FS.3.2.0003.15 Ludzki czynnik krzepnięcia krwi VIII. Czynnik krzepnięcia VIII

Poziom czynnika krzepnięcia VIII krwi od 0 do 1% powoduje wyjątkowo ciężką postać choroby, od 1 do 2% - ciężką, od 2 do 5% - umiarkowaną, powyżej 5% - lekka forma, ale z ryzykiem ciężkiego, a nawet śmiertelnego krwawienia podczas urazów i interwencji chirurgicznych.

Wśród wszystkich możliwe przejawy hemofilią są przede wszystkim krwotoki w dużych stawach kończyn (biodra, kolana, kostki, barki i łokieć), głębokie krwotoki podskórne, domięśniowe i domięśniowe, obfite i przedłużone krwawienie w przypadku urazu w moczu pojawia się krew. Nieco rzadziej obserwuje się inne krwawienia, w tym tak ciężkie i niebezpieczne, jak krwotoki zaotrzewnowe, krwotoki do narządów jamy brzusznej, krwawienia z przewodu pokarmowego i krwotoki wewnątrzczaszkowe (udar).

W przypadku hemofilii można dość wyraźnie prześledzić postęp wszystkich objawów choroby w miarę wzrostu dziecka, a następnie osoby dorosłej. Przy urodzeniu mniej lub bardziej rozległe krwotoki pod okostną kości czaszki, krwotoki podskórne i śródskórne, późne krwawienie z pępowiny. Czasami chorobę wykrywa się już przy pierwszym wstrzyknięciu domięśniowym, co może spowodować powstanie dużego, zagrażającego życiu krwiaka międzymięśniowego. Ząbkowi często towarzyszy niezbyt obfite krwawienie. W pierwszych latach życia często pojawia się krwawienie z błony śluzowej jamy ustnej, związane z zranieniem różnymi ostrymi przedmiotami. Gdy dziecko uczy się chodzić, upadkom i siniakom często towarzyszą obfite krwawienia z nosa i siniaki na głowie. Krwotoki na oczodole, a także krwiaki zaoczodołowe mogą prowadzić do utraty wzroku. U dziecka, które zaczęło raczkować, typowe są krwotoki w okolicy pośladków. Następnie na pierwszy plan wysuwają się krwotoki w dużych stawach kończyn. Pojawiają się wcześniej, im cięższa jest hemofilia. Pierwsze krwotoki predysponują do powtarzających się krwawień do tych samych stawów. Każdy to ma indywidualna osoba cierpiący na hemofilię, ze szczególnym uporem i częstotliwością krwotoków, dotyczy 1-3 stawów. Najczęściej dotknięte stawy to kolana, następnie kostki, łokcie i biodra. Krwotoki w małych stawach dłoni i stóp (mniej niż 1% wszystkich zmian) oraz w stawach międzykręgowych występują stosunkowo rzadko. U każdej osoby, w zależności od wieku i ciężkości choroby, dotkniętych jest od 1-2 do 8-12 stawów.

Należy rozróżnić ostrą hemartrozę (pierwotną i nawracającą), przewlekłą krwotoczno-niszczącą chorobę zwyrodnieniową stawów (artropatię) i wtórny immunologiczny zespół reumatoidalny jako powikłanie głównego procesu.

Ostra hemartroza objawia się jako nagłe pojawienie się(często po niewielkim urazie) lub gwałtownym nasileniu bólu stawu. Staw jest często powiększony, skóra na nim jest czerwona i gorąca w dotyku. Po pierwszej transfuzji składników krwi ból szybko (w ciągu kilku godzin) słabnie, a przy jednoczesnym usunięciu krwi ze stawu znika niemal natychmiast.

Wyróżnia się IV etapy uszkodzenia stawów. W stadium I, czyli wczesnym, w wyniku krwotoku może dojść do zwiększenia objętości stawu. W okresie „zimnym” funkcja stawu nie jest zaburzona, ale badanie rentgenowskie ujawnia charakterystyczne objawy zmiany. W etapie II następuje postęp procesu, o czym świadczą dane zdjęcia rentgenowskie. W stadium III staw gwałtownie powiększa się, ulega deformacji, często jest nierówny i wyboisty w dotyku, stwierdza się wyraźne zanik mięśni chorej nogi. Ruchomość zajętych stawów jest mniej lub bardziej ograniczona, co wiąże się zarówno z uszkodzeniem samego stawu, jak i zmianami w mięśniach i ścięgnach. Na tym etapie rozwija się ciężka osteoporoza i łatwo dochodzi do złamań wewnątrz stawów. W kości udowej obserwuje się kraterowe lub tunelowe zniszczenie substancji kostnej, typowe dla hemofilii. Rzepka jest częściowo zniszczona. Chrząstki śródstawowe ulegają zniszczeniu, a w jamie stawowej znajdują się ruchome fragmenty tych chrząstek. Możliwe są różne rodzaje podwichnięć i przemieszczeń kości. W etapie IV funkcja stawu zostaje prawie całkowicie utracona. Możliwe są złamania wewnątrz stawów. Wraz z wiekiem nasilenie i częstość występowania uszkodzeń aparatu stawowego postępuje i stają się bardziej dotkliwe, gdy wokół patologicznie zmienionych stawów pojawiają się krwiaki.

Wtórny zespół reumatoidalny (zespół Barkagana-Egorovy) jest częstą postacią uszkodzenia stawów u pacjentów chorych na hemofilię. Zespół ten został po raz pierwszy opisany w 1969 roku. W wielu przypadkach jest on pomijany przez lekarzy, ponieważ występuje na tle istniejącego hemartrozy i procesów destrukcyjnych w stawach charakterystycznych dla hemofilii. Wtórnemu zespołowi reumatoidalnemu towarzyszy przewlekły proces zapalny (często symetryczny) w małych stawach dłoni i stóp, które wcześniej nie były dotknięte krwotokami. Następnie w miarę postępu procesu złącza te ulegają typowym odkształceniom. W duże stawy Okresowo pojawia się silny ból i można zauważyć silną poranna sztywność stawów. Niezależnie od pojawienia się nowych krwotoków, proces stawowy stale postępuje. W tym momencie badanie krwi ujawnia pojawienie się lub gwałtowny wzrost istniejących objawów laboratoryjnych proces zapalny, w tym immunologiczne.

U większości osób chorych na hemofilię zespół pojawia się w wieku powyżej 10-14 lat. W wieku 20 lat jego częstotliwość sięga 5,9%, a do 30 roku życia - do 13% wszystkich przypadków choroby. Wraz z wiekiem częstość występowania i nasilenie wszystkich zmian w stawach stale postępuje, co prowadzi do niepełnosprawności i wymusza używanie kul, wózków inwalidzkich i innych urządzeń. Postęp uszkodzeń stawów zależy od częstości występowania ostrych krwotoków, terminowości i kompletności ich leczenia (bardzo ważne jest wczesne przetoczenie krwi i jej składników), jakości opieki ortopedycznej, poprawna aplikacja fizjoterapia, efekty fizjoterapeutyczne i balneologiczne, wybór zawodu i szereg innych okoliczności. Obecnie wszystkie te pytania są niezwykle istotne, ponieważ oczekiwana długość życia w przypadku hemofilii gwałtownie wzrosła ze względu na sukces leczenia naprawczego.

Rozległe i intensywne krwiaki podskórne, międzymięśniowe, podpowięziowe i zaotrzewnowe są bardzo groźne i niebezpieczne. Stopniowo narastając, mogą osiągać ogromne rozmiary, zawierać od 0,5 do 3 litrów krwi lub więcej, prowadzić do rozwoju anemii, powodować ucisk i niszczenie otaczających tkanek oraz naczyń je zasilających, martwicę. Na przykład krwiaki zaotrzewnowe często całkowicie niszczą duże obszary kości miednicy(średnica strefy zniszczenia może osiągnąć 15 cm lub więcej), krwiaki na nogach i ramionach niszczą kości rurkowe i kość piętową. Śmierć tkanki kostnej prowadzi do powstania krwotoków pod okostną. Proces takiego niszczenia kości na zdjęciach rentgenowskich jest często mylony z procesem nowotworowym. Często w krwiakach odkładają się sole wapnia, co czasami prowadzi do powstania nowych kości, które mogą zamknąć stawy i całkowicie je unieruchomić.

Wiele krwiaków, uciskających pnie nerwowe lub mięśnie, powoduje paraliż, zaburzenia czucia i szybko postępujący zanik mięśni. Szczególnie niebezpieczne są rozległe krwotoki w tkankach miękkich okolicy podżuchwowej, szyi, gardle i gardle. Krwotoki te powodują zwężenie górnych dróg oddechowych i uduszenie.

Poważny problem w hemofilii powodują ciężkie i uporczywe krwawienie do nerek, obserwowane u 14-30% osób z tą chorobą krwi. Krwawienia te mogą wystąpić zarówno samoistnie, jak i w związku z urazami okolicy lędźwiowej, współistniejącym odmiedniczkowym zapaleniem nerek. Ponadto może wystąpić krwawienie z nerek z powodu zwiększonego wydalania wapnia z moczem w wyniku zniszczenia kości w hemofilii. Pojawienie się lub nasilenie takiego krwawienia można ułatwić stosując leki przeciwbólowe (kwas acetylosalicylowy itp.), masywne transfuzje krwi i osocza, co prowadzi do dodatkowego uszkodzenia nerek. Krwawienie nerkowe często poprzedzone jest przedłużonym wydalaniem cząstek krwi z moczem, co można wykryć jedynie w badaniach laboratoryjnych.

Pojawieniu się krwi w moczu często towarzyszą ciężkie zaburzenia oddawania moczu, a także zmiana ilości wydalanego moczu (może wystąpić zwiększenie lub zmniejszenie jego dziennej objętości), ataki kolki nerkowej spowodowane tworzeniem się krwi zakrzepy dróg moczowych. Zjawiska te są szczególnie intensywne i wyraźne podczas leczenia, gdy tymczasowo przywracany jest normalny stan krwi. Zaprzestanie wydalania krwi z moczem jest często poprzedzone kolka nerkowa, a często chwilowy brak wydalania moczu z pojawieniem się oznak zatrucia organizmu toksycznymi produktami przemiany materii.

Krwawienie z nerek okresowo nawraca, co z biegiem lat może prowadzić do poważnych zmian dystroficzno-niszczących w tym narządzie, wtórnej infekcji i śmierci z powodu rozwoju niewydolność nerek.

