FS.3.2.0003.15 Human blodkoagulasjonsfaktor VIII. Koagulasjonsfaktor VIII

Nivået av blodkoagulasjonsfaktor VIII fra 0 til 1% forårsaker en ekstremt alvorlig form av sykdommen, fra 1 til 2% - alvorlig, fra 2 til 5% - moderat, over 5% - lett form, men med risiko for alvorlige og til og med dødelige blødninger under skader og kirurgiske inngrep.

Blant alle mulige manifestasjoner hemofili i første omgang er blødninger i store ledd i ekstremitetene (hofte, kne, ankel, skulder og albue), dype subkutane, intermuskulære og intramuskulære blødninger, rikelig og langvarig blødning ved skade vises blod i urinen. Andre blødninger observeres noe sjeldnere, inkludert så alvorlige og farlige som retroperitoneale blødninger, blødninger i bukorganene, gastrointestinale blødninger og intrakranielle blødninger (slag).

Med hemofili kan du ganske tydelig spore utviklingen av alle manifestasjoner av sykdommen når barnet vokser, og deretter den voksne. Ved fødselen, mer eller mindre omfattende blødninger under periosteum av hodeskallebenene, subkutane og intradermale blødninger, sen blødning fra navlestrengen. Noen ganger oppdages sykdommen med den første intramuskulære injeksjonen, som kan forårsake et stort, livstruende intermuskulært hematom. Tenner er ofte ledsaget av ikke særlig kraftige blødninger. I de første leveårene er det ofte blødninger fra munnslimhinnen forbundet med skade fra ulike skarpe gjenstander. Når et barn lærer å gå, blir fall og blåmerker ofte ledsaget av kraftige neseblod og blåmerker på hodet. Blødninger i bane, samt postorbitale hematomer, kan føre til tap av syn. Hos et barn som har begynt å krype, er blødninger i seteområdet typiske. Da kommer blødninger i de store leddene i lemmene i forgrunnen. De vises tidligere, jo mer alvorlig er hemofilien. De første blødningene disponerer for gjentatte blødninger i de samme leddene. Alle har det individuell person lider av hemofili, med spesiell utholdenhet og hyppighet av blødninger, påvirkes 1-3 ledd. De mest rammede leddene er knærne, etterfulgt av ankler, albuer og hofter. Blødninger i de små leddene i hender og føtter (mindre enn 1 % av alle lesjoner) og ledd mellom ryggvirvlene er relativt sjeldne. I hver person, avhengig av alder og alvorlighetsgrad av sykdommen, påvirkes fra 1-2 til 8-12 ledd.

Det er nødvendig å skille mellom akutt hemartrose (primær og tilbakevendende), kronisk hemorragisk-destruktiv osteoartrose (artropati) og sekundært immunrevmatoid syndrom som en komplikasjon av hovedprosessen.

Akutt hemartrose viser seg som plutselig opptreden(ofte etter en mindre skade) eller en kraftig økning i smerter i leddet. Leddet er ofte forstørret, huden over den er rød og varm å ta på. Etter den første transfusjonen av blodkomponenter svekkes smerten raskt (innen flere timer), og med samtidig fjerning av blod fra leddet forsvinner den nesten umiddelbart.

IV stadier av leddskade skilles. I stadium I, eller tidlig stadium, kan leddvolumet økes som følge av blødning. I den "kalde" perioden er leddets funksjon ikke svekket, men røntgenundersøkelse avslører karakteristiske tegn på lesjonen. I trinn II er det en progresjon av prosessen, som avsløres av data røntgenstråler. I stadium III øker leddet kraftig i størrelse, blir deformert, er ofte ujevnt og humpete å ta på, og uttalt sløsing av musklene i det berørte beinet bestemmes. Mobiliteten til de berørte leddene er mer eller mindre begrenset, noe som er forbundet både med skade på selve leddet og med endringer i muskler og sener. På dette stadiet utvikler det seg alvorlig osteoporose, og det oppstår lett brudd inne i leddene. I lårbenet noteres krater- eller tunnellignende ødeleggelse av beinsubstansen, typisk for hemofili. Patella er delvis ødelagt. De intraartikulære bruskene blir ødelagt, og bevegelige fragmenter av disse bruskene finnes i leddhulen. Ulike typer subluksasjoner og beinforskyvninger er mulig. I stadium IV er leddets funksjon nesten helt tapt. Brudd inne i leddene er mulig. Med alderen utvikler alvorlighetsgraden og forekomsten av skade på leddapparatet og blir mer alvorlig når hematomer oppstår rundt patologisk endrede ledd.

Sekundært revmatoid syndrom (Barkagan-Egorova syndrom) er en vanlig form for leddskade hos pasienter med hemofili. Dette syndromet ble først beskrevet i 1969. I mange tilfeller blir det oversett av leger, siden det oppstår på bakgrunn av eksisterende hemartrose og destruktive prosesser i leddene som er karakteristiske for hemofili. Sekundært revmatoid syndrom er ledsaget av en kronisk inflammatorisk prosess (ofte symmetrisk) i de små leddene i hender og føtter, som ikke tidligere var påvirket av blødninger. Deretter, ettersom prosessen skrider frem, gjennomgår disse leddene typisk deformasjon. I store ledd Sterke smerter vises med jevne mellomrom, og alvorlig morgenstivhet i leddene kan noteres. Uavhengig av utseendet til nye blødninger, utvikler den artikulære prosessen seg jevnt. I dette øyeblikket avslører en blodprøve utseendet eller kraftig økning i eksisterende laboratorietegn inflammatorisk prosess, inkludert immunologiske.

Hos de fleste med hemofili opptrer syndromet i alderen 10-14 år. I en alder av 20 når frekvensen 5,9%, og med 30 - opptil 13% av alle sykdomstilfellene. Med alderen utvikler utbredelsen og alvorlighetsgraden av alle leddlesjoner jevnt, noe som fører til funksjonshemming og tvinger bruk av krykker, rullestoler og andre enheter. Progresjonen av leddskade avhenger av hyppigheten av akutte blødninger, aktualiteten og fullstendigheten av behandlingen (tidlig transfusjon av blod og dets komponenter er svært viktig), kvaliteten på ortopedisk behandling, riktig søknad fysioterapi, fysioterapeutiske og balneologiske effekter, yrkesvalg og en rekke andre forhold. For tiden er alle disse spørsmålene ekstremt relevante, siden forventet levealder for hemofili har økt kraftig på grunn av suksessen med korrigerende behandling.

Omfattende og intense subkutane, intermuskulære, subfasciale og retroperitoneale hematomer er svært alvorlige og farlige. Gradvis økende kan de nå enorme størrelser, inneholde fra 0,5 til 3 liter blod eller mer, føre til utvikling av anemi, forårsake kompresjon og ødeleggelse av omkringliggende vev og karene som mater dem, nekrose. For eksempel ødelegger retroperitoneale hematomer ofte helt store områder bekkenben(diameteren på ødeleggelsessonen kan nå 15 cm eller mer), hematomer på bena og armene ødelegger rørbein og hælbenet. Død av beinvev fører til dannelse av blødninger under periosteum. Prosessen med slik beinødeleggelse på røntgenbilder blir ofte forvekslet med en svulstprosess. Ofte avsettes kalsiumsalter i hematomer, noe som noen ganger fører til dannelse av nye bein som kan lukke leddene og immobilisere dem fullstendig.

Mange hematomer, som legger press på nervestammer eller muskler, forårsaker lammelser, sensoriske forstyrrelser og raskt progressiv muskelatrofi. Spesielt farlig er omfattende blødninger i bløtvevet i den submandibulære regionen, nakke, svelg og svelg. Disse blødningene forårsaker innsnevring av de øvre luftveiene og kvelning.

Seriøst problem ved hemofili skaper de kraftige og vedvarende nyreblødninger, observert hos 14-30% av personer med denne blodsykdommen. Disse blødningene kan oppstå både spontant og i forbindelse med skader i korsryggen, samtidig pyelonefritt. I tillegg kan nyreblødning oppstå på grunn av økt utskillelse av kalsium i urinen på grunn av beinødeleggelse ved hemofili. Utseendet eller intensiveringen av slik blødning kan forenkles ved bruk av smertestillende midler (acetylsalisylsyre, etc.), massive blod- og plasmatransfusjoner, noe som fører til ytterligere skade på nyrene. Nyreblødning innledes ofte av langvarig utskillelse av blodpartikler i urinen, som kun kan påvises ved laboratorieundersøkelser.

Utseendet til blod i urinen er ofte ledsaget av alvorlige vannlatingsforstyrrelser, så vel som en endring i mengden urin som skilles ut (det kan være en økning eller reduksjon i dets daglige volum), angrep av nyrekolikk forårsaket av dannelse av blod koagulerer inn urin vei. Disse fenomenene er spesielt intense og uttalte under behandling, når den normale tilstanden til blodet midlertidig gjenopprettes. Opphør av blodutskillelse i urinen innledes ofte med nyrekolikk, og ofte et midlertidig fravær av urinutskillelse med utseendet på tegn på forgiftning av kroppen med giftige metabolske produkter.

Nyreblødninger oppstår med jevne mellomrom, som over årene kan føre til alvorlige dystrofisk-destruktive endringer i dette organet, sekundær infeksjon og død fra utvikling nyresvikt.

Gastrointestinal blødning ved hemofili kan de være spontane, men oftere er de forårsaket av inntak av acetylsalisylsyre (aspirin), butadion og andre legemidler. Den andre kilden til blødning er åpenbare eller skjulte sår i magen eller tolvfingertarmen, samt erosiv gastritt av ulik opprinnelse. Imidlertid observeres diffus kapillærblødning noen ganger uten noen destruktive endringer i slimhinnen. Disse blødningene kalles diapedetiske. Når de dukker opp, er tarmveggen mettet med blod over et stort område, noe som raskt fører til koma som følge av alvorlig anemi, besvimelse i tilknytning til skarp nedgang blodtrykk og døden. Mekanismen for utvikling av slik blødning er fortsatt uklar til i dag.

