré sú nadmerne koncentrované, môžu spôsobiť falošne pozitívne reakcie.
• Podmienky skladovania a prevádzky [šou]

  ID karty DiaMed by sa mali uchovávať pri izbovej teplote (+18-25°C) na suchom mieste po celú dobu platnosti.

  Platnosť karty je 18 mesiacov. Čas použiteľnosti činidiel je 2 roky.

  Výsledky výskumu na mape sú uložené nezmenené:

  • 48 hodín pri teplote miestnosti;
  • tri týždne v chladničke (pri +2-8°C) s hornou časťou ID karty prelepenou lepiacou páskou.

  Spodné pole občianskeho preukazu je možné odlepiť alebo odrezať a použiť ako dokument v anamnéze alebo v kartotéke.

  Identifikačné karty so známkami vysychania gélu, bubliniek v jeho hrúbke alebo poškodenia ochrannej fólie by sa nemali používať.

  Vzorky a činidlá sa musia pred použitím zohriať na izbovú teplotu.

Záver

Gélový test je jednoduchá, reprodukovateľná, rýchla a veľmi citlivá metóda, ktorá umožňuje okamžitú detekciu slabých variantov antigénov červených krviniek. Test sa hodnotí iba makroskopicky. Po krátkom zaškolení personálu potrebného na správne prevedenie sa minimalizujú náklady na pracovný čas a chyby vyskytujúce sa pri používaní tradičných metód.

Gélový test vám umožňuje štandardizovať laboratórne techniky a poskytnúť objektívne hodnotenie výsledkov hemaglutinačnej reakcie. Stabilita výsledkov testov umožňuje dvakrát skontrolovať získané údaje, ktoré sú potrebné na kontrolu. Výsledky testov je možné kopírovať na archívne účely alebo na vzdelávacie účely v ťažko diagnostikovateľných prípadoch. Test využíva malé množstvo séra alebo červených krviniek, čo je pre pediatrické ambulancie mimoriadne dôležité.

Použitie gélového systému znižuje riziko kontaminácie personálu aj pri práci s potenciálne infikovanými vzorkami. Gélový test možno použiť na vykonanie testov kompatibility antigénov červených krviniek pred transfúziou krvi. Na tento účel sa používa nepriamy antiglobulínový test a jednokroková enzýmová metóda.

Gélový test sa vykonáva a vyhodnocuje podľa vyššie uvedených pravidiel. Neprítomnosť štádií umývania červených krviniek pri vykonávaní nepriameho antiglobulínového testu umožňuje efektívnejšie použitie pracovný čas, a tiež vďaka stabilite výsledkov testov kontrolovať všetky získané výsledky.

Zdroj: Lekárska laboratórna diagnostika programy a algoritmy. Ed. Prednášal prof. Karpishchenko A.I., Petrohrad, Intermedica, 2001