Krwawienie z przewodu pokarmowego w hemofilii mogą wystąpić samoistnie, ale częściej są spowodowane przyjmowaniem kwasu acetylosalicylowego (aspiryny), butadionu i innych leków. Drugim źródłem krwawienia są oczywiste lub ukryte wrzody żołądka lub dwunastnicy, a także erozyjne zapalenie żołądka różnego pochodzenia. Czasami jednak obserwuje się rozlane krwawienie włośniczkowe, bez żadnych destrukcyjnych zmian w błonie śluzowej. Te krwawienia nazywane są diapedycznymi. Gdy się pojawią, ściana jelita zostaje przesiąknięta krwią na dużej powierzchni, co szybko prowadzi do śpiączki w wyniku ciężkiej niedokrwistości, półomdlały w połączeniu z Gwałtowny spadek ciśnienie krwi i śmierć. Mechanizm rozwoju takiego krwawienia pozostaje niejasny do dziś.

Krwotoki do narządów jamy brzusznej imitują różne ostre choroby chirurgiczne - ostre zapalenie wyrostka robaczkowego, niedrożność jelit itd.

Krwotoki w głowie i rdzeń kręgowy i ich błony w hemofilii są prawie zawsze związane albo z urazem, albo ze stosowaniem leków upośledzających funkcję płytek krwi, które są bezpośrednio zaangażowane w krzepnięcie krwi. Pomiędzy momentem urazu a wystąpieniem krwotoku może wystąpić przerwa w świetle trwająca od 1 do 2 godzin dziennie.

Cecha charakterystyczna hemofilia to przedłużone krwawienie podczas urazów i operacji. Rany szarpane znacznie bardziej niebezpieczne niż przerwy liniowe. Krwawienie często nie pojawia się natychmiast po urazie, ale po 1-5 godzinach.

Usunięcie migdałków w przypadku hemofilii jest znacznie bardziej niebezpieczne niż operacja jamy brzusznej interwencje chirurgiczne.

Usuwaniu zębów, zwłaszcza trzonowych, często towarzyszy wielodniowe krwawienie nie tylko z zębodołu, ale także z krwiaków powstałych w miejscu nacieku nowokainy w tkankach, co prowadzi do rozwoju anemii. Te krwiaki powodują zniszczenie szczęki. W przypadku hemofilii zęby są usuwane w wyniku działania leków przeciwhemofilnych ogólne znieczulenie. Lepiej jest usunąć kilka zębów na raz.

Niektóre powikłania hemofilii są spowodowane utratą krwi, uciskiem i zniszczeniem tkanki przez krwiaki oraz zakażeniem krwiaków. Związana jest także duża grupa powikłań zaburzenia immunologiczne. Najniebezpieczniejszym z nich jest pojawienie się we krwi dużych ilości inhibitorów immunologicznych („blokerów”) czynnika krzepnięcia krwi VIII (lub IX), przekształcających hemofilię w tzw. postać hamującą, w której główną metodą leczenia jest terapia transfuzyjna (transfuzja krwi lub jej składników) - prawie całkowicie traci swoją skuteczność. Co więcej, wielokrotne podawanie leków przeciwhemofilowych często powoduje gwałtowny wzrost ilości inhibitora we krwi, w wyniku czego transfuzje krwi i jej składników, które początkowo dawały pewien efekt, szybko stają się bezużyteczne. Według danych częstość występowania hamującej postaci hemofilii różni autorzy, waha się od 1 do 20%, częściej od 5 do 15%. W przypadku postaci hamujących czynność płytek krwi jest zauważalnie upośledzona, krwotoki w stawach i wydalanie krwi z moczem stają się częstsze, a uszkodzenie stawów jest znacznie większe.

Główną metodą leczenia i zapobiegania krwawieniom i krwotokom o dowolnej lokalizacji i dowolnym pochodzeniu w hemofilii jest dożylne podanie odpowiednich dawek produktów krwiopochodnych zawierających czynnik VIII. Czynnik VIII jest zmienny i praktycznie nie jest konserwowany w krwi w puszkach, osoczu naturalnym i suszonym. Do leczenia zastępczego nadają się wyłącznie bezpośrednie transfuzje krwi od dawcy oraz produkty krwiopochodne z zachowanym czynnikiem krzepnięcia VIII. Bezpośrednią transfuzję krwi od dawcy stosuje się jedynie wówczas, gdy lekarz nie dysponuje innymi lekami przeciwhemofilnymi. Przetaczanie krwi od matki jest poważnym błędem, ponieważ jest ona nosicielką choroby, a poziom czynnika VIII we krwi znacznie się zmniejsza. Ze względu na krótki okresżycia czynnika VIII we krwi biorcy (około 6-8 godzin), transfuzje krwi, a także transfuzje osocza antyhemofilnego należy powtarzać co najmniej 3 razy dziennie. Takie transfuzje krwi i osocza nie nadają się do zatrzymania masywnego krwawienia i niezawodnego pokrycia różnych interwencji chirurgicznych.

Równa objętość osocza przeciw hemofilii jest około 3-4 razy skuteczniejsza niż świeża krew w puszkach. Dzienna dawka 30-50 ml/kg masy ciała osocza antyhemofilnego pozwala na utrzymanie przez pewien czas 10-15% poziomu czynnika VIII. Główne niebezpieczeństwo takie leczenie polega na przeciążeniu krążenia krwi objętością, co może prowadzić do rozwoju obrzęk płuc. Zastosowanie osocza antyhemofilowego w postaci skoncentrowanej nie zmienia sytuacji, gdyż wysokie stężenie wstrzykniętego białka powoduje intensywny przepływ płynu z tkanek do krwi, w efekcie czego zwiększa się objętość krążącej krwi w taki sam sposób jak z wlewem osocza w normalnym rozcieńczeniu. Skoncentrowane suche osocze antyhemofilowe ma tę zaletę, że zawiera bardziej stężony czynnik VIII krzepnięcia krwi, a przy małej objętości szybciej wprowadza się do krwioobiegu. Suche osocze przeciwhemofilowe przed użyciem rozcieńcza się wodą destylowaną. Leczenie osoczem przeciwhemofilowym jest wystarczające do zatrzymania większości ostrych krwotoków w stawach (z wyjątkiem najcięższych), a także do zapobiegania i leczenia drobnych krwawień.

Najbardziej niezawodne i skuteczne w leczeniu hemofilii są koncentraty czynnika krzepnięcia VIII. Najbardziej dostępnym z nich jest krioprecypitat. Jest to koncentrat białkowy izolowany z osocza poprzez chłodzenie (kriostrącanie), zawierający wystarczającą ilość czynników krzepnięcia, ale niewielką ilość białka. Niska zawartość białka umożliwiają podanie leku do krwioobiegu w bardzo krótkim czasie duże ilości i zwiększyć stężenie czynnika VIII do 100% lub więcej, bez obawy o przeciążenie układu krążenia i obrzęk płuc. Krioprecypitat należy przechowywać w temperaturze -20°C, co utrudnia jego transport. Po rozmrożeniu lek szybko traci swoją aktywność. Suchy krioprecypitat i nowoczesne koncentraty czynnika krzepnięcia VIII nie mają tych wad. Można je przechowywać w zwykłej lodówce. Nadmierne podanie krioprecypitatu jest niepożądane, gdyż powoduje on wysokie stężenie czynników krzepnięcia we krwi, w wyniku czego dochodzi do zaburzenia mikrokrążenia w narządach i istnieje ryzyko powstania zakrzepów i rozwoju zespołu rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego.

Wszystkie leki przeciwhemofilowe podaje się dożylnie wyłącznie w formie strumienia, w możliwie najbardziej stężonej formie i możliwie jak najszybciej po ich ponownym zakonserwowaniu, bez mieszania z innymi roztworami. podanie dożylne. Jedna z głównych przyczyn niepowodzeń Terapia zastępcza polega na podaniu kroplowym produktów krwiopochodnych, co nie prowadzi do wzrostu poziomu czynnika krzepnięcia VIII w osoczu. Do czasu trwałego ustania krwawienia nie należy stosować preparatów krwiopochodnych i preparatów krwiopochodnych niezawierających czynników antyhemofilnych, gdyż prowadzi to do rozcieńczenia czynnika VIII i zmniejszenia jego stężenia w surowicy.

W przypadku ostrych krwotoków w stawach konieczne jest tymczasowe (nie dłużej niż 3-5 dni) unieruchomienie (unieruchomienie) chorej kończyny w pozycji fizjologicznej, ogrzanie dotkniętego stawu (okłady), ale nie schładzanie. Wczesne usunięcie krew napływająca do stawu nie tylko natychmiast eliminuje ból, zapobiega dalszemu krzepnięciu krwi w stawie, ale także zmniejsza ryzyko rozwoju i szybkiego postępu choroby zwyrodnieniowej stawów. W celu zapobiegania i leczenia wtórnych zmian zapalnych po pobraniu krwi do jamy stawowej wstrzykuje się 40-60 mg hydrokortyzonu. Podtrzymująca terapia transfuzyjna prowadzona przez pierwsze 3-6 dni zapobiega dalszemu krwawieniu i pozwala na wcześniejsze rozpoczęcie ćwiczeń fizjoterapeutycznych, co przyczynia się do szybszego i pełniejszego przywrócenia funkcji chorej kończyny oraz zapobiega zanikowi mięśni. Lepiej jest rozwijać ruchy w dotkniętym stawie etapami. W ciągu pierwszych 5-7 dni po zdjęciu bandaża wykonuje się aktywne ruchy zarówno w dotkniętym stawie, jak i w innych stawach kończyny, stopniowo zwiększając częstotliwość i czas trwania ćwiczeń. Od 6-9 dnia przechodzą na ćwiczenia „obciążające” z wykorzystaniem ergometrów rowerowych, bramek na pedały dla ramion i elastycznego trakcji. Od 11 do 13 dnia, w celu wyeliminowania sztywności resztkowej i ograniczeń maksymalnego zgięcia lub wyprostu, należy zachować ostrożność podczas wykonywania ćwiczeń z obciążeniem biernym. Jednocześnie od 5-7 dnia przepisywane jest leczenie fizjoterapeutyczne - elektroforeza hydrokortyzonu, cynkowanie anodowe.

W przypadku krwotoków do tkanek miękkich leczenie lekami przeciwhemofilnymi jest intensywniejsze niż w przypadku krwotoków do stawów. Jeśli rozwinie się niedokrwistość, dodatkowo przepisuje się dożylne wlewy czerwonych krwinek. W przypadku wystąpienia objawów zakażenia krwiakiem natychmiast przepisuje się antybiotyki o szerokim spektrum działania. Każdy zastrzyki domięśniowe w hemofilii są przeciwwskazane, gdyż mogą powodować rozległe krwiaki i guzy rzekome. Penicylina i jej półsyntetyczne analogi są również niepożądane, ponieważ w dużych dawkach zwiększają krwawienie.