Blødninger i mageorganene imiterer ulike akutte kirurgiske sykdommer - akutt blindtarmbetennelse, tarmobstruksjon og så videre.

Blødninger i hodet og ryggmarg og deres membraner i hemofili er nesten alltid assosiert enten med skade eller med bruk av medikamenter som svekker funksjonen til blodplater, som er direkte involvert i blodpropp. Mellom skadeøyeblikket og utviklingen av blødning kan det være et lysintervall som varer fra 1 til 2 timer til et døgn.

Karakteristisk trekk hemofili er langvarig blødning under skader og operasjoner. Rissinger mye farligere enn lineære brudd. Blødning oppstår ofte ikke umiddelbart etter skade, men etter 1-5 timer.

Fjerning av mandler for hemofili er mye farligere enn abdominal kirurgi kirurgiske inngrep.

Fjerning av tenner, spesielt molarer, er ofte ledsaget av mange dager med blødning, ikke bare fra tannhylser, men også fra hematomer dannet på stedet for vevsinfiltrasjon med novokain, noe som fører til utvikling av anemi. Disse hematomene forårsaker ødeleggelse av kjeven. Ved hemofili fjernes tenner på grunn av virkningen av antihemofile legemidler under generell anestesi. Det er bedre å fjerne flere tenner samtidig.

Noen komplikasjoner i hemofili er forårsaket av blodtap, kompresjon og ødeleggelse av vev av hematomer, og infeksjon av hematomer. En stor gruppe komplikasjoner er også forbundet med immunforstyrrelser. Den farligste av dem er utseendet i blodet av store mengder immunhemmere ("blokkere") av blodkoagulasjonsfaktor VIII (eller IX), som transformerer hemofili til den såkalte hemmende formen, der hovedbehandlingsmetoden er transfusjonsterapi (transfusjon av blod eller dets komponenter) - mister nesten fullstendig effektiviteten. Dessuten forårsaker gjentatt administrering av antihemofile legemidler ofte en rask økning i mengden av inhibitor i blodet, som et resultat av at transfusjoner av blod og dets komponenter, som opprinnelig ga en viss effekt, snart blir ubrukelige. Frekvens av hemmende form for hemofili, ifølge data forskjellige forfattere, varierer fra 1 til 20 %, oftere fra 5 til 15 %. Ved hemmende former svekkes blodplatefunksjonen merkbart, blødninger i leddene og blodutskillelse i urinen blir hyppigere, og leddskadene er betydelig høyere.

Hovedmetoden for behandling og forebygging av blødninger og blødninger av ethvert sted og enhver opprinnelse i hemofili er intravenøs administrering av tilstrekkelige doser av blodprodukter som inneholder faktor VIII. Faktor VIII er variabel og praktisk talt ikke konservert i hermetisk blod, naturlig og tørket plasma. For erstatningsbehandling er kun direkte blodoverføringer fra donor og blodprodukter med bevart koagulasjonsfaktor VIII egnet. Direkte blodoverføringer fra en giver ty til bare når legen ikke har andre antihemofile legemidler. Det er en alvorlig feil å overføre blod fra moren, siden hun er en smitter av sykdommen, og nivået av faktor VIII i blodet er kraftig redusert. Med tanke på kort periode levetid for faktor VIII i mottakerens blod (ca. 6-8 timer), blodtransfusjoner, samt transfusjoner av antihemofilt plasma, bør gjentas minst 3 ganger daglig. Slike blod- og plasmatransfusjoner er uegnet for å stoppe massiv blødning og pålitelig dekke ulike kirurgiske inngrep.

Et likt volum antihemofilt plasma er omtrent 3-4 ganger mer effektivt enn ferskt hermetisk blod. En daglig dose på 30-50 ml/kg kroppsvekt av antihemofilt plasma gjør det mulig å opprettholde et 10-15 % nivå av faktor VIII i noen tid. Hovedfaren slik behandling er en overbelastning av blodsirkulasjonen med volum, noe som kan føre til utviklingen Lungeødem. Bruk av antihemofilt plasma i konsentrert form endrer ikke situasjonen, siden den høye konsentrasjonen av det injiserte proteinet forårsaker intensiv bevegelse av væske fra vevene inn i blodet, som et resultat av at volumet av sirkulerende blod øker på samme måte som med infusjon av plasma i normal fortynning. Konsentrert tørt antihemofilt plasma har bare fordelen at det inneholder mer konsentrert faktor VIII av blodkoagulering, og i et lite volum introduseres det raskere i blodet. Tørt antihemofilt plasma fortynnes med destillert vann før bruk. Behandling med antihemofilt plasma er ganske tilstrekkelig for å stoppe de fleste akutte blødninger i leddene (unntatt de mest alvorlige), samt for forebygging og behandling av mindre blødninger.

De mest pålitelige og effektive for hemofili er blodkoagulasjonsfaktor VIII-konsentrater. Den mest tilgjengelige av dem er kryopresipitat. Det er et proteinkonsentrat isolert fra plasma ved avkjøling (kryopresipitering) som inneholder tilstrekkelige mengder koagulasjonsfaktorer, men lite protein. Lavt innhold proteiner gjør at stoffet kan administreres i blodet i en svært store mengder og øke konsentrasjonen av faktor VIII til 100 % eller mer, uten frykt for sirkulasjonsoverbelastning og lungeødem. Kryopresipitat må lagres ved -20 °C, noe som gjør transporten vanskelig. Når det tines, mister stoffet raskt sin aktivitet. Tørr kryopresipitat og moderne konsentrater av blodkoagulasjonsfaktor VIII har ikke disse ulempene. De kan oppbevares i vanlig kjøleskap. Overdreven administrering av kryopresipitat er uønsket, siden det skaper en høy konsentrasjon av koagulasjonsfaktorer i blodet, som et resultat av at mikrosirkulasjonen i organer blir forstyrret og det er risiko for blodpropp og utvikling av disseminert intravaskulært koagulasjonssyndrom.

Alle antihemofile legemidler administreres intravenøst ​​kun i en strøm, i mest mulig konsentrert form og så raskt som mulig etter at de er rekonservert uten å blandes med andre løsninger for intravenøs administrering. En av hovedårsakene til feil erstatningsterapi består av drypp administrering av blodprodukter, som ikke fører til en økning i nivået av koagulasjonsfaktor VIII i plasma. Inntil blødningen har stoppet permanent, bør eventuelle bloderstatninger og blodprodukter som ikke inneholder antihemofile faktorer brukes, da dette fører til fortynning av faktor VIII og en reduksjon i konsentrasjonen i serumet.

Ved akutte blødninger i leddene er midlertidig (ikke mer enn 3-5 dager) immobilisering (immobilisering) av det berørte lemmet i fysiologisk stilling, oppvarming av det berørte leddet (komprimerer), men ikke avkjøling nødvendig. Tidlig fjerning blod som strømmer inn i leddet eliminerer ikke bare smerte umiddelbart, forhindrer ytterligere blodpropp i leddet, men reduserer også trusselen om utvikling og rask progresjon av slitasjegikt. For å forebygge og behandle sekundære inflammatoriske forandringer etter blodfjerning injiseres 40-60 mg hydrokortison i leddhulen. Vedlikeholdstransfusjonsterapi, som utføres i løpet av de første 3-6 dagene, forhindrer ytterligere blødning og lar deg starte fysioterapiøvelser tidlig, noe som bidrar til en raskere og mer fullstendig gjenoppretting av funksjonen til det berørte lemmet og forhindrer muskelatrofi. Det er bedre å utvikle bevegelser i det berørte leddet i etapper. I de første 5-7 dagene etter fjerning av bandasjen utføres aktive bevegelser både i det berørte leddet og i andre ledd i lemmen, noe som gradvis øker frekvensen og varigheten av øvelsene. Fra 6.-9. dag går de over til "belastningsøvelser", ved hjelp av sykkelergometre, pedalporter for armene og elastisk trekkraft. Fra den 11. til den 13. dagen, for å eliminere gjenværende stivhet og begrensninger på maksimal fleksjon eller ekstensjon, utføres passive belastningsøvelser med forsiktighet. Samtidig, fra 5-7. dag, er fysioterapeutisk behandling foreskrevet - hydrokortisonelektroforese, anodisk galvanisering.

For blødninger i bløtvev er behandling med antihemofile legemidler mer intensiv enn for blødninger i leddene. Hvis anemi utvikler seg, er intravenøse infusjoner av røde blodlegemer i tillegg foreskrevet. Hvis tegn på hematominfeksjon oppstår, foreskrives bredspektret antibiotika umiddelbart. Noen intramuskulære injeksjoner ved hemofili er de kontraindisert, da de kan forårsake omfattende hematomer og pseudotumorer. Penicillin og dets semisyntetiske analoger er også uønskede, siden de i store doser øker blødningen.

Tidlig og intensiv behandling med antihemofile legemidler bidrar til rask omvendt utvikling av hematomer. Påfølgende hematomer fjernes, hvis mulig, kirurgisk sammen med kapselen.

Ytre blødninger fra skadet hud, neseblødninger og blødninger fra sår i munnhulen stoppes både ved transfusjonsbehandling og ved lokal påvirkning – behandling av blødningsområdet med legemidler som fremmer blodpropp. I tillegg kan disse legemidlene også tas oralt. Trykkbandasjer eller suturer påføres sårene. Blødning etter tanntrekking stoppes på samme måte. Ved sletting tygge tenner litt mer intensiv transfusjonsbehandling utføres, og samtidig fjerning av flere tenner (3-5 eller flere) krever administrering av antihemofile medisiner de første 3 dagene.