Wczesne i intensywne leczenie lekami przeciwhemofilnymi przyczynia się do szybkiego odwrotnego rozwoju krwiaków. Powstałe krwiaki usuwa się w miarę możliwości chirurgicznie wraz z torebką.

Zewnętrzne krwawienia z uszkodzonej skóry, krwawienia z nosa i krwawienia z ran w jamie ustnej są zatrzymywane zarówno poprzez transfuzję, jak i wpływy lokalne - leczenie krwawiącego miejsca lekami sprzyjającymi krzepnięciu krwi. Ponadto leki te można również przyjmować doustnie. Na rany zakłada się bandaże uciskowe lub szwy. W ten sam sposób zatrzymuje się krwawienie po ekstrakcji zęba. Podczas usuwania żucie zębów prowadzi się nieco bardziej intensywną transfuzję, a jednoczesne usunięcie kilku zębów (3-5 i więcej) wymaga podawania leków przeciwhemofilowych w ciągu pierwszych 3 dni.

W przypadku krwawienia z nosa należy unikać ciasnej tamponady, ponieważ po usunięciu tamponów krwawienie często powraca z jeszcze większą siłą. Szybkie zatamowanie krwawień z nosa osiąga się zazwyczaj za pomocą osocza antyhemofilowego i leków przeciwhemofilowych oraz jednoczesnego przemywania błony śluzowej nosa roztworami sprzyjającymi krzepnięciu krwi.

Krwawienie z nerek stwarza poważne zagrożenie, w którym dożylne wlewy osocza antyhemofilnego i krioprecypitatu są nieskuteczne.

Krwawienie z przewodu pokarmowego zostaje zatrzymane dużymi dawkami koncentratów czynników krzepnięcia. Należy pamiętać, że krwawienie z żołądka często wywołuje się zażywaniem aspiryny, brufenu czy indometacyny w związku z bólem stawów, bólem zęba czy bólem głowy. Nawet u chorych na hemofilię pojedyncza dawka aspiryna może powodować krwawienie z żołądka.

W profilaktyce i leczeniu przewlekłej choroby zwyrodnieniowej stawów i innych schorzeń narządu ruchu konieczne jest uwzględnienie różne drogi chroniące stawy i zapobiegające kontuzjom kończyn. W tym celu do odzieży w okolicach kolan, kostek i kostek wszyte są piankowe osłony stawy łokciowe unikaj sportów, które powodują skakanie, upadki i siniaki (w tym jazdę na rowerze i motocyklu). Ważne jest, aby mieć to jak najwcześniej pełne leczenie ostre krwotoki do stawów i mięśni, intensywne przez cały rok fizykoterapia. W tym celu służą specjalne kompleksy ćwiczeń atraumatycznych w wodzie, na miękkich matach i urządzeniach obciążających – ergometry rowerowe, bramki ręczne. Zajęcia należy rozpocząć już w przedszkolu lub gimnazjum. wiek szkolny, tj. zanim rozwinęły się ciężkie zaburzenia narządu ruchu. Kompleksowa terapia uzupełnione fizjoterapią (prądy Wysoka częstotliwość, elektroforeza glikokortykosteroidów) oraz metody leczenia balneologicznego, przede wszystkim terapia borowinowa, kąpiele solankowe i radonowe. W przypadku częstych i uporczywie nawracających krwotoków w tych samych stawach wykonuje się radioterapię chirurgia.

W profilaktyce krwotoków ważne jest, aby już od najmłodszych lat minimalizować ryzyko urazów i skaleczeń. Z codziennego użytku wyłączone są zabawki łatwo tłukące się (m.in. metalowe i plastikowe), a także przedmioty niestabilne i ciężkie. Meble powinny mieć zaokrąglone krawędzie, wystające krawędzie owinąć watą lub pianką gumową, a podłogę wyłożyć dywanem z włosiem. Preferowane jest, aby pacjenci komunikowali się i bawili z dziewczynkami, a nie z chłopcami. Ważne dla pacjenta właściwy wybór zawody i miejsca pracy.

Nie opracowano jeszcze sposobu zapobiegania hemofilii. Ustalenie płci nienarodzonego dziecka metodą badania genetyczne Komórki uzyskane z płynu owodniowego pozwalają na terminowe przerwanie ciąży, ale nie wskazują, czy płód jest nosicielem genu hemofilii. Ciąża jest utrzymywana, jeśli płód jest płci męskiej, ponieważ wszyscy synowie pacjentów rodzą się zdrowi. Ciąża zostaje przerwana, jeśli płód jest płci żeńskiej, ponieważ wszystkie córki chorych na hemofilię są nosicielkami tej choroby.

U kobiet będących nosicielkami hemofilii, które mają 50% szans na urodzenie chorego dziecka (jeśli płód jest płci męskiej) lub które są nosicielkami hemofilii (jeśli płód jest płci żeńskiej), urodzenie wyłącznie dziewcząt przenosi ryzyko posiadania w rodzinie chorych na hemofilię od pierwszego do drugiego pokolenia, zwiększając jednocześnie całkowitą liczbę nosicieli choroby.

Niska hemoglobina. Kamica żółciowa. Żadnych ataków. Brak właściwie przepisanego leczenia Naprawdę proszę o pomoc. Mam kamicę żółciową. Małe kamyki i nie za dużo. Powierzchowne zapalenie żołądka. Brak zamknięcia wpustu i refluks żółciowy. Wcześniej był też Helicobacter++. leczyłem go. Boję się usunąć żółć, bo problemy z refluksem pozostaną, przełyk będzie skorodowany. Ostatnio popadłem w letarg. Duszność i tachykardia. Ciśnienie krwi wynosi 100/60, a tętno 95. Łamliwe włosy i paznokcie. Zrobiłem badania krwi. Hemoglobina i żelazo w surowicy a niektóre inne wskaźniki żelaza są poniżej normy. Biorę omeza. Nie mieliśmy jeszcze konsultacji z hematologiem. Nagranie jest ogromne. Naprawdę chcę zrozumieć, co robić i jak prawidłowo leczyć. Pomóż mi proszę. Nie mam siły trwać w tym stanie. Teraz już nie wiem jakie badania i leczenie zrobić, jedno drugiemu może zaszkodzić. Według USG jamy brzusznej wszystko jest w porządku z wyjątkiem przewodu żółciowego. Wskaźniki Asat i Alat wydają się w normie, chociaż mogą być podwyższone. Jak mogę mieć od czego zacząć?

Imię rosyjskie

Łacińska nazwa substancji: Czynnik krzepnięcia krwi VIII + czynnik von Willebranda

Grupa farmakologiczna substancji Czynnik krzepnięcia krwi VIII + czynnik von Willebranda

Typowy artykuł kliniczny i farmakologiczny 1

Charakterystyka. Efektywność czynnikowa koagulacja VIII określana jest na podstawie Międzynarodowego Standardu dla koncentratów (FVIII:C), skuteczność czynnika von Willebranda określana jest na podstawie oznaczania skuteczności kofaktora rystocetyny (VW:RK), w oparciu o Międzynarodowy Standard dla koncentratów zgodnie z Farmakopeą Europejską. Aktywność właściwa leku wynosi nie mniej niż 60 IU FVIII:C/mg i nie mniej niż 53 IU VWF:PK/mg białka całkowitego. Liczbę jednostek czynnika krzepnięcia VIII wyraża się w IU, co odpowiada standardom WHO dla tych leków. Aktywność wyraża się jako procent (w stosunku do normalnego poziomu czynnika krzepnięcia w osoczu) lub w jednostkach międzynarodowych (w odniesieniu do międzynarodowego standardu dla czynnika krzepnięcia VIII w osoczu). 1 j.m. czynnika krzepnięcia VIII odpowiada ilości czynnika krzepnięcia VIII w 1 ml prawidłowego ludzkiego osocza.

Akcja farmaceutyczna. Czynnik krzepnięcia krwi VIII wiąże się z czynnikiem von Willebranda; aktywowany czynnik VIII jest kofaktorem aktywowanego czynnika IX, przyspieszającym przejście czynnika krzepnięcia X do aktywna forma; aktywowany czynnik X aktywuje przejście protrombiny do trombiny, trombina z kolei aktywuje przejście fibrynogenu do fibryny, a następnie utworzenie skrzepu krwi. Lek zawiera czynnik von Willebranda, który jest normalnym składnikiem ludzkiego osocza i działa podobnie jak endogenny, korygując zaburzenia hemostatyczne u pacjentów z chorobą von Willebranda: przywraca adhezję płytek krwi do podśródbłonka naczyniowego w miejscu uszkodzenia naczynia (przywiązuje do podśródbłonka naczyń i błony płytek krwi, zapewnia pierwotną hemostazę, skraca czas krzepnięcia, a efekt pojawia się natychmiast i zależy od stopnia polimeryzacji białek); normalizuje współistniejący niedobór czynnika VIII (podany dożylnie wiąże endogenny czynnik VIII i stabilizuje go, spowalniając jego szybką degradację), przywraca prawidłowy poziom czynnika VIII:C. Terapia zastępcza lekiem u chorych na hemofilię A zwiększa zawartość czynnika krzepnięcia VIII, zapewniając tymczasową korektę niedoboru tego czynnika i zmniejszając ryzyko krwawień. Ponadto czynnik von Willebranda sprzyja adhezji płytek krwi w obszarze uszkodzenia naczyń i odgrywa rolę znacząca rola podczas agregacji płytek krwi.

Farmakokinetyka. Choroba von Willebranda typu 3: średni odzysk VWF:RK i VWF:Ag wynosi odpowiednio 68-99%, co odpowiada średniemu wzrostowi stężeń w osoczu o 1,5 i 2,1% na zastąpioną j.m./kg masy ciała. T1/2 FV:RK – 17,5 godz., klirens – 3,9 ml/h/kg. Hemofilia A: stężenie czynnika VIII:C wynosi 80-120% oczekiwanej wartości. T1/2 VIII:C – 14,8 godz., co odpowiada biologicznemu T1/2, klirens – 2,9 ml/h/kg.

Wskazania. Leczenie i zapobieganie krwawieniom u pacjentów z chorobą von Willebranda (z ilościowym i/lub jakościowym niedoborem czynnika von Willebranda), wrodzoną hemofilią A lub nabytym niedoborem czynnika krzepnięcia VIII.

Przeciwwskazania. Nadwrażliwość, wiek do 6 lat (skuteczność i bezpieczeństwo nie zostały ustalone).

Ostrożnie. Ciąża, okres laktacji.