Ved neseblod bør tett tamponade unngås, siden blødningen ofte gjenopptas etter fjerning av tamponger med enda større kraft. Rask stans av neseblod sikres vanligvis av antihemofile plasma og antihemofile medisiner og samtidig skylling av neseslimhinnen med løsninger som fremmer blodpropp.

Nyreblødning utgjør en alvorlig fare, der intravenøse infusjoner av antihemofilt plasma og kryopresipitat er ineffektive.

Gastrointestinal blødning stoppes med store doser koagulasjonsfaktorkonsentrater. Det bør huskes at mageblødning ofte provoseres ved å ta aspirin, brufen eller indometacin i forbindelse med leddsmerter, tannpine eller hodepine. Selv hos pasienter med hemofili enkeltdose aspirin kan forårsake mageblødning.

Ved forebygging og behandling av kronisk artrose og andre lesjoner i muskel- og skjelettsystemet er det nødvendig å inkludere ulike måter beskytter ledd og forhindrer lemskader. For å gjøre dette sys skumskjold inn i klær rundt knærne, anklene og albue ledd, unngå de idrettene som involverer hopping, fall og blåmerker (inkludert sykling og motorsykkelkjøring). Det er viktig å ha tidligst mulig full behandling akutte blødninger i ledd og muskler, intense året rundt fysioterapi. For dette formålet er det spesielle komplekser av atraumatiske øvelser i vann, på myke matter og lasteutstyr - sykkelergometre, manuelle porter. Klassene må begynne i førskolen eller ungdomsskolen. skolealder, dvs. før alvorlige lidelser i muskel- og skjelettsystemet utviklet seg. Kompleks terapi supplert med fysioterapi (strøm høy frekvens, elektroforese av glukokortikosteroider) og balneologiske behandlingsmetoder, primært gjørmeterapi, saltlake og radonbad. Ved hyppige og vedvarende tilbakevendende blødninger i samme ledd utføres strålebehandling og kirurgi.

I forebygging av blødninger er det viktig å minimere risikoen for skader og kutt fra tidlig barndom. Leker som lett kan knuses (inkludert metall og plast), samt ustabile og tunge gjenstander, er utelukket fra daglig bruk. Møbler skal ha avrundede kanter, utstikkende kanter skal pakkes med bomullsull eller skumgummi, og gulvet skal dekkes med et luveteppe. Det er å foretrekke for pasienter å kommunisere og leke med jenter fremfor med gutter. Viktig for pasienten riktig valg yrker og arbeidsplasser.

Forebygging av hemofili er ennå ikke utviklet. Bestemme kjønn på det ufødte barnet ved genetisk forskning celler hentet fra fostervann tillater rettidig avslutning av svangerskapet, men indikerer ikke om fosteret er bærer av hemofiligenet. Graviditeten opprettholdes hvis fosteret er mannlig, siden alle sønner av pasienter er født friske. Graviditeten avbrytes hvis fosteret er kvinne, siden alle døtre av hemofili er bærere av sykdommen.

Hos kvinner som er bærere av hemofili, som har 50 % sjanse for å føde et sykt barn (hvis fosteret er mann), eller som overfører hemofili (hvis fosteret er kvinne), overfører fødselen til bare jenter risiko for å ha hemofilipasienter i familien fra første generasjon til andre, samtidig som det øker det totale antallet sykdomssmittere.

Lavt hemoglobin. Kolelithiasis. Ingen angrep Ingen riktig foreskrevet behandling Jeg ber virkelig om hjelp. Jeg har kolelitiasis. Små småstein og ikke mye. Overfladisk gastritt. Ikke-lukking av cardia og galle refluks. Tidligere var det også Helicobacter ++. Jeg behandlet ham. Jeg er redd for å fjerne gallen fordi problemer med refluks vil forbli og spiserøret vil være etsende. I det siste har jeg blitt sløv. Kortpustethet og takykardi. Blodtrykket er 100/60 og pulsen er 95. Sprøtt hår og negler. Jeg tok blodprøver. Hemoglobin og serumjern og noen andre jernindikatorer er under normen. Jeg tar omez. Vi har ikke hatt konsultasjon med en hematolog ennå. Opptaket er enormt. Jeg vil virkelig forstå hva jeg skal gjøre og hvordan jeg skal behandle riktig. Hjelp meg vær så snill. Jeg har ikke styrken til å være i denne tilstanden. Nå vet jeg ikke hvilke undersøkelser jeg skal gjennomgå og behandling, den ene kan skade den andre. I følge ultralyden av bukhulen er alt normalt bortsett fra gallegangen. Asat- og alat-indikatorer ser ut til å være normale, selv om de kan være forhøyede. Hvordan kan jeg ha noe å starte fra?

Russisk navn

Latinske navn på stoffene: Blodkoagulasjonsfaktor VIII + von Willebrand faktor

Farmakologisk gruppe av stoffer Blodkoagulasjonsfaktor VIII + von Willebrand faktor

Typisk klinisk og farmakologisk artikkel 1

Karakteristisk. Faktor effektivitet koagulasjon VIII bestemmes på grunnlag av den internasjonale standarden for kraftfôr (FVIII:C), er effekten av von Willebrand faktor bestemt ut fra å bestemme effektiviteten av ristocetin kofaktor (VW:RK), basert på den internasjonale standarden for kraftfôr iht. med European Pharmacopoeia. Den spesifikke aktiviteten til legemidlet er ikke mindre enn 60 IE FVIII:C/mg og ikke mindre enn 53 IE VWF:PK/mg totalt protein. Antall enheter koagulasjonsfaktor VIII er uttrykt i IE, tilsvarende WHOs standarder for disse legemidlene. Aktivitet uttrykkes enten som en prosentandel (i forhold til normale plasmafaktornivåer) eller i internasjonale enheter (i forhold til den internasjonale standarden for plasmakoagulasjonsfaktor VIII). 1 IE koagulasjonsfaktor VIII tilsvarer mengden koagulasjonsfaktor VIII i 1 ml normalt humant plasma.

Farmasøytisk virkning. Blodkoagulasjonsfaktor VIII binder seg til von Willebrand-faktor; aktivert faktor VIII er en kofaktor for aktivert faktor IX, som akselererer overgangen av koagulasjonsfaktor X til aktiv form; aktivert faktor X aktiverer overgangen av protrombin til trombin, trombin aktiverer på sin side overgangen av fibrinogen til fibrin, etterfulgt av dannelsen av en blodpropp. Legemidlet inneholder von Willebrand-faktor, som er en normal komponent i humant plasma og virker på samme måte som endogent, og korrigerer hemostatiske lidelser hos pasienter med von Willebrands sykdom: gjenoppretter blodplateadhesjonen til det vaskulære subendotelet på stedet for karskade (fester seg til det vaskulære subendotelet og til blodplatemembranen, gir primær hemostase, reduserer koagulasjonstiden, mens effekten vises umiddelbart og avhenger av graden av proteinpolymerisering); normaliserer samtidig mangel på faktor VIII (når den administreres intravenøst, binder den endogen faktor VIII og stabiliserer den, bremser dens raske nedbrytning), gjenoppretter nivået av faktor VIII:C til normalt. Erstatningsbehandling med legemidlet hos pasienter med hemofili A øker innholdet av blodkoagulasjonsfaktor VIII, noe som gir en midlertidig korreksjon av faktormangel og reduserer risikoen for blødning. I tillegg fremmer von Willebrand-faktor blodplateadhesjon i området med vaskulær skade og spiller en rolle betydelig rolle under blodplateaggregering.

Farmakokinetikk. Von Willebrands sykdom type 3: gjennomsnittlig utvinning av VWF:RK og VWF:Ag er henholdsvis 68-99 %, noe som tilsvarer en gjennomsnittlig økning i plasmakonsentrasjoner på 1,5 og 2,1 % per erstattet IE/kg kroppsvekt. T1/2 FV:RK - 17,5 timer, klaring - 3,9 ml/t/kg. Hemofili A: faktor VIII:C-konsentrasjon er 80-120 % av forventet. T1/2 VIII:C - 14,8 timer, som tilsvarer biologisk T1/2, clearance - 2,9 ml/t/kg.

Indikasjoner. Behandling og forebygging av blødning hos pasienter med von Willebrands sykdom (med kvantitativ og/eller kvalitativ mangel på von Willebrand-faktor), medfødt hemofili A eller ervervet mangel på koagulasjonsfaktor VIII.

Kontraindikasjoner. Overfølsomhet, alder opp til 6 år (effektivitet og sikkerhet er ikke fastslått).

Forsiktig. Graviditet, ammingsperiode.

Dosering. IV, etter oppløsning med det medfølgende løsemidlet; den resulterende løsningen inneholder 90 IE blodkoagulasjonsfaktor VIII og 80 IE von Willebrand-faktor i 1 ml.

Von Willebrands sykdom: dose og varighet av erstatningsterapi avhenger av klinisk tilstand pasient, type og alvorlighetsgrad av blødning, FVIII:C og VWF:RK nivåer.

Forholdet mellom FVIII:S og VWF:RK er 1:1, i gjennomsnitt 1 IE/kg. FVIII:S og VWF:RK øker plasmanivåene med 1,5-2 % av den normale aktiviteten til det tilsvarende proteinet. Vanlig dose av legemidlet 20-50 IE/kg, noe som øker nivået av FVIII:C og VWF:RK til 30-100%. Startdosen kan økes til 50-80 IE/kg, spesielt hos pasienter med von Willebrands sykdom type 3 med gastrointestinal blødning.