Dozowanie. IV, po rozpuszczeniu w dostarczonym rozpuszczalniku; otrzymany roztwór zawiera 90 jm czynnika krzepnięcia krwi VIII i 80 jm czynnika von Willebranda w 1 ml.

Choroba von Willebranda: zależy od dawki i czasu trwania terapii zastępczej stan kliniczny pacjenta, rodzaj i nasilenie krwawienia, stężenie FVIII:C i VWF:RK.

Stosunek pomiędzy FVIII:S i VWF:RK wynosi 1:1, średnio 1 IU/kg. FVIII:S i VWF:RK zwiększają poziomy w osoczu o 1,5-2% normalnej aktywności odpowiedniego białka. Zwykła dawka leku 20-50 IU/kg, co zwiększa poziom FVIII:C i VWF:RK do 30-100%. Dawkę początkową można zwiększyć do 50-80 j.m./kg mc., zwłaszcza u pacjentów z chorobą von Willebranda typu 3 z krwawieniem z przewodu pokarmowego.

Aby zapobiec krwawieniu, należy rozpocząć podawanie leku na 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu. W przypadku planowanego zabiegu lek podaje się na 12-24 godziny i 1 godzinę przed rozpoczęciem zabiegu, przy oczekiwanym stężeniu VWF:RK 60 IU/dL lub więcej (60% i więcej) oraz FVIII:C 50 IU /dL lub więcej (50% lub więcej). Dawkę podaje się co 12-24 h. Długotrwałe leczenie może spowodować nadmierny wzrost stężenia FVIII:C. Po 24-48 godzinach leczenia, aby uniknąć nadmiernego wzrostu stężenia FVIII:C, należy zmniejszyć dawkę lub zwiększyć odstęp pomiędzy dawkami.

Hemofilia A: 1 jm czynnika krzepnięcia VIII:C/kg zwiększa ten czynnik w osoczu o 1,5-2% normalnej zawartości. Ustalenie wymaganej dawki: masa ciała (kg) × pożądany wzrost poziomu czynnika krzepnięcia VIII (%) × 0,5 IU/kg.

W przypadku krwawień opisanych poniżej poziom aktywności FVIII:C nie powinien spaść poniżej wyjściowego poziomu w osoczu (% wartości prawidłowych) przez odpowiedni okres czasu.

Umiarkowane krwawienia (wczesne krwiaki do stawów, krwawienia domięśniowe, krwawienia z nosa, krwawienia z jamy ustnej i inne drobne urazy) – wymagane stężenie czynnika krzepnięcia VIII to 20-40 IU/dl (20-40%), podawanie powtarza się co 12-24 godzin, przez co najmniej 1 dzień, do czasu ustąpienia bólu lub zagojenia się źródła krwawienia.

Bardziej rozległe krwawienia (krwawienie domięśniowe lub krwiak) - wymagane stężenie czynnika krzepnięcia VIII to 30-60 IU/dl (30-60%) co 12-24 godziny przez 3-4 dni, aż do ustąpienia bólu i zdolności do pracy zostaje przywrócony.

Krwawienie zagrażające życiu (śródczaszkowe, dootrzewnowe, w szyi, tępy uraz, bez widocznego źródła krwawienia) - wymagane stężenie czynnika krzepnięcia VIII wynosi 60-100 IU/dl (60-100%) co 8-24 godziny, aż do całkowitego ustąpienia zagrożenia.

Drobne zabiegi chirurgiczne (w tym ekstrakcja zęba) - wymagane stężenie czynnika krzepnięcia VIII wynosi 30-60 IU/dl (30-60%) co 24 godziny, przynajmniej przez 1 dzień, aż do zagojenia.

Poważne zabiegi chirurgiczne - wymagany poziom czynnika VIII (przed i pooperacyjny) wynosi 80-100 IU/dL (80-100%) co 8-24 godziny do momentu odpowiedniego zagojenia się rany, następnie co najmniej 7 dni w celu utrzymania aktywności czynnika VIII na poziomie 30-60%.

W celu długotrwałego zapobiegania krwawieniom u chorych na ciężką hemofilię A konieczne jest podawanie 20-40 j.m./kg mc. co 2-3 dni. W niektórych przypadkach, szczególnie u młodych pacjentów, może zaistnieć konieczność skrócenia odstępu pomiędzy dawkami lub zwiększenia dawki.

Jeżeli odpowiednia dawka nie daje efektu lub przy odpowiednim podaniu nie można uzyskać pożądanego stężenia czynnika krzepnięcia VIII w osoczu, należy wykonać test Bethesda na obecność przeciwciał hamujących czynnik krzepnięcia VIII. U pacjentów z wysoki poziom inhibitorami, leczenie czynnikiem krzepnięcia VIII może być nieskuteczne i wymagać innych działań terapeutycznych.

Efekt uboczny. Reakcje alergiczne(pokrzywka, wysypka skórna, dreszcze, uczucie ucisku w klatce piersiowej, duszność, obniżone ciśnienie krwi, rzadko - wstrząs anafilaktyczny), pieczenie w miejscu wstrzyknięcia, hipertermia, „uderzenia gorąca” ból głowy, senność, apatia, nudności, wymioty, niepokój. Rozwój przeciwciał hamujących czynnik von Willebranda - w chorobie von Willebranda, w hemofilii A - przeciwko czynnikowi krzepnięcia krwi VIII (zwykle IgG), co prowadzi do niewystarczającej odpowiedzi klinicznej na lek; przeciwciała hamujące mogą powodować wytrącanie się substancji i przyczyniać się do rozwoju reakcji anafilaktycznych.

U pacjentów otrzymujących preparaty z czynnikiem von Willebranda zawierające czynnik krzepnięcia VIII, przedłużony wzrost stężenia czynnika VIII:C w osoczu zwiększa ryzyko zakrzepicy (konieczne jest monitorowanie pacjentów z grupy ryzyka).

U pacjentów chorych na hemofilię A mogą rozwinąć się przeciwciała hamujące i obserwuje się niewystarczającą odpowiedź kliniczną na lek.

Interakcja. Nie należy go mieszać z innymi lekami ani podawać jednocześnie przy użyciu tego samego zestawu infuzyjnego.

Specjalne instrukcje. Podczas podawania leku należy uważnie monitorować stan pacjenta. Wczesne objawy reakcji nadwrażliwości obejmują pokrzywkę, uogólnioną wysypkę, ucisk w klatce piersiowej, duszność, obniżone ciśnienie krwi i anafilaksję. W przypadku wystąpienia tych objawów należy natychmiast przerwać podawanie leku. Jeżeli wystąpią reakcje anafilaktyczne, należy zbadać pacjentów na obecność przeciwciał hamujących.

W przypadku stosowania leków uzyskanych z ludzkiej krwi lub osocza nie można całkowicie wykluczyć możliwości przeniesienia czynników zakaźnych, dlatego jest to zalecane szczepienie zapobiegawcze przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu A i B.

Długotrwałe leczenie pacjentów z chorobą von Willebranda lekiem zawierającym czynnik von Willebranda i czynnik krzepnięcia VIII może powodować nadmierny wzrost czynnika krzepnięcia VIII:C, co zwiększa ryzyko wystąpienia zakrzepicy (konieczne jest monitorowanie stężenia czynnika krzepnięcia VIII:C ).

Ryzyko powstania przeciwciał hamujących w hemofilii A osiąga maksimum w ciągu pierwszych 20 dni od przepisania leku, rzadziej po pierwszych 100 dniach stosowania leku. Nie ustalono możliwości stosowania leku w obecności przeciwciał hamujących czynnik krzepnięcia VIII.

Do podania leku należy używać wyłącznie zestawu do rozpuszczania i podawania dożylnego znajdującego się w zestawie. Inne urządzenia mogą adsorbować czynniki krzepnięcia krwi na swojej wewnętrznej powierzchni, co prowadzi do zmniejszenia efektywności leczenia.

Informacje o badaniu

Specjalne instrukcje: Nie prowadź badań w trakcie ostre okresy choroby oraz podczas stosowania leków przeciwzakrzepowych (od ich odstawienia musi upłynąć co najmniej 30 dni). Biomateriał należy zgłosić do badań na czczo. Pomiędzy ostatnim posiłkiem a pobraniem krwi musi upłynąć co najmniej 8 godzin.

OGÓLNE ZASADY PRZYGOTOWANIA DO BADAŃ:

1. W przypadku większości badań zaleca się oddawanie krwi rano, w godzinach 8-11, na czczo (od ostatniego posiłku do pobrania krwi musi upłynąć co najmniej 8 godzin, wodę można pić w godz. Tryb normalny), w przeddzień badania zjedz lekką kolację z ograniczonym spożyciem tłustych potraw. W przypadku badań w kierunku infekcji i badań ratunkowych dopuszczalne jest oddanie krwi 4-6 godzin po ostatnim posiłku.

2. UWAGA! Specjalne zasady przygotowania do szeregu badań: wyłącznie na czczo, po 12-14 godzinach postu należy oddać krew na gastrynę-17, profil lipidowy (cholesterol całkowity, cholesterol HDL, cholesterol LDL, cholesterol VLDL, trójglicerydy, lipoproteiny (a), apolipoproten A1, apolipoproteina B); Test tolerancji glukozy wykonuje się rano na czczo, po 12-16 godzinach postu.

3. W przeddzień badania (w ciągu 24 godzin) należy unikać alkoholu, intensywnej aktywności fizycznej i przyjmowania leków (po konsultacji z lekarzem).

4. Na 1-2 godziny przed oddaniem krwi nie palić, nie pić soków, herbaty, kawy, można pić wodę niegazowaną. Wykluczać zmeczenie fizyczne(bieganie, szybkie wchodzenie po schodach), emocjonalne podniecenie. Zaleca się odpoczynek i uspokojenie na 15 minut przed oddaniem krwi.

5. Nie należy oddawać krwi do badań laboratoryjnych bezpośrednio po zabiegach fizjoterapeutycznych, badaniach instrumentalnych, RTG i badania ultrasonograficzne, masaże i inne zabiegi medyczne.

6. Przy monitorowaniu parametrów laboratoryjnych w czasie zaleca się powtarzanie badań w tych samych warunkach – w tym samym laboratorium, oddawanie krwi o tej samej porze dnia itp.

7. Krew na badania należy oddać przed rozpoczęciem przyjmowania leków lub nie wcześniej niż 10–14 dni po ich zaprzestaniu. Aby ocenić kontrolę skuteczności leczenia dowolnym lekiem, badanie należy przeprowadzić 7-14 dni po przyjęciu ostatniej dawki leku.

Jeśli zażywasz leki, koniecznie poinformuj o tym swojego lekarza.

OGÓLNY ARTYKUŁ FARMAKOPEJSKI

Wprowadzony po raz pierwszy

Prawdziwy monografia farmakopealna dotyczy metod oznaczania aktywności czynników krzepnięcia krwi ludzkiej I, II, VII, VIII, IX, X, XI, czynnika von Willebranda, antytrombiny III w osoczu i produktach krwiopochodnych.

POSTANOWIENIA OGÓLNE

Oznaczanie aktywności czynników krzepnięcia opiera się na 2 podejściach:

1. Metoda jednoetapowa. Przywrócenie procesu krzepnięcia krwi w osoczu ubogim w czynnik po dodaniu preparatu tego czynnika (metoda krzepnięcia).
2. Metoda dwuetapowa. W pierwszym etapie, przy użyciu specyficznego kofaktora, aktywowana jest aktywność proteolityczna czynnika II lub czynnika X, tworząc odpowiednio aktywowany czynnik IIa lub Xa. W drugim etapie ilość powstałego aktywowanego czynnika określa się w reakcji jego rozszczepienia na specyficzny peptyd chromogenny (metoda chromogenna).

Metodę chromogenną można przeprowadzić na 2 sposoby: według kinetyki tworzenia chromogenu pod wpływem czynnika aktywowanego lub według punktu końcowego akumulacji chromogenu w określonym czasie inkubacji.

Do realizacji obu metod można zastosować rurki plastikowe, tabletki, koagulometry optyczno-mechaniczne, mechaniczne półautomatyczne i w pełni zautomatyzowane.

We wszystkich metodach obliczenia aktywności dokonuje się poprzez porównanie aktywności badanej próbki z aktywnością międzynarodowego standardu NIBSC lub wtórnego wzorca referencyjnego czynnika krzepnięcia skalibrowanego względem międzynarodowego standardu w międzynarodowych jednostkach aktywności (jm). Równoważność międzynarodowego standardu w IU została ustalona przez WHO. Aktywność czynnika krzepnięcia w 1,0 ml świeżego, prawidłowego zebranego osocza krwi od 300 dawców przyjmuje się jako 1 jm (100%). Aktywność można wyrazić w IU/ml, IU/fiolkę, IU/mg białka oraz jako procent ilości zadeklarowanej przez producenta.

CZYNNIKI

CzynnikI (fibrynogen)

Metoda krzepnięcia

Aktywność fibrynogenu oznacza się metodą Claussa.

Zasada metody

Po dodaniu trombiny do próbki zawierającej fibrynogen obserwuje się tworzenie skrzepu fibrynowego. Stosując trombinę o wysokiej aktywności (~10 IU/ml) i próbki o niskim stężeniu fibrynogenu (poniżej 100 mg/dl) można uzyskać liniową zależność.

Do oznaczania fibrynogenu stosuje się dostępne na rynku systemy testowe zawierające odczynnik trombiny zawierający inhibitor heparyny oraz bufor do rozcieńczania próbki lub dostępny w handlu odczynnik trombiny.

Stężenie fibrynogenu wyraża się w mg/dl. Do skonstruowania wykresu kalibracyjnego należy użyć wzorcowej próbki fibrynogenu lub kalibratora osocza certyfikowanego zgodnie z międzynarodowym standardem. Próbkę wzorcową lub próbkę osocza kalibratora rozpuszcza się w wodzie destylowanej zgodnie z instrukcją. Przygotować 5 seryjnych rozcieńczeń próbki wzorcowej, zaczynając od stężenia ~ 100 mg/dL, stosując bufor do rozcieńczania próbek o pH = 7,3 ± 0,1. Analizę przeprowadza się w temperaturze 37°C zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Dla każdego rozcieńczenia czas tworzenia się skrzepu określa się trzykrotnie. Na podstawie uzyskanych wyników konstruuje się wykres kalibracyjny zależności czasu tworzenia skrzepu od stężenia fibrynogenu we współrzędnych logarytmicznych.

Przygotować 2 rozcieńczenia próbki do badania o stężeniu poniżej 100 mg/dl. Dla każdego rozcieńczenia czas tworzenia się skrzepu określa się trzykrotnie. Ilość fibrynogenu w każdym rozcieńczeniu określa się za pomocą wykresu kalibracyjnego.

CzynnikII(trombina)

1. Metoda krzepnięcia

Oznaczanie aktywności czynnika II przeprowadza się stosując jako substrat osocze ludzkie z niedoborem czynnika II. Proces krzepnięcia aktywuje się poprzez dodanie tromboplastyny ​​do mieszaniny wapnia.

Do rozcieńczenia wzorca i leków należy zastosować bufor NaCl-imidazol o pH 7,3 ± 0,1 z dodatkiem 0,1% albuminy bydlęcej lub ludzkiej. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń standardu czynnika II w zakresie aktywności od 0,3 do 1 IU/ml. Lek rozcieńcza się do stężenia mniejszego niż 1 j.m./ml. Przeanalizuj 3 rozcieńczenia leku. Dla każdej próbki pomiary czasu krzepnięcia przeprowadza się co najmniej 2 razy. Pomiar przeprowadza się w ciągu 1 godziny po rozcieńczeniu leku.

Analizę przeprowadza się w temperaturze (37±0,5)°C. Do plastikowej probówki dodać 50 µl osocza z niedoborem czynnika II i 50 µl rozcieńczenia wzorca lub leku. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze (37 ± 0,5)°C przez 120 – 240 s. Czas krzepnięcia określa się od momentu dodania do mieszaniny 200 µl tromboplastyny ​​wapniowej podgrzanej do temperatury (37 ± 0,5)°C. W zależności od techniki analizy objętości odczynników mogą różnić się w odpowiednich proporcjach.

Wykres kalibracji jest wykreślany we współrzędnych półlogarytmicznych. Wartości aktywności czynnika II wykreślono wzdłuż logarytmicznej osi odciętych, a czas krzepnięcia odpowiednich rozcieńczeń standardu wykreślono wzdłuż osi rzędnych. Aktywność czynnika II dla każdego rozcieńczenia próbki badanej określa się na wykresie kalibracyjnym. Działalność FII ( A

k

1. Metoda chromogenna

Metoda polega na porównaniu aktywności enzymatycznej czynnika IIa, powstałego po specyficznej aktywacji czynnika II, w stosunku do specyficznego chromogennego substratu peptydowego o tej samej aktywności co próbka standardowa (międzynarodowa lub podobna).

Czynnik II jest aktywowany przez aktywator ekarynę, wyizolowany z jadu żmii. Aktywowany czynnik II (trombina) selektywnie rozszczepia chromogenny substrat (dichlorowodorek H-D-fenyloalanino-L-pipekolilo-L-arginino-4-nitroanilidu, 4-toluenosulfonyloglicylo-prolilo-L-arginino-4-nitroanilid, H-D-cykloheksyloglicylo-α-aminobutyryl - dioctan L-arginino-4-nitroanilidu, dioctan D-cykloheksyloglicylo-L-alanylo-L-arginino-4-nitroanilidu) do utworzenia P-nitroanilina. Kinetykę reakcji bada się fotometrycznie przy 405 nm. W tym przypadku wartość gęstości optycznej jest proporcjonalna do aktywności czynnika II.

Oznaczanie czynnika II metodą chromogenną przeprowadza się za pomocą specjalnych zestawów testowych. Analizę przeprowadza się zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Próbkę standardową i preparat wstępnie rozcieńcza się osoczem z niedoborem czynnika II do stężenia ~1 IU/ml (rozcieńczenie podstawowe). Z głównego rozcieńczenia przygotowuje się 3 rozcieńczenia próbki wzorcowej i 3 rozcieńczenia leku roztworem buforowym Tris-sól fizjologiczna o pH 8,4. Każde rozcieńczenie próbki wzorcowej oznacza się dwukrotnie, a uzyskane wartości służą do skonstruowania wykresu kalibracyjnego. Próbki do badań oznacza się trzykrotnie.

Badania przeprowadza się ręcznie przy użyciu mikropłytki i spektrofotometru utrzymującego temperaturę w zakresie (37±0,5)°C lub w trybie automatycznym przy użyciu koagulometru.

Aby przeprowadzić badanie ręczne, do dołków mikropłytki dodaje się 25 µl każdego rozcieńczenia badanego leku lub próbki standardowej. Dodać 125 µl buforu do rozcieńczania i 25 µl ekaryny do każdej studzienki i inkubować w temperaturze (37±0,5)°C przez 2 minuty. Po czasie inkubacji do każdego dołka dodaje się 25 µl substratu czynnika chromogennego IIa.

A/min).

Jeżeli ciągły pomiar absorbancji nie jest możliwy, należy określić absorbancję przy 405 nm w kolejnych odstępach czasu (np. 40 s) i wykreślić absorbancję w funkcji czasu i obliczyć ∆ AA

1. Test na nieobecność trombiny

Do badania przygotować roztwór leku przygotowanego zgodnie z instrukcją. Jeżeli w preparacie występuje heparyna, należy ją zneutralizować poprzez dodanie siarczanu protaminy w ilości 10 µg siarczanu protaminy na 1 IU heparyny.

Przygotowanie roztworu fibrynogenu

0,3 g fibrynogenu rozpuszcza się w 100 ml, miesza i trzyma przez 15–20 minut w temperaturze pokojowej.

Roztwór ma trwałość 1 miesiąc w temperaturze od 2 do 8°C.

Przygotowanie roztworu trombiny

Liofilizat rozpuszcza się zgodnie z instrukcją producenta, przechowuje przez 15–20 minut w temperaturze pokojowej i rozcieńcza 0,9% roztworem chlorku sodu do zawartości trombiny 1 j.m./ml.

Roztwór ma trwałość 6 miesięcy w temperaturze minus 20°C. Po rozmrożeniu roztworu nie można ponownie zamrozić.

Postęp determinacji

Do 2 probówek dodaje się równe objętości odtworzonego leku i roztworu fibrynogenu. Do trzeciej probówki (próbka kontrolna) dodaje się równe objętości roztworu trombiny i roztworu fibrynogenu i miesza się zawartość probówek ruchami obrotowymi. Jedną probówkę z rekonstytuowanym lekiem inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 godzin, drugą probówkę z rekonstytuowanym lekiem inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny i stwierdza się obecność lub brak koagulacji (skrzepu).

Próbkę kontrolną inkubuje się w łaźni wodnej w temperaturze 37°C i odnotowuje się czas powstania skrzepu.

Kryterium akceptacji wyników jest koagulacja w próbce kontrolnej po 30 s.