For å forhindre blødning er det nødvendig å begynne å administrere stoffet 30 minutter før operasjonsstart. Ved planlagt operasjon administreres medikamentet 12-24 timer og 1 time før operasjonsstart, med forventet konsentrasjon på VWF:RK 60 IE/dL eller mer (60 % eller mer) og FVIII:C 50 IE /dL eller mer (50 % eller mer). Dosen administreres hver 12.-24. time Langtidsbehandling kan føre til en overdreven økning i FVIII:C-nivåer. Etter 24-48 timers behandling, for å unngå en overdreven økning i FVIII:C-nivåer, er det nødvendig å redusere dosen eller øke intervallet mellom dosene.

Hemofili A: 1 IE koagulasjonsfaktor VIII:C/kg øker faktoren i plasma med 1,5-2 % av det normale innholdet. Bestemmelse av nødvendig dose: kroppsvekt (kg) × ønsket økning i nivået av koagulasjonsfaktor VIII (%) × 0,5 IE/kg.

For blødningshendelsene beskrevet nedenfor, bør nivået av FVIII:C-aktivitet ikke falle under baseline plasmanivå (% av normale nivåer) i løpet av den aktuelle tidsperioden.

Moderat blødning (tidlig hemartrose, intramuskulær blødning, neseblødning, oral blødning og andre mindre skader) - den nødvendige konsentrasjonen av koagulasjonsfaktor VIII er 20-40 IE/dl (20-40%), administreringen gjentas hver 12.-24. i minst 1 dag, til smerten avtar eller kilden til blødning leges.

Mer omfattende blødning (imm blødning eller hematom) - nødvendig konsentrasjon av koagulasjonsfaktor VIII er 30-60 IE/dl (30-60%) hver 12.-24. time i 3-4 dager, inntil smertene avtar og arbeidsevnen avtar er gjenopprettet.

Livstruende blødning (intrakraniell, intraperitoneal, i nakken, stumpe traumer, uten en synlig kilde til blødning) - den nødvendige konsentrasjonen av koagulasjonsfaktor VIII er 60-100 IE/dl (60-100%) hver 8.-24. time, inntil trusselen helt forsvinner.

Mindre kirurgiske inngrep (inkludert tannekstraksjon) - nødvendig konsentrasjon av koagulasjonsfaktor VIII er 30-60 IE/dl (30-60%) hver 24. time, minst i 1 dag, frem til helbredelse.

Store kirurgiske prosedyrer - nødvendig nivå av faktor VIII (pre- og postoperativt) er 80-100 IE/dL (80-100%) hver 8.-24. time til tilstrekkelig sårheling, deretter minst 7 dager for å opprettholde faktor VIII-aktivitet på nivået 30-60%.

For langsiktig forebygging av blødning hos pasienter med alvorlig hemofili A, er det nødvendig å administrere 20-40 IE/kg hver 2.-3. dag. I noen tilfeller, spesielt hos unge pasienter, kan det være nødvendig å redusere intervallet mellom dosene eller øke dosen.

Hvis det ikke er effekt av en adekvat dose eller hvis det er umulig å oppnå ønsket konsentrasjon av koagulasjonsfaktor VIII i plasma med adekvat administrering, er det nødvendig å utføre Bethesda-testen for tilstedeværelse av hemmende antistoffer mot koagulasjonsfaktor VIII. Hos pasienter med høy level inhibitorer, kan behandling med koagulasjonsfaktor VIII være ineffektiv og kreve andre terapeutiske tiltak.

Bivirkning. Allergiske reaksjoner(urticaria, hudutslett, frysninger, følelse av innsnevring i brystet, kortpustethet, redusert blodtrykk, sjelden - anafylaktisk sjokk), svie på injeksjonsstedet, hypertermi, "hetetokter" hodepine, døsighet, apati, kvalme, oppkast, angst. Utvikling av hemmende antistoffer mot von Willebrand-faktor - ved von Willebrands sykdom, ved hemofili A - mot blodkoagulasjonsfaktor VIII (vanligvis IgG), noe som fører til en utilstrekkelig klinisk respons på stoffet; hemmende antistoffer kan forårsake nedbør og bidra til utvikling av anafylaktiske reaksjoner.

Hos pasienter som får von Willebrand faktorpreparater som inneholder koagulasjonsfaktor VIII, øker en langvarig økning i plasmanivåer av faktor VIII:C risikoen for trombose (overvåking av risikopasienter er nødvendig).

Hos pasienter med hemofili A kan det utvikles hemmende antistoffer, og en utilstrekkelig klinisk respons på stoffet er notert.

Interaksjon. Det skal ikke blandes med andre legemidler eller administreres samtidig med samme infusjonssett.

spesielle instruksjoner. Ved administrering av legemidlet må pasientens tilstand overvåkes nøye. Tidlige tegn på en overfølsomhetsreaksjon inkluderer urticaria, et generalisert utslett, tetthet i brystet, kortpustethet, redusert blodtrykk og anafylaksi. Hvis disse symptomene oppstår, bør du umiddelbart slutte å administrere stoffet. Hvis det oppstår anafylaktiske reaksjoner, bør pasienter undersøkes for tilstedeværelse av hemmende antistoffer.

Når du bruker legemidler hentet fra humant blod eller plasma, kan muligheten for overføring av smittsomme stoffer ikke utelukkes fullstendig, derfor anbefales det forebyggende vaksinasjon mot hepatitt A og B.

Langtidsbehandling av pasienter med von Willebrands sykdom med et legemiddel som inneholder von Willebrand faktor og koagulasjonsfaktor VIII kan forårsake en overdreven økning i koagulasjonsfaktor VIII:C, noe som øker risikoen for trombose (overvåking av koagulasjonsfaktor VIII:C konsentrasjoner er nødvendig ).

Risikoen for å utvikle hemmende antistoffer ved hemofili A når et maksimum i løpet av de første 20 dagene etter resept, sjeldnere etter de første 100 dagene med legemidlet. Muligheten for å bruke stoffet i nærvær av hemmende antistoffer mot koagulasjonsfaktor VIII er ikke fastslått.

For å administrere legemidlet bør du kun bruke settet for oppløsning og intravenøs administrering som følger med i settet. Andre enheter kan adsorbere blodkoagulasjonsfaktorer på deres indre overflate, noe som fører til en reduksjon i effektiviteten av behandlingen.

Studieinformasjon

Spesielle instruksjoner: Ikke utfør undersøkelser under akutte perioder sykdommer og mens du tar antikoagulantia (minst 30 dager må gå etter seponering). Biomateriale skal sendes inn for forskning på tom mage. Det må gå minst 8 timer mellom siste måltid og blodprøvetaking.

GENERELLE REGLER FOR FORBEREDELSE TIL FORSKNING:

1. For de fleste studier anbefales det å gi blod om morgenen, mellom klokken 8 og 11, på tom mage (det må gå minst 8 timer mellom siste måltid og blodprøvetaking, vann kan drikkes kl. normal modus), på tampen av studien, spis en lett middag med begrenset inntak av fet mat. For tester for infeksjoner og akuttstudier er det akseptabelt å gi blod 4-6 timer etter siste måltid.

2. MERK FØLGENDE! Spesielle forberedelsesregler for en rekke tester: strengt tatt på tom mage, etter en 12-14 timers faste, bør du donere blod for gastrin-17, lipidprofil (totalkolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol, VLDL-kolesterol, triglyserider, lipoprotein (a), apolipo-protene Al, apolipoprotein B); Glukosetoleransetesten utføres om morgenen på tom mage etter 12-16 timers faste.

3. På tampen av studien (innen 24 timer), unngå alkohol, intens fysisk aktivitet og å ta medisiner (i samråd med legen din).

4. 1-2 timer før du donerer blod, avstå fra å røyke, ikke drikk juice, te, kaffe, du kan drikke stillestående vann. Utelukke fysisk stress(løper, går raskt opp trapper), emosjonell spenning. Det anbefales å hvile og roe seg ned 15 minutter før du donerer blod.

5. Du bør ikke gi blod til laboratorietesting umiddelbart etter fysioterapeutiske prosedyrer, instrumentell undersøkelse, røntgen og ultralydforskning, massasje og andre medisinske prosedyrer.

6. Ved overvåking av laboratorieparametere over tid anbefales det å gjennomføre gjentatte tester under samme forhold - i samme laboratorium, donere blod til samme tid på dagen, etc.

7. Blod til forskning må gis før man begynner å ta medisiner eller tidligst 10–14 dager etter at de er seponert. For å vurdere kontrollen av effektiviteten av behandling med noen legemidler, bør en studie utføres 7-14 dager etter siste dose av legemidlet.

Hvis du tar medisiner, sørg for å varsle legen din.

GENERELL FARMAKOPOEIISK ARTIKKEL

Introdusert for første gang

Ekte farmakopémonografi gjelder metoder for å bestemme aktiviteten til humane blodkoagulasjonsfaktorer I, II, VII, VIII, IX, X, XI, von Willebrand-faktor, antitrombin III i plasma og blodprodukter.

GENERELLE BESTEMMELSER

Bestemmelse av aktiviteten til koagulasjonsfaktorer er basert på 2 tilnærminger:

1. Ett-trinns metode. Gjenoppretting av blodkoagulasjonsprosessen i faktormangel plasma etter tilsetning av et preparat av denne faktoren (koagulasjonsmetode).
2. To-trinns metode. På det første trinnet, ved å bruke en spesifikk kofaktor, aktiveres den proteolytiske aktiviteten til faktor II eller faktor X for å danne henholdsvis aktivert faktor IIa eller Xa. På det andre trinnet bestemmes mengden av den resulterende aktiverte faktoren av reaksjonen av dens spaltning av et spesifikt kromogent peptid (kromogent metode).