CzynnikVII

1. Metoda krzepnięcia

Oznaczanie aktywności czynnika VII przeprowadza się przy użyciu ludzkiego osocza z niedoborem czynnik VII. Proces krzepnięcia aktywuje się poprzez dodanie tromboplastyny ​​do mieszaniny wapnia.

Do rozcieńczenia wzorca i leków należy zastosować bufor NaCl-imidazol pH 7,3 z dodatkiem 0,1% roztworu albuminy ludzkiej lub bydlęcej. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń wzorca próbki czynnika VII w zakresie od 0,3 do 1 IU/ml. Lek rozcieńcza się do stężenia mniejszego niż 1 j.m./ml. Przeanalizuj 3 rozcieńczenia leku. Dla każdej próbki pomiary czasu krzepnięcia przeprowadza się co najmniej 2 razy. Pomiar przeprowadza się bezpośrednio po rozcieńczeniu leku.

Analizę przeprowadza się w temperaturze (37±0,5)°C. Do plastikowej probówki dodać 50 µl osocza z niedoborem czynnika VII i 50 µl rozcieńczenia wzorca lub leku. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze (37±0,5)°C przez 120–240 s. Czas krzepnięcia określa się od momentu dodania do mieszaniny 200 µl tromboplastyny ​​wapniowej podgrzanej do temperatury (37 ± 0,5)°C. W zależności od techniki analizy objętości odczynników mogą różnić się w odpowiednich proporcjach.

Wykres kalibracji jest wykreślany we współrzędnych półlogarytmicznych. Logarytmiczna oś odciętych pokazuje wartości aktywności czynnika VII, a oś rzędnych pokazuje czas krzepnięcia odpowiednich rozcieńczeń standardowych. Aktywność czynnika VII dla każdego rozcieńczenia próbki badanej określa się na wykresie kalibracyjnym. Aktywność FVII ( A) w badanej próbie oblicza się ze wzoru:

- aktywność odpowiedniego rozcieńczenia próbki badawczej, stwierdzona na wykresie kalibracyjnym;

k— rozcieńczenie próbki do badania.

1. Metoda chromogenna

W obecności czynnika tkankowego (TF) i jonów Ca 2+ aktywowany jest czynnik VII (tworzenie FVIIa). Kompleks FVIIa, TF, Ca 2+ i fosfolipidów aktywuje czynnik X. Aktywowany czynnik X (FXa) selektywnie rozszczepia chromogenny substrat FXa-1 metoksykarbonylo-D-cykloheksyloalanylo-glicylo-L-arginina- N- tworzy się octan nitroanilidu P-nitroanilina. Próbkę bada się metodą fotometryczną przy długości fali 405 nm. Wartość absorbancji (lub wzrost absorbancji) jest proporcjonalna do ilości czynnika VII.

Oznaczanie czynnika VII metodą chromogenną przeprowadza się za pomocą specjalnych zestawów testowych. Analizę przeprowadza się zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Próbkę wzorcową i preparat wstępnie rozcieńcza się osoczem z niedoborem czynnika VII do stężenia ~1 IU/ml (rozcieńczenie podstawowe). Z rozcieńczenia głównego sporządza się 3 rozcieńczenia próbki wzorcowej i 3 rozcieńczenia leku buforem Tris-sól pH 7,3 - 8,0 z dodatkiem 0,1% albuminy ludzkiej lub bydlęcej, stosując roztwór buforowy. Każde rozcieńczenie próbki wzorcowej oznacza się dwukrotnie, a uzyskane wartości służą do skonstruowania wykresu kalibracyjnego. Próbki do badań oznacza się trzykrotnie.

Do studzienek mikropłytki dodaje się rozcieńczenia badanego leku lub próbkę wzorcową, dodaje mieszaninę wapnia i tromboplastyny ​​oraz roztwór czynnika X i inkubuje w temperaturze (37 ± 0,5) °C przez 2 do 5 minut, po czym dodaje się roztwór substratu czynnika chromogennego Xa.

Zmierzyć zmianę gęstości optycznej przy długości fali 405 nm w trybie kinetycznym lub przerwać reakcję hydrolizy po 3-15 minutach przez dodanie 20% (v/v) roztworu lodowatego kwasu octowego i zmierzyć gęstość optyczną.

CzynnikVIII

1. Metoda krzepnięcia

Oznaczanie aktywności czynnika VIII przeprowadza się przy użyciu ludzkiego osocza z niedoborem czynnika VIII. Źródłem fosfolipidów niezbędnych do koagulacji jest odczynnik APTT.

Do rozcieńczenia wzorca i leków należy zastosować roztwór buforowy NaCl-imidazol o pH (7,3 ± 0,1) z dodatkiem 0,1% roztworu albuminy ludzkiej lub bydlęcej. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń wzorca, zaczynając od stężenia 2 IU/ml. Lek rozcieńcza się do stężenia ~0,5 – 2 IU/ml. Przeanalizuj 3 rozcieńczenia leku. Dla każdej próbki pomiary czasu krzepnięcia przeprowadza się co najmniej 2 razy. Pomiar przeprowadza się w ciągu 1 godziny po rozcieńczeniu leku.

Analizę przeprowadza się w temperaturze (37±0,5)°C. Dodać 100 µl osocza z niedoborem czynnika VIII, 100 µl rozcieńczenia wzorca lub leku i 100 µl odczynnika APTT do plastikowej probówki i inkubować w temperaturze (37±0,5)°C przez 2 minuty. Czas koagulacji rejestruje się od momentu dodania do mieszaniny 100 µl 0,025 M roztworu chlorku wapnia podgrzanego do temperatury (37 ± 0,5)°C. W zależności od techniki analizy objętości odczynników mogą różnić się w odpowiednich proporcjach.

Wykres kalibracji jest wykreślany we współrzędnych półlogarytmicznych. Wartości aktywności czynnika VIII wykreślono wzdłuż logarytmicznej osi odciętych, a czas krzepnięcia odpowiednich rozcieńczeń wzorca wykreślono wzdłuż osi rzędnych. Aktywność czynnika VIII dla każdego rozcieńczenia próbki badanej określa się na wykresie kalibracyjnym. Aktywność FVIII ( A) w badanej próbie oblicza się ze wzoru:

— aktywność odpowiedniego rozcieńczenia badanego leku, określona na podstawie krzywej kalibracyjnej;

k— rozcieńczenie próbki do badania.

1. Metoda chromogenna

Ilościowe oznaczenie czynnika VIII przeprowadza się za pomocą zestawu odczynników, w którym czynnik VIII jest kofaktorem czynnika IXa podczas aktywacji czynnika X do postaci Xa, która rozszczepia chromogenny substrat.

Zasada metody

W obecności jonów Ca 2+ i fosfolipidów czynnik X jest aktywowany w Xa pod wpływem czynnika IXa. Przy nadmiarze czynnika X i optymalnych ilościach Ca 2+, fosfolipidów i czynnika IXa, szybkość aktywacji czynnika X zależy liniowo od ilości czynnika VIII. Czynnik Xa hydrolizuje chromogenny substrat S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) w celu uwolnienia chromogennej grupy pNA, której kolor rejestruje się spektrofotometrycznie przy 405 nm. Ilość wytworzonego czynnika Xa, a tym samym intensywność barwienia, jest proporcjonalna do aktywności czynnika VIII w próbce.

Zestaw odczynników do oznaczania aktywności czynnika VIII zachowuje stabilność przez okres określony przez producenta w temperaturze przechowywania od 2 do 8 o C.

Zestaw odczynników zawiera:

1. 7,7 mg chromogenu S-2765 z dodatkiem syntetycznego inhibitora trombiny I-2581. Odczynnik rozpuszcza się w 6,0 ml sterylnej wody do wstrzykiwań. Roztwór po rekonstytucji zachowuje trwałość przez 1 miesiąc w temperaturze od 2 do 8°C. Przed użyciem podgrzać do 37°C.
2. Odczynnik czynnika bydlęcego: 0,3 U czynnika IX, 2,7 IU czynnika X i 1 NIH U trombiny, liofilizowanej w obecności 40 mmol CaCl 2 i 0,2 mmol fosfolipidów. Odczynnik rozpuszcza się w 2,0 ml sterylnej wody do wstrzykiwań. Przygotowany roztwór jest stabilny przez 12 godzin w temperaturze od 2 do 8 o C, 2 tygodnie w temperaturze minus 30 o C i 1 miesiąc w temperaturze minus 80 o C. Nie należy go przechowywać w temperaturze minus 20 o C. o C. Przed użyciem podgrzać do temperatury 37°C.
3. Koncentrat ×10 buforu Tris. Stabilny przez 1 miesiąc w temperaturach od 2 do 8°C. Przed użyciem rozcieńczyć sterylną wodą do wstrzykiwań w stosunku 1:10.

Dodatkowe odczynniki:

1. Międzynarodowym standardem odniesienia jest roztwór koncentratu ludzkiego czynnika VIII (NIBSC, Eur.Pharm.Ref.Std. BRP H 0920000) lub osocze skalibrowane zgodnie z międzynarodowym standardem czynnika VIII.
2. Kontroluj normalne lub patologiczne osocze skalibrowane zgodnie z międzynarodowym standardem czynnika VIII.
3. 0,9% roztwór chlorku sodu.
4. 20% kwas octowy lub 2% kwas cytrynowy (stosowane w technice punktu końcowego akumulacji chromogenu).
5. Woda laboratoryjna dejonizowana

Sprzęt:

1. Probówki z tworzyw sztucznych;
2. Mikropłytki;
3. Termostat 37 o C;
4. Spektrofotometr 405 nm lub czytnik mikropłytek 405 nm;
5. Kalibrowane pipety;
6. Wir;
7. Stoper.

Przed oznaczeniem próbkę testową rozcieńcza się do oczekiwanej aktywności 1 IU/ml.

Oznaczenie można przeprowadzić w trybie kinetycznym i do punktu końcowego, w probówkach (metoda makro) i na mikropłytkach (metoda mikro).

Kalibrowanie

Podczas każdego oznaczenia tworzona jest krzywa kalibracji. Rozcieńczenie próbki standardowej przygotowywane jest w 2 etapach: wstępne rozcieńczenie do aktywności 1–2 IU/ml i końcowe rozcieńczenia w celu skonstruowania zależności kalibracyjnej w zakresie 0–2 IU/ml. Po rozcieńczeniu oznaczenie należy przeprowadzić w ciągu 30 minut.

Postęp determinacji

Oznaczanie w probówkach

Do probówek dodaje się 200 µl rozcieńczonego wzorca, próbki kontrolnej lub badanej, inkubuje 3-4 minuty w temperaturze 37 o C, dodaje się 50 µl podgrzanego odczynnika faktorowego, inkubuje 2-4 minuty w temperaturze temperaturze 37 o C i dodaje się 50 µl roztworu chromogenu.