Det er mulig å utføre den kromogene metoden på 2 måter: i henhold til kinetikken til kromogendannelse under påvirkning av en aktivert faktor eller i henhold til sluttpunktet for kromogenakkumulering over en viss inkubasjonstid.

For å utføre begge metodene er det mulig å bruke plastrør, tabletter, optisk-mekaniske, mekaniske halvautomatiske og helautomatiske koagulometre.

I alle metodene gjøres aktivitetsberegningen ved å sammenligne aktiviteten til testprøven med aktiviteten til NIBSC International Standard eller en sekundær koakalibrert mot den internasjonale standarden i International Units of Activity (IU). Ekvivalensen til den internasjonale standarden i IU er etablert av WHO. Aktiviteten til koagulasjonsfaktoren i 1,0 ml friskt normalt blodplasma fra 300 givere tas som 1 IE (100%). Aktivitet kan uttrykkes i IE/ml, IE/hetteglass, IE/mg protein og som en prosentandel av mengden oppgitt av produsenten.

FAKTORER

FaktorJeg (fibrinogen)

Koagulasjonsmetode

Fibrinogenaktivitet bestemmes ved Clauss-metoden.

Prinsippet for metoden

Når trombin tilsettes til en prøve som inneholder fibrinogen, observeres fibrinkageldannelse. Ved bruk av trombin med høy aktivitet (~10 IE/ml) og prøver med lav fibrinogenkonsentrasjon (under 100 mg/dl), kan en lineær sammenheng oppnås.

For å bestemme fibrinogen, brukes kommersielle testsystemer som inneholder et trombinreagens som inneholder en heparininhibitor og en prøvefortynningsbuffer eller et kommersielt trombinreagens.

Fibrinogenkonsentrasjon er uttrykt i mg/dL. For å konstruere en kalibreringsgraf, bruk en standardprøve av fibrinogen eller en plasmakalibrator sertifisert i henhold til den internasjonale standarden. En standardprøve eller en kalibratorplasmaprøve løses i destillert vann i henhold til instruksjonene. Forbered 5 seriefortynninger av standardprøven, start ved en konsentrasjon på ~ 100 mg/dL, med prøvefortynningsbuffer pH = 7,3 ± 0,1. Analysen utføres ved en temperatur på 37°C i henhold til instruksjonene for settet. For hver fortynning bestemmes tidspunktet for koageldannelse tre ganger. Basert på de oppnådde resultatene, konstrueres en kalibreringsgraf over avhengigheten av koageldannelsestiden av fibrinogenkonsentrasjonen i logaritmiske koordinater.

Forbered 2 fortynninger av testprøven med en konsentrasjon under 100 mg/dl. For hver fortynning bestemmes koageldannelsestiden tre ganger. Mengden fibrinogen i hver fortynning bestemmes ved hjelp av en kalibreringsgraf.

FaktorII(trombin)

1. Koagulasjonsmetode

Bestemmelse av faktor II-aktivitet utføres ved å bruke humant plasma med mangel på faktor II som et substrat. Koagulasjonsprosessen aktiveres ved å tilsette tromboplastin til kalsiumblandingen.

For å fortynne standarden og medikamentene, bruk NaCl-imidazolbuffer pH 7,3 ± 0,1 med tilsetning av 0,1 % bovint eller humant albumin. For å konstruere en kalibreringskurve, klargjør du en serie seriefortynninger av faktor II-standarden i aktivitetsområdet fra 0,3 til 1 IE/ml. Legemidlet fortynnes til en konsentrasjon på mindre enn 1 IE/ml. Analyser 3 fortynninger av stoffet. For hver prøve utføres koagulasjonstidsmålinger minst 2 ganger. Målingen utføres innen 1 time etter fortynning av legemidlet.

Analysen utføres ved en temperatur på (37±0,5)°C. Tilsett 50 μl faktor II-mangel plasma og 50 μl av en fortynning av standarden eller stoffet i et plastrør. Blandingen inkuberes ved (37 ± 0,5) °C i 120 – 240 s. Koaguleringstiden bestemmes fra øyeblikket av tilsetning av 200 μl tromboplastinkalsium, forvarmet til en temperatur på (37 ± 0,5) °C, til blandingen. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagenser variere i passende proporsjoner.

Kalibreringsgrafen er plottet i semi-logaritmiske koordinater. Aktivitetsverdiene til faktor II er plottet langs den logaritmiske abscisseaksen, og koagulasjonstiden for de tilsvarende fortynningene av standarden er plottet langs ordinataksen. Aktiviteten til faktor II for hver fortynning av testprøven er funnet fra kalibreringsgrafen. FII-aktivitet ( EN

k

1. Kromogene metode

Metoden er basert på sammenligning av den enzymatiske aktiviteten til faktor IIa, dannet etter spesifikk aktivering av faktor II, i forhold til et spesifikt kromogent peptidsubstrat med samme aktivitet som en standardprøve (internasjonal eller lignende).

Faktor II aktiveres av aktivatoren ecarin, isolert fra hoggormgift. Aktivert faktor II (trombin) spalter selektivt det kromogene substratet (H-D-fenylalanin-L-pipecolyl-L-arginin-4-nitroanilid dihydroklorid, 4-toluensulfonylglycyl-prolyl-L-arginin-4-nitroanilid, H-D-cyclohexyl-amino- - L-arginin-4-nitroanilid, D-cykloheksylglycyl-L-alanyl-L-arginin-4-nitroanilid diacetat) for å danne P-nitroanilin. Reaksjonskinetikken studeres fotometrisk ved 405 nm. I dette tilfellet er den optiske tetthetsverdien proporsjonal med aktiviteten til faktor II.

Bestemmelse av faktor II ved den kromogene metoden utføres ved bruk av spesielle testsett. Analysen utføres i henhold til instruksjonene for settet. Standardprøven og preparatet er forhåndsfortynnet med faktor II-mangel plasma til en konsentrasjon på ~ 1 IE/ml (basisfortynning). Fra hovedfortynningen tilberedes 3 fortynninger av standardprøven og 3 fortynninger av medikamentet med Tris-saltvannbufferløsning pH 8,4. Hver fortynning av standardprøven bestemmes to ganger, og de resulterende verdiene brukes til å konstruere en kalibreringsgraf. Testprøvene bestemmes tre ganger.

Tester utføres manuelt ved hjelp av en mikroplate og et spektrofotometer som holder temperaturen i området (37±0,5)°C eller i automatisk modus ved bruk av et koagulometer.

For å utføre manuell testing tilsettes 25 μl av hver fortynning av testmedikamentet eller standardprøven til brønnene på mikroplaten. Tilsett 125 µl fortynningsbuffer og 25 µl ecarin til hver brønn og inkuber ved (37±0,5) °C i 2 minutter. Etter inkubasjonstiden tilsettes 25 μl kromogen faktor IIa-substrat til hver brønn.

EN/min).

Hvis kontinuerlig måling av absorbans ikke er mulig, bestemmer du absorbansen ved 405 nm med påfølgende tidsintervaller (f.eks. 40 s) og plotter absorbansen mot tiden og beregner ∆ ENEN

1. Test for fravær av trombin

For testing, klargjør en løsning av stoffet rekonstituert i samsvar med instruksjonene. Hvis heparin er tilstede i preparatet, nøytraliseres det ved å tilsette protaminsulfat med en hastighet på 10 μg protaminsulfat per 1 IE heparin.

Tilberedning av fibrinogenløsning

0,3 g fibrinogen løses i 100 ml, blandes og oppbevares i 15–20 minutter ved romtemperatur.

Løsningen har en holdbarhet på 1 måned ved en temperatur på 2 til 8°C.

Tilberedning av trombinløsning

Lyofilisatet løses opp i henhold til produsentens instruksjoner, oppbevares i 15–20 minutter ved romtemperatur og fortynnes med 0,9 % natriumkloridløsning til et trombininnhold på 1 IE/ml.

Løsningen har en holdbarhet på 6 måneder ved en temperatur på minus 20°C. Løsningen kan ikke fryses på nytt etter tining.

Fremgang av besluttsomhet

Like store volumer av det rekonstituerte medikamentet og fibrinogenløsningen tilsettes 2 reagensglass. Like store mengder trombinløsning og fibrinogenløsning tilsettes det tredje reagensglasset (kontrollprøven), og innholdet i rørene blandes med rotasjonsbevegelser. Det ene røret med det rekonstituerte medikamentet inkuberes i vannbad ved 37°C i 6 timer, det andre røret med det rekonstituerte medikamentet inkuberes ved romtemperatur i 24 timer Tilstedeværelsen eller fraværet av koagulasjon (propp) er notert.

Kontrollprøven inkuberes i et vannbad ved 37°C og tidspunktet for koageldannelse noteres.

Kriteriet for aksept av resultater er koagulering i kontrollprøven etter 30 s.

FaktorVII

1. Koagulasjonsmetode

Bestemmelse av faktor VII-aktivitet utføres ved bruk av humant plasma med mangel på faktor VII. Koagulasjonsprosessen aktiveres ved å tilsette tromboplastin til kalsiumblandingen.

For å fortynne standarden og medikamentene, bruk NaCl-imidazolbuffer pH 7,3 med tilsetning av en 0,1 % løsning av humant eller bovint albumin. For å konstruere en kalibreringskurve, klargjør du en serie seriefortynninger av faktor VII-prøvestandarden i området 0,3 til 1 IE/ml. Legemidlet fortynnes til en konsentrasjon på mindre enn 1 IE/ml. Analyser 3 fortynninger av stoffet. For hver prøve utføres koagulasjonstidsmålinger minst 2 ganger. Målingen utføres umiddelbart etter fortynning av stoffet.