Oznaczanie w mikropłytkach

Do dołków mikropłytki dodać 50 µl rozcieńczonego wzorca, próbki kontrolnej lub badanej, inkubować 3-4 minuty w temperaturze 37°C, dodać 50 µl podgrzanego odczynnika czynnikowego, inkubować 2-4 minuty w temperaturze 37°C i dodać 50 µl roztworu chromogenu.

Kinetyczna metoda oznaczania

Po dodaniu roztworu chromogenu na 2–10 minut zmierzyć zmianę gęstości optycznej roztworu przy 405 nm.

Definicja według punktu końcowego

Po dodaniu roztworu chromogenu mieszaninę inkubuje się dalej w temperaturze 37 o C przez 2 - 10 minut, po czym dodaje się 50 µl 20% kwasu octowego lub 2% kwasu octowego w celu zatrzymania reakcji. kwas cytrynowy. Zmierzyć gęstość optyczną roztworu względem buforu przy 405 nm.

Obliczenia

Wykreśl zależność zmiany gęstości optycznej na minutę (dla metody kinetycznej) lub gęstości optycznej (dla określenia punktu końcowego) rozcieńczeń roztworu wzorcowego od stężenia w nich czynnika VIII. Aktywność w badanej próbce określa się za pomocą krzywej kalibracyjnej, uwzględniając wstępne rozcieńczenie próbki.

CzynnikIX

1. Metoda krzepnięcia

Oznaczanie aktywności czynnika IX przeprowadza się przy użyciu ludzkiego osocza z niedoborem czynnika IX. Źródłem fosfolipidów niezbędnych do koagulacji jest odczynnik APTT.

Do rozcieńczenia wzorca i leków należy zastosować bufor NaCl-imidazol pH 7,3 z dodatkiem 0,1% roztworu albuminy wołowej lub ludzkiej. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń wzorca w zakresie od 0,3 do 1 IU/ml. Lek rozcieńcza się do stężenia mniejszego niż 1 j.m./ml. Przeanalizuj 3 rozcieńczenia leku. Dla każdej próbki pomiary czasu krzepnięcia przeprowadza się co najmniej 2 razy. Pomiar przeprowadza się w ciągu 1 godziny po rozcieńczeniu leku.

Analizę przeprowadza się w temperaturze (37±0,5)°C. Dodać 100 µl osocza z niedoborem czynnika IX, 100 µl rozcieńczenia wzorca lub leku i 100 µl odczynnika APTT do plastikowej probówki i inkubować w temperaturze (37±0,5)°C przez 2 minuty. Czas koagulacji rejestruje się od momentu dodania do mieszaniny 100 µl 0,025 M roztworu chlorku wapnia podgrzanego do temperatury (37 ± 0,5)°C. W zależności od techniki analizy objętości odczynników mogą różnić się w odpowiednich proporcjach.

Wykres kalibracji jest wykreślany we współrzędnych półlogarytmicznych. Logarytmiczna oś odciętych pokazuje wartości aktywności czynnika IX, a oś rzędnych pokazuje czas krzepnięcia odpowiednich rozcieńczeń standardowych. Aktywność czynnika IX dla każdego rozcieńczenia próbki badanej określa się na wykresie kalibracyjnym. NAPRAWA działania ( A) w badanej próbie oblicza się ze wzoru:

- aktywność odpowiedniego rozcieńczenia próbki badawczej, stwierdzona na wykresie kalibracyjnym;

k— rozcieńczenie próbki do badania.

CzynnikX

1. Metoda krzepnięcia

Oznaczanie aktywności czynnika X przeprowadza się w osoczu ludzkim z niedoborem czynnika X. Proces krzepnięcia aktywuje się poprzez dodanie tromboplastyny ​​do mieszaniny wapnia.

Do rozcieńczenia wzorca i leków należy zastosować roztwór buforowy NaCl-imidazol o pH 7,3 z dodatkiem 0,1% roztworu albuminy ludzkiej lub bydlęcej. Aby sporządzić krzywą kalibracyjną, należy przygotować serię seryjnych rozcieńczeń wzorca czynnika X w zakresie od 0,3 do 1 IU/ml. Lek rozcieńcza się do stężenia mniejszego niż 1 j.m./ml. Przeanalizuj 3 rozcieńczenia leku. Dla każdej próbki pomiary czasu krzepnięcia przeprowadza się co najmniej 2 razy. Pomiar przeprowadza się bezpośrednio po rozcieńczeniu leku.

Analizę przeprowadza się w temperaturze (37±0,5)°C. Do plastikowej probówki dodać 50 µl osocza z niedoborem czynnika X i 50 µl rozcieńczenia standardu lub leku. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze (37±0,5)°C przez 120–240 s. Czas krzepnięcia określa się od momentu dodania do mieszaniny 200 µl tromboplastyny ​​wapniowej podgrzanej do temperatury (37 ± 0,5)°C. W zależności od techniki analizy objętości odczynników mogą różnić się w odpowiednich proporcjach.

Wykres kalibracji jest wykreślany we współrzędnych półlogarytmicznych. Logarytmiczna oś odciętych pokazuje wartości aktywności czynnika X , wzdłuż osi y jest czasem krzepnięcia odpowiednich rozcieńczeń wzorca. Aktywność czynnika X dla każdego rozcieńczenia próbki testowej można znaleźć na wykresie kalibracji. Aktywność czynnika X ( A) w badanej próbie oblicza się ze wzoru:

- aktywność odpowiedniego rozcieńczenia próbki badawczej, stwierdzona na wykresie kalibracyjnym;

k— rozcieńczenie próbki do badania.

1. Metoda chromogenna

Czynnik X jest aktywowany za pomocą pochodnej jad węża Aktywator FX. Aktywowany czynnik X (FXa) selektywnie rozszczepia chromogenny substrat FXa-1 Dichlorowodorek N-α-benzyloksykarbonylo-D-arginilo-L-glicylo-L-arginino-4-nitroanilidu, N-benzoilo-L-izoleucylo-L-glutamylo-glicylu - Chlorowodorek L-arginino-4-nitroanilidu, octan metanosulfonylo-D-leucylo-glicylo-L-arginino-4-nitroanilidu, metoksykarbonylo-D-cykloheksylalanylo-glicylo-L-arginino-4-nitroanilid do utworzenia P-nitroanilina. Próbki bada się fotometrycznie przy 405 nm. Ilość czynnika X jest proporcjonalna do wzrostu gęstości optycznej roztworu.

Oznaczanie czynnika X metodą chromogenną przeprowadza się za pomocą specjalnych zestawów testowych. Analizę przeprowadza się zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Próbkę standardową i preparat wstępnie rozcieńcza się osoczem z niedoborem czynnika X do stężenia ~1 IU/ml (rozcieńczenie podstawowe). Z rozcieńczenia głównego przygotowuje się 3 rozcieńczenia próbki wzorcowej (zgodnie z instrukcją) i 3 rozcieńczenia leku stosując roztwór buforowy. Każde rozcieńczenie próbki wzorcowej oznacza się dwukrotnie, a uzyskane wartości służą do skonstruowania wykresu kalibracyjnego. Próbki do badań oznacza się trzykrotnie.

Badania przeprowadza się ręcznie przy użyciu probówek plastikowych lub mikropłytek w temperaturze (37±0,5)°C lub automatycznie przy użyciu koagulometru.

W celu przeprowadzenia testu ręcznego do dołków mikropłytki dodaje się 12,5 µl każdego rozcieńczenia badanego leku lub próbki wzorcowej, do każdego dołka dodaje się 25 µl specyficznego aktywatora czynnika X z jadu żmii Russella i inkubuje w temperaturze (37°C) ± 0,5)°C przez 90 s, po czym do każdego dołka dodaje się 150 µl roboczego rozcieńczenia substratu czynnika chromogennego X.

Wyznaczyć szybkość zmiany gęstości optycznej przy długości fali 405 nm w sposób ciągły przez 3 minuty i obliczyć średnią szybkość zmiany gęstości optycznej (∆ A/min) lub zmierzyć absorbancję przy długości fali 405 nm w kolejnych odstępach czasu (na przykład po 30 s), wykreślić absorbancję w funkcji czasu i obliczyć ∆ A/min jako kąt nachylenia linii prostej. Z wartości ∆ A/min każdego indywidualnego rozcieńczenia próbki standardowej i leku testowego, oblicza się aktywność leku testowego.

czynnik von Willebranda

Oznaczanie aktywności czynnika von Willebranda przeprowadza się za pomocą aglutynacji lub testu immunologicznego enzymatycznego.

Aktywność czynnika von Willebranda określa się poprzez porównanie jego aktywności z aktywnością próbki wzorcowej.

Metoda aglutynacji

Metoda polega na oznaczaniu aktywności koenzymowej czynnika von Willebranda podczas aglutynacji zawiesiny płytek krwi w obecności rystocetyny A.

Test można przeprowadzić ilościowo przy użyciu zautomatyzowanego sprzętu lub półilościowo, oceniając wizualnie aglutynację w serii rozcieńczeń.

Metoda półilościowa

Z próbki wzorcowej i roztworu leku po rekonstytucji przygotowuje się kolejne rozcieńczenia w 0,9% roztworze chlorku sodu z 1–5% roztworem albuminy ludzkiej do oczekiwanej zawartości czynnika von Willebranda wynoszącej 0,5, 1,0 i 2,0 IU/ml. 0,05 ml każdego rozcieńczenia próbki wzorcowej i badanego leku nanosi się na szkiełko, dodaje 0,1 ml zawiesiny płytek krwi z rystocetyną i miesza przez 1 minutę. Roztwór rozcieńczający stosuje się jako kontrolę ujemną. Po 1 minucie inkubacji w temperaturze pokojowej ocenia się wizualnie aglutynację płytek krwi. Maksymalne rozcieńczenie, przy którym zachodzi aglutynacja płytek krwi, to miano aktywności koenzymu rystocetyny w próbce.

Metoda ilościowa

Przygotować co najmniej 2 serie seryjnych rozcieńczeń wzorca i próbki do badań przy użyciu buforu do rozcieńczeń do oczekiwanej zawartości VWF 0,5, 1,0 i 2,0 IU/ml.

Oznaczanie przeprowadza się zgodnie z instrukcjami producenta zautomatyzowanego sprzętu. Otrzymuje się zależność zmiany absorpcji optycznej (stopnia zmętnienia roztworu) od aktywności czynnika von Willebranda.