Analysen utføres ved en temperatur på (37±0,5)°C. Tilsett 50 μl plasma med mangel på faktor VII og 50 μl av en fortynning av standarden eller stoffet i et plastrør. Blandingen inkuberes ved (37±0,5) °C i 120–240 s. Koaguleringstiden bestemmes fra det øyeblikket det tilsettes 200 μl tromboplastinkalsium, forvarmet til en temperatur på (37±0,5)°C, til blandingen. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagenser variere i passende proporsjoner.

Kalibreringsgrafen er plottet i semi-logaritmiske koordinater. Den logaritmiske abscisseaksen viser aktivitetsverdiene til faktor VII, og ordinataksen viser koagulasjonstiden til de tilsvarende standardfortynningene. Aktiviteten til faktor VII for hver fortynning av testprøven er funnet fra kalibreringsgrafen. FVII aktivitet ( EN) i testprøven beregnes ved hjelp av formelen:

- aktiviteten til den tilsvarende fortynningen av testprøven, funnet fra kalibreringsgrafen;

k— fortynning av prøven.

1. Kromogene metode

I nærvær av vevsfaktor (TF) og Ca 2+ -ioner aktiveres faktor VII (dannelse av FVIIa). Et kompleks av FVIIa, TF, Ca 2+ og fosfolipid aktiverer faktor X. Aktivert faktor X (FXa) spalter selektivt det kromogene substratet FXa-1 metoksykarbonyl-D-cykloheksylalanyl-glycyl-L-arginin- n-nitroanilidacetat dannes P-nitroanilin. Prøven undersøkes ved bruk av fotometrisk metode ved 405 nm. Absorbansverdien (eller økningen i absorbansen) er proporsjonal med mengden av faktor VII.

Bestemmelse av faktor VII ved den kromogene metoden utføres ved bruk av spesielle testsett. Analysen utføres i henhold til instruksjonene for settet. Standardprøven og preparatet er forhåndsfortynnet med plasma som mangler faktor VII til en konsentrasjon på ~ 1 IE/ml (basisfortynning). Fra hovedfortynningen fremstilles 3 fortynninger av standardprøven og 3 fortynninger av medikamentet med Tris-saltvannbuffer pH 7,3 - 8,0 ved å bruke en bufferløsning med tilsetning av 0,1 % humant eller bovint albumin. Hver fortynning av standardprøven bestemmes to ganger, og de resulterende verdiene brukes til å konstruere en kalibreringsgraf. Testprøvene bestemmes tre ganger.

Fortynninger av testmedikamentet eller en standardprøve tilsettes til brønnene på mikroplaten, en kalsium-tromboplastinblanding og faktor X-løsning tilsettes og inkuberes ved en temperatur på (37 ± 0,5) °C i 2 til 5 minutter, hvoretter en løsning av det kromogene faktor Xa-substratet tilsettes.

Mål endringen i optisk tetthet ved en bølgelengde på 405 nm enten i kinetisk modus, eller avbryt hydrolysereaksjonen etter 3-15 minutter ved å tilsette en 20 % (v/v) løsning av iseddik og mål den optiske tettheten.

FaktorVIII

1. Koagulasjonsmetode

Bestemmelse av faktor VIII-aktivitet utføres ved bruk av humant plasma med mangel på faktor VIII. Kilden til fosfolipider som er nødvendig for koagulering er APTT-reagenset.

For å fortynne standarden og medikamentene, bruk en NaCl-imidazol-bufferløsning pH (7,3 ± 0,1), med tilsetning av en 0,1 % løsning av humant eller bovint albumin. For å konstruere en kalibreringskurve, klargjør du en serie seriefortynninger av standarden, med utgangspunkt i en konsentrasjon på 2 IE/ml. Legemidlet fortynnes til en konsentrasjon på ~ 0,5 – 2 IE/ml. Analyser 3 fortynninger av stoffet. For hver prøve utføres koagulasjonstidsmålinger minst 2 ganger. Målingen utføres innen 1 time etter fortynning av legemidlet.

Analysen utføres ved en temperatur på (37±0,5)°C. Tilsett 100 µl plasma med mangel på faktor VIII, 100 µl standard- eller medikamentfortynning og 100 µl APTT-reagens i et plastrør og inkuber ved en temperatur på (37±0,5)°C i 2 minutter. Koagulasjonstiden registreres fra øyeblikket tilsetning av 100 μl 0,025 M kalsiumkloridløsning forvarmet til en temperatur på (37 ± 0,5) ° C til blandingen. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagenser variere i passende proporsjoner.

Kalibreringsgrafen er plottet i semi-logaritmiske koordinater. Verdiene av faktor VIII-aktivitet er plottet langs den logaritmiske abscisseaksen, og koagulasjonstiden for de tilsvarende fortynningene av standarden er plottet langs ordinataksen. Aktiviteten til faktor VIII for hver fortynning av testprøven er funnet fra kalibreringsgrafen. FVIII aktivitet ( EN) i testprøven beregnes ved hjelp av formelen:

— aktiviteten til den tilsvarende fortynningen av testmedikamentet, funnet fra kalibreringskurven;

k— fortynning av prøven.

1. Kromogene metode

Kvantitativ bestemmelse av faktor VIII utføres ved bruk av et sett med reagenser hvor faktor VIII er en kofaktor for faktor IXa under aktiveringen av faktor X til form Xa, som spalter det kromogene substratet.

Prinsippet for metoden

I nærvær av Ca 2+ ioner og fosfolipider aktiveres faktor X i Xa under påvirkning av faktor IXa. Med et overskudd av faktor X og optimale mengder Ca 2+, fosfolipider og faktor IXa, avhenger aktiveringshastigheten av faktor X lineært av mengden faktor VIII. Faktor Xa hydrolyserer det kromogene substratet S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) for å frigjøre den kromogene pNA-gruppen, hvis farge er registrert spektrofotometrisk ved 405 nm. Mengden av faktor Xa som produseres, og dermed intensiteten av farging, er proporsjonal med faktor VIII-aktiviteten i prøven.

Settet med reagenser for å bestemme aktiviteten til faktor VIII er stabilt i perioden spesifisert av produsenten ved en lagringstemperatur på 2 til 8 o C.

Reagenssettet inneholder:

1. 7,7 mg kromogen S-2765 med tillegg av syntetisk trombinhemmer I-2581. Reagenset rekonstitueres i 6,0 ml sterilt vann til injeksjon. Den rekonstituerte oppløsningen er stabil i 1 måned ved temperaturer fra 2 til 8°C. Før bruk, varm opp til 37°C.
2. Bovin faktorreagens: 0,3 U faktor IX, 2,7 IE faktor X og 1 NIH U trombin, frysetørket i nærvær av 40 mmol CaCl 2 og 0,2 mmol fosfolipider. Reagenset rekonstitueres i 2,0 ml sterilt vann til injeksjon. Den rekonstituerte oppløsningen er stabil i 12 timer ved temperaturer fra 2 til 8 o C, 2 uker ved en temperatur på minus 30 o C og 1 måned ved en temperatur på minus 80 o C. Den skal ikke oppbevares ved en temperatur på minus 20 °C. o C. Før bruk, varm opp til en temperatur på 37 ca. S.
3. Konsentrer × 10 Tris-buffer. Stabil i 1 måned ved temperaturer fra 2 til 8°C. Før bruk, fortynnes med sterilt vann til injeksjon i forholdet 1:10.

Ytterligere reagenser:

1. Den internasjonale referansestandarden er en human faktor VIII-konsentratløsning (NIBSC, Eur.Pharm.Ref.Std. BRP H 0920000) eller plasma kalibrert til den internasjonale faktor VIII-standarden.
2. Kontroller normalt eller patologisk plasma kalibrert til den internasjonale faktor VIII-standarden.
3. 0,9 % natriumkloridløsning.
4. 20 % eddiksyre eller 2 % sitronsyre (brukt i endepunktteknikken for kromogenakkumulering).
5. Laboratorievann avionisert

Utstyr:

1. Plast reagensrør;
2. Mikroplater;
3. Termostat 37 o C;
4. Spektrofotometer 405 nm eller mikroplateleser 405 nm;
5. Kalibrerte pipetter;
6. Vortex;
7. Stoppeklokke.

Før bestemmelse fortynnes testprøven til forventet aktivitet på 1 IE/ml.

Bestemmelse kan utføres i kinetisk modus og ved endepunkt, i reagensrør (makrometode) og i mikroplater (mikrometode).

Kalibrering

Under hver bestemmelse konstrueres en kalibreringskurve. Fortynningen av standardprøven tilberedes i 2 trinn: foreløpig fortynning til en aktivitet på 1 - 2 IE/ml og endelige fortynninger for å konstruere en kalibreringsavhengighet i området 0 - 2 IE/ml. Etter fortynning bør bestemmelsen utføres innen 30 minutter.

Fremgang av besluttsomhet

Bestemmelse i reagensglass

200 µl av en fortynnet standard-, kontroll- eller testprøve tilsettes reagensrør, inkubert i 3-4 minutter ved en temperatur på 37 o C, 50 µl forvarmet faktorreagens tilsettes, inkubert i 2-4 minutter ved en temperatur på 37 o C og 50 µl tilsettes kromogenløsning.

Bestemmelse i mikroplater

Tilsett 50 μl av en fortynnet standard-, kontroll- eller testprøve i mikroplatebrønnene, inkuber i 3-4 minutter ved 37 °C, tilsett 50 ul av forvarmet faktorreagens, inkuber i 2-4 minutter ved 37 o C og tilsett 50 µl av kromogenløsning.

Kinetisk metode for bestemmelse

Etter å ha tilsatt kromogenløsningen i 2-10 minutter, mål endringen i den optiske tettheten til løsningen ved 405 nm.

Definisjon etter endepunkt

Etter tilsetning av kromogenløsningen inkuberes blandingen videre ved en temperatur på 37 o C i 2 - 10 minutter, hvoretter 50 μl 20 % eddiksyre eller 2 % eddiksyre tilsettes for å stoppe reaksjonen. sitronsyre. Mål den optiske tettheten til løsningen mot bufferen ved 405 nm.

Beregninger

Plott avhengigheten av endringen i optisk tetthet per minutt (for den kinetiske metoden) eller optisk tetthet (for bestemmelse ved sluttpunkt) av fortynninger av standardløsningen på konsentrasjonen av faktor VIII i dem. Aktiviteten i testprøven bestemmes ved hjelp av en kalibreringskurve, tar hensyn til foreløpig fortynning av prøven.

FaktorIX

1. Koagulasjonsmetode

Bestemmelse av faktor IX-aktivitet utføres ved bruk av humant plasma med mangel på faktor IX. Kilden til fosfolipider som er nødvendig for koagulering er APTT-reagenset.

For å fortynne standarden og medikamentene, bruk NaCl-imidazolbuffer pH 7,3 med tilsetning av en 0,1 % løsning av bovint eller humant albumin. For å konstruere en kalibreringskurve, klargjør en serie seriefortynninger av standarden i området fra 0,3 til 1 IE/ml. Legemidlet fortynnes til en konsentrasjon på mindre enn 1 IE/ml. Analyser 3 fortynninger av stoffet. For hver prøve utføres koagulasjonstidsmålinger minst 2 ganger. Målingen utføres innen 1 time etter fortynning av legemidlet.

Analysen utføres ved en temperatur på (37±0,5)°C. Tilsett 100 µl plasma med mangel på faktor IX, 100 µl standard- eller medikamentfortynning og 100 µl APTT-reagens i et plastrør og inkuber ved en temperatur på (37±0,5)°C i 2 minutter. Koagulasjonstiden registreres fra det øyeblikket tilsetning av 100 μl 0,025 M kalsiumkloridløsning forvarmet til en temperatur på (37 ± 0,5) °C til blandingen. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagenser variere i passende proporsjoner.

Kalibreringsgrafen er plottet i semi-logaritmiske koordinater. Den logaritmiske abscisseaksen viser aktivitetsverdiene til faktor IX, og ordinataksen viser koagulasjonstiden til de tilsvarende standardfortynningene. Aktiviteten til faktor IX for hver fortynning av testprøven er funnet fra kalibreringsgrafen. Aktivitetskorrigering ( EN) i testprøven beregnes ved hjelp av formelen:

- aktiviteten til den tilsvarende fortynningen av testprøven, funnet fra kalibreringsgrafen;

k— fortynning av prøven.

FaktorX

1. Koagulasjonsmetode

Bestemmelse av faktor X-aktivitet utføres ved bruk av humant plasma med mangel på faktor X. Koagulasjonsprosessen aktiveres ved å tilsette tromboplastin til kalsiumblandingen.

For å fortynne standarden og medikamentene, bruk en NaCl-imidazolbufferløsning pH 7,3 med tilsetning av en 0,1 % løsning av humant eller bovint albumin. For å konstruere en kalibreringskurve, klargjør en serie seriefortynninger av faktor X-standarden i området fra 0,3 til 1 IE/ml. Legemidlet fortynnes til en konsentrasjon på mindre enn 1 IE/ml. Analyser 3 fortynninger av stoffet. For hver prøve utføres koagulasjonstidsmålinger minst 2 ganger. Målingen utføres umiddelbart etter fortynning av stoffet.

Analysen utføres ved en temperatur på (37±0,5)°C. Tilsett 50 μl plasma med faktor X-mangel og 50 μl av en fortynning av standarden eller stoffet i et plastrør. Blandingen inkuberes ved (37±0,5) °C i 120–240 s. Koaguleringstiden bestemmes fra det øyeblikket det tilsettes 200 μl tromboplastinkalsium, forvarmet til en temperatur på (37±0,5)°C, til blandingen. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagenser variere i passende proporsjoner.

Kalibreringsgrafen er plottet i semi-logaritmiske koordinater. Den logaritmiske abscisseaksen viser aktivitetsverdiene til faktor X , langs y-aksen er koaguleringstiden for de tilsvarende fortynningene av standarden. Faktor X-aktivitet for hver fortynning av testprøven er funnet fra kalibreringsgrafen. Faktor X-aktivitet ( EN) i testprøven beregnes ved hjelp av formelen:

- aktiviteten til den tilsvarende fortynningen av testprøven, funnet fra kalibreringsgrafen;

k— fortynning av prøven.

1. Kromogene metode

Faktor X aktiveres ved å bruke avledet fra slangegift FX aktivator. Aktivert faktor X (FXa) spalter selektivt det kromogene substratet FXa-1 N-α-benzyloksykarbonyl-D-arginyl-L-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid dihydroklorid, N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl - L-arginin-4-nitroanilidhydroklorid, metansulfonyl-D-leucyl-glycyl-L-arginin-4-nitroanilid, metoksykarbonyl-D-cykloheksylalanyl-glycyl-L-arginin-4-nitroanilidacetat for å danne P-nitroanilin. Prøver undersøkes fotometrisk ved 405 nm. Mengden av faktor X er proporsjonal med økningen i den optiske tettheten til løsningen.

Bestemmelse av faktor X ved den kromogene metoden utføres ved bruk av spesielle testsett. Analysen utføres i henhold til instruksjonene for settet. Standardprøven og preparatet er forhåndsfortynnet med faktor X-mangel plasma til en konsentrasjon på ~ 1 IE/ml (basisfortynning). Fra hovedfortynningen tilberedes 3 fortynninger av standardprøven (i henhold til instruksjonene) og 3 fortynninger av stoffet ved bruk av en bufferløsning. Hver fortynning av standardprøven bestemmes to ganger, og de resulterende verdiene brukes til å konstruere en kalibreringsgraf. Testprøvene bestemmes tre ganger.

Tester utføres manuelt ved bruk av plastrør eller mikroplater ved en temperatur på (37±0,5)°C eller automatisk ved bruk av et koagulometer.

For å utføre manuell testing tilsettes 12,5 μl av hver fortynning av testmedikamentet eller standardprøven til mikroplatebrønnene, 25 μl av en spesifikk faktor X-aktivator fra Russells huggormgift tilsettes hver brønn og inkuberes ved en temperatur på (37). ± 0,5) ° C i 90 s, hvoretter 150 μl av en arbeidsfortynning av det kromogene faktor X-substratet tilsettes til hver brønn.

Bestem endringshastigheten i optisk tetthet ved en bølgelengde på 405 nm kontinuerlig i 3 minutter og beregn den gjennomsnittlige endringshastigheten i optisk tetthet (∆ EN/min) eller mål absorbansen ved en bølgelengde på 405 nm med påfølgende tidsintervaller (for eksempel etter 30 s) og plott absorbansen mot tid og beregn ∆ EN/min som helningsvinkelen til en rett linje. Fra verdiene til ∆ EN/min av hver individuell fortynning av standardprøven og testmedikamentet, beregnes aktiviteten til testmedikamentet.

von Willebrand faktor

Bestemmelse av von Willebrand-faktoraktivitet utføres ved agglutinasjon eller enzymimmunanalyse.

Aktiviteten til von Willebrand-faktor bestemmes ved å sammenligne dens aktivitet med aktiviteten til en standardprøve.

Agglutinasjonsmetode

Metoden er basert på å bestemme koenzymaktiviteten til von Willebrand-faktor under agglutinering av en blodplatesuspensjon i nærvær av ristocetin A.

Testen kan utføres kvantitativt ved bruk av automatisert utstyr eller semikvantitativt ved visuelt å vurdere agglutinasjon i en serie fortynninger.

Semikvantitativ metode

Fra standardprøven og den rekonstituerte løsningen av medikamentet tilberedes suksessive fortynninger i 0,9 % natriumkloridløsning med 1–5 % human albuminløsning til forventet von Willebrand-faktorinnhold på 0,5, 1,0 og 2,0 IE/ml. 0,05 ml av hver fortynning av standardprøven og testmedikamentet påføres et glassglass, 0,1 ml blodplatesuspensjon med ristocetin tilsettes og blandes i 1 minutt. Fortynningsløsningen brukes som negativ kontroll. Etter 1 min inkubering ved romtemperatur vurderes blodplateagglutinasjonen visuelt. Den maksimale fortynningen ved hvilken blodplateagglutinasjon oppstår er ristocetin-koenzymaktivitetstiteren til prøven.

Kvantitativ metode

Forbered minst 2 serier med seriefortynninger av standarden og testprøver ved å bruke fortynningsbuffer til forventet VWF-innhold på 0,5, 1,0 og 2,0 IE/ml.

Bestemmelsen utføres i samsvar med instruksjonene fra produsenten av automatisert utstyr. Avhengigheten av endringen i optisk absorpsjon (graden av turbiditet av løsningen) på aktiviteten til von Willebrand-faktor oppnås.

Bestemmelse av innholdet av von Willebrand-faktor i testpreparatet utføres ved å bruke koeffisientene til den lineære ligningen for avhengigheten av den optiske tettheten til løsningen av innholdet av von Willebrand-faktoren i standardprøven.