Oznaczenie zawartości czynnika von Willebranda w preparacie testowym przeprowadza się za pomocą współczynników równania liniowego zależności gęstości optycznej roztworu od zawartości czynnika von Willebranda w próbce wzorcowej.

Metoda immunoenzymatyczna

Metoda polega na określeniu aktywności czynnika von Willebranda wiążącego kolagen. Gdy VWF specyficznie wiąże się z włókienkami kolagenowymi, a następnie wiąże się poliklonalne przeciwciała przeciwko VWF skoniugowane z enzymem po dodaniu chromogennego substratu, tworzy się chromofor, który można określić ilościowo spektrofotometrycznie. Istnieje zależność liniowa pomiędzy wiązaniem kolagenu z czynnikiem von Willebranda a gęstością optyczną.

Oznaczenie przeprowadza się za pomocą systemów testowych dopuszczonych do stosowania w rosyjskiej praktyce służby zdrowia zgodnie z instrukcją użytkowania.

Do badania należy przygotować co najmniej 3 seryjne rozcieńczenia wzorca i próbki do badania przy użyciu buforu do rozcieńczeń do oczekiwanej zawartości czynnika von Willebranda wynoszącej 1,0 IU/ml. Następnie przeprowadzane są badania zgodnie z instrukcją producenta zastosowanego układu badawczego.

Aktywowane czynniki krzepnięcia krew

Oznaczenie przeprowadza się metodą koagulometryczną.

Do badania przygotowuje się odtworzony roztwór leku. Jeżeli w preparacie występuje heparyna, należy ją zneutralizować poprzez dodanie siarczanu protaminy w ilości 10 µg siarczanu protaminy na 1 IU heparyny. Przygotować rozcieńczenia leku 1:10 i 1:100 stosując roztwór buforowany Tris o pH 7,5.

Do 3 probówek dodaje się 0,1 ml wzorcowego osocza ludzkiego i 0,1 ml roztworu fosfolipidów, umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze (37±0,5)°C na 60 s, po czym do pierwszej probówki dodaje się 0,1 ml Roztwór buforu Tris (próbka kontrolna), do drugiej - 0,1 ml badanego leku w rozcieńczeniu 1:10, do trzeciej probówki - 0,1 ml badanego leku w rozcieńczeniu 1:100. Następnie do zawartości każdej probówki natychmiast dodaje się 0,1 ml roztworu chlorku wapnia o stężeniu 3,7 g/l podgrzanego do temperatury 37 o C. Odnotowuje się czas powstania skrzepu od momentu dodania roztworu chlorku wapnia.

Kryterium akceptacji wyników jest czas koagulacji w próbce kontrolnej w zakresie od 200 do 350 s.

Konkretna, konkretna czynność

Aktywność właściwą czynników krzepnięcia oblicza się ze wzoru:

Oznaczanie aktywności antytrombinyIII

Metoda chromogenna

Metoda oznaczania aktywności ATIII opiera się na jego zdolności do neutralizacji trombiny w obecności heparyny. Do próbki zawierającej ATIII dodaje się nadmiar heparyny i trombiny. Powstały kompleks ATIII-heparyna neutralizuje ilość trombiny proporcjonalną do ilości ATIII. Pozostała trombina selektywnie rozszczepia chromogenny substrat, tworząc P-nitroanilina, której absorpcję określa się przy 405 nm. Zatem ilość ATIII jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wolnej absorpcji P-nitroanilina w próbce.

Oznaczanie aktywności ATIII przeprowadza się przy użyciu dostępnych na rynku systemów testowych. Do skonstruowania krzywej kalibracyjnej należy użyć próbki standardowej ATIII lub kalibratora plazmowego certyfikowanego zgodnie z normą międzynarodową. Standardową próbkę lub kalibrator plazmy rozpuszcza się w wodzie destylowanej zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcjach. Zależność gęstości optycznej od aktywności ATIII jest liniowa w zakresie aktywności ATIII od 0,1 do 1,0 IU/ml. Używając buforu heparyny, przygotować 4 rozcieńczenia standardowej próbki lub osocza kalibracyjnego o aktywności ATIII od 0,1 do 1,0 IU/ml. Analizę przeprowadza się w temperaturze 37°C według schematu podanego w instrukcji zestawu. Dla każdego rozcieńczenia wyznacza się trzykrotnie wartość gęstości optycznej przy 405 nm i konstruuje się wykres kalibracyjny zależności absorbancji od aktywności ATIII we współrzędnych liniowych.

Przygotuj 2 rozcieńczenia próbki testowej o przybliżonej aktywności ATIII mniejszej niż 1,0 IU/ml. Oznaczanie aktywności ATIII w badanych próbkach przeprowadza się w temperaturze 37°C zgodnie z instrukcją zawartą w instrukcji zestawu. Aktywność ATIII w testowanych rozcieńczeniach określa się z krzywej kalibracyjnej. Aktywność ATIII w próbce testowej określa się jako:

X– aktywność ATIII w odpowiednim rozcieńczeniu;

k– rozcieńczenie próbki.

Ilościowe oznaczanie heparyny

1. Metoda krzepnięcia

Metoda opiera się na zdolności heparyny do wydłużania czasu krzepnięcia prawidłowego osocza poprzez hamowanie szeregu czynników.

Do przeprowadzenia analizy wykorzystuje się normalne osocze ludzkie, standardową próbkę heparyny, odczynnik PTT i 0,025 M roztwór chlorku wapnia. Jako rozcieńczalnik próbek wzorcowych i testowych stosuje się 0,9% roztwór chlorku sodu. Standardową próbkę heparyny rozpuszcza się w wodzie destylowanej zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji. Przygotuj 3 rozcieńczenia próbki standardowej o aktywności heparyny 0,3, 0,4 i 0,5 IU/ml. Próbki standardowe o tych aktywnościach powinny wydłużać czas krzepnięcia normalnego osocza co najmniej 1,5 razy, w przeciwnym razie należy stosować rozcieńczenia o większej aktywności heparyny. Równolegle przygotowuje się 3 rozcieńczenia próbki do badania, tak aby przybliżona aktywność heparyny w tych rozcieńczeniach mieściła się w zakresie aktywności heparyny w rozcieńczeniach próbki wzorcowej.

Analizę przeprowadza się za pomocą automatycznego lub półautomatycznego koagulometru w rurkach z tworzywa sztucznego w temperaturze 37°C. Do probówki dodać 100 µl normalnego osocza ludzkiego, 100 µl rozcieńczenia próbki wzorcowej lub testowej lub 100 µl 0,9% roztworu chlorku sodu (doświadczenie ślepe), dodać 100 µl odczynnika APTT i inkubować mieszaninę przez 120–240 s w temperaturze ( 37±0,1)°С. Następnie do probówki dodaje się 100 µl 0,025 M roztworu chlorku wapnia podgrzanego do temperatury 37°C i rejestruje czas krzepnięcia próbki. W zależności od techniki analizy objętości odczynników można zmieniać zgodnie z proporcjami. Czas krzepnięcia normalnego osocza (doświadczenie ślepe) powinien wynosić 25 – 40 s. Dla każdego rozcieńczenia próbki wzorcowej i badanej czas krzepnięcia określa się trzykrotnie.

1. Metoda chromogenna

Metoda opiera się na rozszczepieniu chromogennego substratu specyficznego dla aktywowanego czynnika X (FXa). Po dodaniu do próbki zawierającej heparynę, nadmiarowe ilości ATIII i FXa hamują ilość FXa proporcjonalnie do ilości heparyny. Pozostały FXa jest odszczepiany od specyficznego chromogennego substratu P-nitroanilina, której absorpcję określa się przy 405 nm. Zatem wielkość wchłaniania jest odwrotnie proporcjonalna do ilości heparyny. Metodą tą określa się zawartość heparyny niefrakcjonowanej i drobnocząsteczkowej w jednostkach anty-Xa.

Ilość heparyny oznacza się metodą chromogenną z wykorzystaniem dostępnych na rynku systemów testowych. Do sporządzenia wykresu kalibracyjnego należy użyć standardowej próbki heparyny lub kalibratora osocza certyfikowanego zgodnie z międzynarodowym standardem. Próbkę standardową lub kalibrator plazmy rozcieńcza się w wodzie destylowanej zgodnie z instrukcją. Przygotować 4 rozcieńczenia próbki standardowej o stężeniu heparyny mniejszym niż 1 jednostka anty-Xa/ml, stosując bufor do rozcieńczeń o pH 8,4. Analizę przeprowadza się w temperaturze 37°C zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Dla każdego rozcieńczenia trzykrotnie określa się absorbancję przy 405 nm, po czym konstruuje się wykres kalibracyjny zależności wartości absorbancji od stężenia heparyny we współrzędnych liniowych. Zależność jest liniowa w zakresie stężeń heparyny 0 – 1,0 jednostek anty-Xa/ml.

Dla próbki testowej przygotować 2 rozcieńczenia o stężeniu heparyny mniejszym niż 1 jednostka anty-Xa/ml. Analizę przeprowadza się zgodnie z instrukcją zestawu w temperaturze 37°C. Dla każdego rozcieńczenia wartość absorpcji określa się trzykrotnie.

Oznaczenie przeprowadza się ręcznie za pomocą probówek plastikowych, mikropłytek lub automatycznie za pomocą koagulometru.

W celu przeprowadzenia testu ręcznego do dołków mikropłytki dodaje się 20 µl standardowego osocza ludzkiego i 20 µl roztworu antytrombiny III. Następnie do tych dołków dodaje się odpowiednio 20, 60, 100 i 140 µl leku testowego lub standardowego i objętość roztworu w każdym dołku doprowadza się do 200 µl buforem (aktywność heparyny w końcowej mieszaninie reakcyjnej wynosi 0,02 - 0,08 j.m./ml).

40 µl z każdego dołka płytki przenosi się do drugiej serii dołków, do których dodaje się 20 µl roztworu bydlęcego czynnika Xa i inkubuje w temperaturze (37 ± 0,5)°C przez 30 s, po czym dodaje się 40 µl roztwór dodaje się do dołków chromogennego substratu czynnika Xa i inkubuje ponownie w temperaturze (37 ± 0,5) °C przez 3 – 15 min, mierząc szybkość rozszczepiania substratu poprzez ciągły pomiar gęstości optycznej przy długości fali 405 nm (kinetyczna tryb) lub po zatrzymaniu reakcji poprzez dodanie 20% (v/v) lodowatego roztworu kwasu octowego (punkt końcowy oznaczenia).

Prowadząc badania w trybie automatycznym za pomocą koagulometru, uzyskuje się zależność zmiany gęstości optycznej od stężenia heparyny.