Immunoenzym metode

Metoden er basert på å bestemme den kollagenbindende aktiviteten til von Willebrand faktor. Når VWF spesifikt binder seg til kollagenfibriller og den påfølgende bindingen av polyklonale antistoffer til VWF konjugert til enzymet etter tilsetning av et kromogent substrat, dannes en kromofor, som kan kvantifiseres spektrofotometrisk. Finnes lineær avhengighet mellom kollagenbinding til von Willebrand-faktor og optisk tetthet.

Bestemmelsen utføres ved bruk av testsystemer godkjent for bruk i russisk helsepraksis i henhold til bruksanvisningen.

For testing, klargjør minst 3 seriefortynninger av standarden og testprøver ved å bruke fortynningsbuffer til et forventet von Willebrand-faktorinnhold på 1,0 IE/ml. Deretter utføres tester i henhold til instruksjonene fra produsenten av testsystemet som brukes.

Aktiverte koagulasjonsfaktorer blod

Bestemmelsen utføres ved bruk av koagulometermetoden.

For testing tilberedes en rekonstituert løsning av stoffet. Hvis heparin er tilstede i preparatet, nøytraliseres det ved å tilsette protaminsulfat med en hastighet på 10 μg protaminsulfat per 1 IE heparin. Forbered fortynninger av medikamentet 1:10 og 1:100 ved å bruke Tris-bufret løsning pH 7,5.

0,1 ml standard human plasma og 0,1 ml fosfolipidløsning tilsettes 3 reagensglass, plassert i vannbad ved en temperatur på (37±0,5) °C i 60 s, hvoretter 0,1 ml tilsettes i det første reagensrøret. Tris-bufferløsning (kontrollprøve), inn i den andre - 0,1 ml av testmedikamentet i en fortynning på 1:10, i det tredje røret - 0,1 ml av testmedikamentet i en fortynning på 1:100. Deretter tilsettes umiddelbart 0,1 ml av en 3,7 g/l kalsiumkloridløsning oppvarmet til en temperatur på 37 o C til innholdet i hvert reagensglass. Tidspunktet for koageldannelse fra øyeblikket av tilsetning av kalsiumkloridløsningen noteres.

Kriteriet for godkjenning av resultater er koagulasjonstiden i kontrollprøven i området fra 200 til 350 s.

Spesifikk aktivitet

Den spesifikke aktiviteten til koagulasjonsfaktorer beregnes ved å bruke formelen:

Bestemmelse av antitrombinaktivitetIII

Kromogene metode

Metoden for å bestemme aktiviteten til ATIII er basert på dens evne til å nøytralisere trombin i nærvær av heparin. Overskytende mengder heparin og trombin tilsettes til prøven som inneholder ATIII. Det resulterende ATIII-heparinkomplekset nøytraliserer mengden av trombin proporsjonal med mengden av ATIII. Det gjenværende trombinet spalter selektivt det kromogene substratet for å dannes P-nitroanilin, hvis absorpsjon bestemmes ved 405 nm. Således er mengden av ATIII omvendt proporsjonal med mengden av fri absorpsjon P-nitroanilin i prøven.

Bestemmelse av ATIII-aktivitet utføres ved bruk av kommersielle testsystemer. For å konstruere en kalibreringskurve, bruk en ATIII standardprøve eller en plasmakalibrator sertifisert i henhold til en internasjonal standard. Standardprøven eller plasmakalibratoren løses i destillert vann i henhold til instruksjonene i instruksjonene. Avhengigheten av den optiske tettheten av ATIII-aktivitet er lineær i ATIII-aktivitetsområdet fra 0,1 til 1,0 IE/ml. Bruk en heparinbuffer, tilbered 4 fortynninger av en standardprøve eller kalibratorplasma med en ATIII-aktivitet på 0,1 til 1,0 IE/ml. Analysen utføres ved en temperatur på 37°C i henhold til skjemaet gitt i instruksjonene for settet. For hver fortynning bestemmes den optiske tetthetsverdien ved 405 nm tre ganger, og en kalibreringsgraf over avhengigheten av absorbansen til ATIII-aktivitet er konstruert i lineære koordinater.

Forbered 2 fortynninger av testprøven med en omtrentlig ATIII-aktivitet på mindre enn 1,0 IE/ml. Bestemmelse av ATIII-aktivitet i testprøver utføres ved en temperatur på 37°C i henhold til instruksjonene i instruksjonene for settet. ATIII-aktivitet i testfortynningene bestemmes fra kalibreringskurven. ATIII-aktivitet i testprøven bestemmes som:

A x– aktivitet av ATIII i passende fortynning;

k– prøvefortynning.

Kvantitativ bestemmelse av heparin

1. Koagulasjonsmetode

Metoden er basert på heparinets evne til å forlenge koagulasjonstiden til normalt plasma ved å hemme en rekke faktorer.

For å utføre analysen brukes normalt humant plasma, en standardprøve av heparin, et PTT-reagens og en 0,025 M kalsiumkloridløsning. En 0,9 % natriumkloridløsning brukes som fortynningsmiddel for standard- og testprøver. En standardprøve av heparin løses i destillert vann i henhold til instruksjonene i instruksjonene. Forbered 3 fortynninger av en standardprøve med heparinaktivitet på 0,3, 0,4 og 0,5 IE/ml. Standardprøver med disse aktivitetene bør forlenge koagulasjonstiden til normalt plasma med minst 1,5 ganger, ellers bør fortynninger med høyere heparinaktivitet brukes. Parallelt tilberedes 3 fortynninger av testprøven slik at den omtrentlige aktiviteten til heparin i disse fortynningene faller innenfor aktivitetsområdet til heparin i fortynninger av standardprøven.

Analysen utføres med et automatisk eller halvautomatisk koagulometer i plastrør ved en temperatur på 37°C. Tilsett 100 µl normalt humant plasma, 100 µl av en fortynning av en standard- eller testprøve eller 100 µl av en 0,9 % natriumkloridløsning (blankeksperiment) i et reagensrør, tilsett 100 µl av APTT-reagensen og inkuber blandingen for 120–240 s ved temperatur (37±0,1)°С. Deretter tilsettes 100 μl av en 0,025 M kalsiumkloridløsning forvarmet til en temperatur på 37°C til reagensrøret og koaguleringstiden til prøven registreres. Avhengig av analyseteknikken kan volumene av reagensene endres i samsvar med proporsjonene. Koaguleringstiden for normalt plasma (blindeksperiment) bør være 25 – 40 s. For hver fortynning av standard- og testprøver bestemmes koaguleringstiden tre ganger.

1. Kromogene metode

Metoden er basert på spaltning av et kromogent substrat spesifikt for aktivert faktor X (FXa). Når det legges til en prøve som inneholder heparin, overflødige mengder ATIII og FXa hemmer mengden av FXa proporsjonalt med mengden heparin. Den gjenværende FXa spaltes fra et spesifikt kromogent substrat P-nitroanilin, hvis absorpsjon bestemmes ved 405 nm. Dermed er mengden av absorpsjon omvendt proporsjonal med mengden heparin. Denne metoden bestemmer innholdet av både ufraksjonert og lavmolekylært heparin i anti-Xa-enheter.

Mengden av heparin bestemmes ved den kromogene metoden ved bruk av kommersielle testsystemer. For å konstruere en kalibreringsgraf, bruk en standard heparinprøve eller en plasmakalibrator sertifisert i henhold til en internasjonal standard. Standardprøven eller plasmakalibratoren fortynnes i destillert vann i henhold til instruksjonene. Forbered 4 fortynninger av en standardprøve med en heparinkonsentrasjon på mindre enn 1 anti-Xa-enhet/ml ved å bruke fortynningsbuffer pH 8,4. Analysen utføres ved en temperatur på 37°C i henhold til instruksjonene for settet. For hver fortynning bestemmes absorbansen ved 405 nm tre ganger, hvoretter en kalibreringsgraf av avhengigheten av absorbansverdien av heparinkonsentrasjonen er konstruert i lineære koordinater. Avhengigheten er lineær i heparinkonsentrasjonsområdet 0 – 1,0 anti-Xa enheter/ml.

For testprøven, klargjør 2 fortynninger med en heparinkonsentrasjon på mindre enn 1 anti-Xa-enhet/ml. Analysen utføres i henhold til instruksjonene for settet ved en temperatur på 37°C. For hver fortynning bestemmes absorpsjonsverdien tre ganger.

Bestemmelsen utføres manuelt ved bruk av plastrør, mikroplater eller automatisk ved bruk av koagulometer.

For å utføre manuell testing tilsettes 20 μl standard humant plasma og 20 μl antitrombin III-løsning til brønnene på mikroplaten. Deretter tilsettes 20, 60, 100 og 140 µl av test- eller standardmedisinen til disse brønnene, og volumet av løsningen i hver brønn justeres til 200 µl med buffer (heparinaktivitet i den endelige reaksjonsblandingen er 0,02 - 0,08 IE/ml).

40 μl fra hver brønn på platen overføres til den andre serien med brønner, hvori 20 μl bovin faktor Xa-løsning tilsettes og inkuberes ved en temperatur på (37 ± 0,5) °C i 30 s, hvoretter 40 μl av løsningen tilsettes til brønnfaktor Xa kromogent substrat og inkuberes igjen ved en temperatur på (37 ± 0,5) °C i 3 – 15 minutter, måler hastigheten på substratspaltning ved kontinuerlig å måle den optiske tettheten ved en bølgelengde på 405 nm (kinetisk). modus) eller etter å ha stoppet reaksjonen ved å tilsette 20 % (v/v) iseddiksyreløsning (bestemmelsessluttpunkt).

Når du utfører studier i automatisk modus ved bruk av et koagulometer, oppnås avhengigheten av endringen i optisk tetthet på konsentrasjonen av heparin.